Os autores agradecem ao Dr. Yangyang Yan no laboratório do Dr. Fred Sigworth na Universidade de Yale para a generosa doação de células HEK293 expressando estavelmente rato proteína Slack-B. Além disso, os autores agradecem ao Dr. Sigworth para crio-microscopia eletrônica de modelo de homologia de Slack exibido na introdução de vídeo. Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH Grants DH067517 e NS073943 para LKK

1. Cultura de Células (Adaptado de Fleming e Kaczmarek 18) <ol><li> Células de cultura em mídia apropriada para maior do que 2, mas menos de 10 passagens antes do uso neste ensaio. Não transfectadas células HEK-293 e células HEK-293 expressando estavelmente a proteína de rato Slack-B foram cultivadas em meio de Eagle uma metade de Dulbecco Modificado e metade meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado calor e antibióticos. 500 ug / ml de geneticina (G418) é adicionado a células HEK-293 que expressam estavelmente Slack-B para seleccionar para a expressão do canal de folga. Células de passagem em confluência de 70-90% por dissociação a partir de pratos com uma solução de tripsina-EDTA a 0,25%. </li></ol> 2. Matriz Extracelular (ECM) de revestimento do TiO 2 placa de 384 poços biosensor óptico com fibronectina e ovalbumina <ol><li> Preparação da mistura de fibronectina ECM e solução de bloqueio ovalbumina <ol><li> Prepare uma solução de trabalho de fibronectem salina tamponada com fosfato (PBS) com uma concentração final de 5 ug / ml de fibronectina em 20,0 ml de PBS. A partir de uma concentração de estoque de 1,0 mg / ml, adicionar 100 ul de 20,0 ml de PBS por uma diluição de 200 vezes. A solução de trabalho de fibronectina podem ser divididos em alíquotas e armazenado a -20 ° C após a preparação. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de 5% de ovalbumina inactivado pelo calor em água estéril. Diluir ovalbumina em cultura de tecido, grau de água estéril para uma solução a 5% e aquece-inactivar durante 30 min a 60 ° C. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente e a filtração estéril da solução. Alíquota da solução de ovalbumina 5% e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar uma solução de trabalho de 2% de ovalbumina diluindo a solução de reserva de 5% em PBS. Por exemplo, adicionar 12,0 mL de uma solução de estoque de ovalbumina a 5% para 18,0 ml de PBS para um volume final de 30,0 ml. </li></ol></li><li> 384 poços da placa de revestimento do biosensor óptico <ol><li> Hidratar a placa de TiO 2 com 20,0 ul / poçocultura de tecidos de água de grau de estéril para 15 min. Os seguintes passos devem ser realizados com um pipetador de 16 canais. </li><li> Lavar 1x placa com 50,0 ul de PBS por poço. </li><li> Adicionar 20.0 ul da solução de trabalho de fibronectina a cada poço e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente, para criar a ECM. </li><li> Lavar 1x placa com 50,0 ul de PBS por poço. </li><li> Adicionar 40.0 ul da solução de trabalho de ovalbumina a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C para bloquear a placa. </li><li> Lavar 3x placa com 50,0 ul de PBS por poço. Placas revestidas de ECM podem ser armazenadas a 4 ° C durante até 48 horas. </li></ol></li></ol> 3. Sementeira de Células para a 384 poços Biosensor placa óptica <ol><li> Remover o meio de crescimento a partir das células e adicionar tripsina para desalojar as células da placa. Recolha das células e centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Remova a mídia de tripsina e Ressuspender as células em meio de cultura. </li><li> Usando um hemocitómetro ou um automatizadocontador de células para determinar a concentração das células. </li><li> Para minimizar os efeitos da evaporação durante a incubação, 50,0 mL de meio de crescimento por poço vai ser usado. As células devem ser diluído para atingir o número desejado de células por poço num volume de 50,0 ul de meio de crescimento. Para estas experiências, 1000 células / poço foram semeadas em biossensor. </li><li> Permitir que as células semeadas a incubar durante a noite em meio de crescimento a 37 ° C sob ar / 5% de CO 2. </li></ol> 4. Preparação do biossensor e Compostas placas para o ensaio GRT Optical Biosensor <ol><li> Remova a placa do incubador e remover o meio de crescimento a partir das células. Lavar as células com 1x Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS). Adicionar 25.0 ul de HBSS a cada poço. </li><li> Colocar a placa de biossensor no scanner BIND e permitir que as células atinjam a temperatura ambiente durante 1-2 horas. </li><li> Prepare um prato composto separado do que ligantes de interesse será added à placa biossensor durante o ensaio. Para estes ensaios, 25,0 uL de uma solução contendo o composto foi adicionado a cada poço na placa de biossensor para um volume total de 50,0 mL. Como tal, os compostos em solução foram preparadas em 2x a concentração final desejada. </li></ol> 5. Realizar o ensaio GRT Optical Biosensor <ol><li> Dê uma medição de linha de base com o sistema de scanner para poços A1-P12 (metade da SBS placa de 384 poços) com uma resolução máxima de 3,75 mM / pixel para a central de 1,5 milímetro de cada poço usando o software BIND Scan. Essa verificação de linha de base terá cerca de 30 min. </li><li> Adicionar 25.0 ul de soluções de compostos em cada poço para poços A1-P12. </li><li> Dê uma medida de referência de poços A13-P24. </li><li> Adicionar 25.0 ul de soluções de compostos em cada poço para poços A13-P24. </li><li> Dê uma medição disso pós composto por poços A1-P12, e repita para poços A13-P24. </li></ol> 6. Análise de Dados de Ensaio com BIND Ver <ol><li> Abra os dados do ensaio BIND para a medição da linha de base no Windows, e clique no botão &quot;Grid Editor&quot; para habilitar a seleção de células. O software calcula métricas de interesse definidas pelo utilizador. </li><li> Abra o &quot;Plug-ins&quot;, que incluem o &quot;Finder celular&quot; e função &quot;Baseliner&quot;. Definir parâmetros em &quot;Finder celular&quot; para que as células se distinguem do fundo do biossensor. </li><li> Exportar o arquivo de mapa de células que contém os dados &quot;Finder celular&quot; para a medição da linha de base. </li><li> Repita os passos de 6,1-6,2 para postar dados de adição de composto. </li><li> Abra o &quot;Baseliner&quot; plug-in e importar o mapa de células a partir da medição da linha de base. O software irá calcular a mudança na VOP entre os dados de base e pós compostos. </li><li> Seleccionar &quot;Δ celular médio&quot; para a saída do deslocamento significativo em VOP para as células. Os dados podem ser exportados para o Microsoft ExcEL para posterior análise. </li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel.">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels.">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li><li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy.">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li><li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors.">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li><li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

Steven M. Shamah é um empregado de Biociências X-CORPO.

O principal Z (Z &#39;) é um factor de método estatístico comum para quantificar a qualidade de um ensaio de rastreio de alto rendimento de 20, e porque o rastreio de agonistas de GPCR neste ensaio ocorreram numa compatível ensaio de 384 cavidades SBS, proporciona uma excelente medida da robustez e validade deste ensaio 21. Valor AZ &#39;de 1 indica um ensaio teoricamente ideal, com um número infinito de pontos de dados com desvios padrão inexistentes. Valor AZ &#39;entre 0,5-1 é considerado...

Examinando as células vivas em seu contexto fisiologicamente relevante é crucial para entender as funções biológicas de alvos celulares. No entanto, os ensaios que examinam a interacção entre os canais e as proteínas citoplasmáticas de regulação, tais como ensaios de coimmunoprecipitation, geralmente fornecem pouca informação sobre o curso de tempo de interacções de células vivas. A maioria dos ensaios com base em células de corrente mede um evento celular específico, tal como a translocação de uma proteína de interesse fluorescente etiquetado. Estes ensaios requerem modificações das proteínas de interesse, o que pode, potencialmente, alteram o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo. Ensaios baseados em células não-invasiva, que não requerem a manipulação do sistema, proporcionam uma medição contínua da actividade celular e permitem estudos de células na sua mais fisiologicamente relevante estado 4. Biossensores ópticos são projetados para produziruma mudança mensurável em uma característica da luz, que é acoplada à superfície do sensor. Biossensores ópticos, que utilizam ondas evanescentes, que incluem ressonância de plasma de superfície (SPR) e comprimento de onda de ressonância grade () RWG técnicas, têm sido utilizados principalmente para detectar as afinidades e cinéticas de moléculas de ligação aos seus receptores biológicos imobilizadas na superfície do sensor. Mais recentemente, biossensores RWG comercialmente disponíveis foram desenvolvidas para permitir a detecção da mudança relativa da massa dentro da porção inferior de células aderentes à superfície do sensor em alta resolução espacial (até 3,75 mM / pixel) 5. Estes biossensores podem detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática de células vivas que resultam da estimulação, tal como a adesão de células e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação e as vias de sinalização induzidas por uma variedade de receptores de superfície celular, incluindo a proteína G Os receptores acoplados (GPCRs) 6 . Biossensores RWG detectar a relação change no índice de refracção como uma função da alteração relativa na massa a cerca de 150 nm do biossensor 7. Quando as células são plaqueadas para o biossensor, esta alteração no índice de refracção reflecte a variação da massa perto da membrana plasmática da célula, resultante de uma mudança na adesão celular para o biossensor. Este protocolo irá discutir a detecção de interações proteína-canal utilizando biossensores RWG. Sistemas de aquisição de dados RWG composto de vários componentes. Porque o X-CORPO Biociências BIND Scanner foi utilizada para estes experimentos, nos referiremos aos componentes para este sistema especial, que consiste em um leitor de placas, biossensores associados, software de aquisição de BIND Digitalizar e software BIND Ver análise 8. Os biossensores cristal fotónicas, referido daqui em diante como biossensores ópticos, são compostos de um arranjo periódico de um dieléctrico e o material em duas ou três dimensões, que impede a propagação da luz no específicacomprimentos de onda e as direcções. Estruturas de cristal fotônico são baseados em um fenômeno chamado de anomalia de Wood. Descoberto pela primeira vez por Wood em 1902, estas anomalias são efeitos observados no espectro de luz refletida por redes de difração óptica onde as variações bruscas de intensidade de determinadas ordens de difração ocorrem em determinadas faixas de freqüências estreitas. Em 1962, Hessel e Oliner apresentaram uma nova teoria de anomalias de madeira em que período finito grade gera um comprimento de onda de ressonância de pé 9. Nos biossensores ópticos descritos aqui, anomalias de madeira são utilizados para produzir um biossensor RWG que, quando estimuladas com luz branca reflecte apenas a banda estreita de comprimentos de onda (tipicamente entre 850-855 nm). Biossensores individuais consistem de um material plástico de baixo índice de refracção, com uma estrutura de superfície periódica que é revestida com uma fina camada do material de dióxido de titânio dieléctrica de refracção elevado (TiO 2). Quando os biosensou é iluminada com uma fonte de luz de comprimento de onda larga, a grade óptica de cristais fotónicas reflecte uma estreita gama de comprimentos de onda da luz que é medida por um espectrofotómetro no scanner BIND. O pico de intensidade dos comprimentos de onda reflectidos (Comprimento de onda de pico do valor, ou PWV) é então calculado a partir do sinal. O VOP de luz muda sobre uma alteração no índice de refracção, como resultado de um aumento ou diminuição da massa dentro da proximidade (~ 150 nm) da superfície do biossensor. Biossensores ópticos são incorporados numa Sociedade padrão de Ciências Biomolecular (SBS) de 384 poços de microplacas para os ensaios utilizados nestas experiências. Biossensores RWV são usadas para detectar alterações com a adição de sinais exógenos em células vivas 10. As células são cultivadas directamente sobre a superfície de um biossensor RWG e a mudança no índice de refracção do local é monitorado por meio de tratamento com estímulos específicos. A direção da mudança em massa no biosensor pode serdeterminada, porque o aumento do índice de refracção locais de resultados de um aumento da massa próximo do biossensor e é medido como um aumento na VOP. Inversamente, uma redução na massa produz uma diminuição na VOP. A mudança na VOP detectado pode ser resultado de vários eventos celulares, incluindo mudanças na adesão celular, proteínas de recrutamento / release, endocitose e reciclagem, exocitose, apoptose e do citoesqueleto rearranjo. Por exemplo, o ensaio pode ser detectar alterações em interacções proteína-canais entre os canais de potássio e outros componentes citoplasmáticos ou do citoesqueleto. O caso, no entanto, deve ocorrer dentro da zona de detecção nm ~ 150 perto do biossensor, e, no caso de uma célula em anexo, perto da membrana do plasma. Aquisição de respostas celulares é realizada com software BIND Scan e uma representação da imagem de cada um dos 384 poços na placa de SBS é gerado. Este sistema tem uma resolução de até 3,75 mM / pixel, permitindo a detecção de eventos em células isoladas, epode ser utilizado, quer com linhas celulares (tais como células CHO ou HEK293) ou com mais fisiologicamente relevante células primárias. A análise de imagem com o BIND Ver software permite a detecção de respostas celulares, tanto individual e as populações de células. Como os biosensores são incorporados padrão SBS microplacas de 384 poços, o sistema é facilmente adaptável para rastreio de alto rendimento (HTS). Ressonância comprimentos de onda ópticos ralar biossensores foram previamente usados ​​para detectar alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a ativação de GPCRs 11. O nosso laboratório clonou dois canais de potássio (K Na) ativado em sódio, Slack-B e Slick 12. A actividade de ambos os canais Slack-B e liso tem sido demonstrado ser muito fortemente influenciados pela activação directa de proteína quinase C (PKC) 13. A activação dos receptores acoplados à proteína q Gu, tais como o receptor muscarínico M1 e o mGluR1 metabotrópicos de glutamato receptor, potente regula a atividade do canal por meio da ativação da PKC. Estes canais de K de Na contribuir para a adaptação neuronal durante a estimulação prolongada e regular a precisão de tempo de potenciais de ação 14. Slack canais são conhecidos por interagir com uma variedade de moléculas sinalizadoras citoplasmáticas, incluindo FMRP, a proteína X frágil Mental Retardation 15,16. Mutações no resultado Slack em vários Migrando crises parciais de Infância (MMPSI), uma forma de início precoce da epilepsia o que resulta em atraso grave de desenvolvimento 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

Canais iônicos controlar as propriedades elétricas dos neurônios e outros tipos de células excitáveis, permitindo seletivamente íons a fluir através da membrana plasmática 1. Para regular a excitabilidade neuronal, as propriedades biofísicas de canais de iões são modificadas por proteínas e moléculas de sinalização, o que muitas vezes se ligam aos próprios canais de modo a formar um complexo do canal heteromérico de 2,3. Ensaios tradicionais que examinam a interacção entre os canais e as proteínas reguladoras requerem rótulos exógenos que podem potencialmente alterar o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo, enquanto proporciona pouca informação sobre o curso de tempo de interacções em células vivas. Biossensores ópticos, como o sistema X-CORPO Biociências BIND Scanner, usar uma tecnologia sem rótulo novela, ressonância comprimento de onda grade (GRT) biossensores ópticos, para detectar mudanças na luz refletida ressonante perto do biossensor. Este ensaio permite a detecção da relativaalterar em massa no interior da porção inferior das células vivas aderentes à superfície do biossensor, resultante do ligando alterações induzidas na adesão celular e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação, e as alterações nas interacções proteína-proteína, perto da membrana do plasma. RWG biossensores ópticas têm sido utilizadas para detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a activação de receptores acoplados à proteína (GPCRs), tirosina-quinases receptoras, e os outros receptores da superfície celular. As alterações induzidas pelo ligando de iões de interacções proteína-canal também pode ser estudada utilizando este ensaio. Neste artigo, vamos descrever o procedimento experimental usado para detectar a modulação da Slack-B potássio ativado por sódio (Na) K canais por GPCRs.

Slack-B transfectadas estavelmente células HEK-293 transfectadas e controlam as células HEK-293 foram semeadas a 1000 células / poço em 384 bem-ECM, placas revestidas com biossensores RWG. Imagens da central de 1,5 milímetros 2 do biossensor foram gravadas com uma resolução de 3,75 mM / pixel (Figura 1). Mapas de gradiente de densidade de massa foram gerados antes e 30 minutos após adição composto com o software BIND Scan. O BIND Ver software foi utilizado para determinar a mudança...

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Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Técnicas de biossensor ópticos podem detectar alterações na massa perto da membrana plasmática em células vivas e permite que se siga as respostas celulares em ambas as células individuais e as populações de células. Este protocolo descreve a detecção da modulação de canais de potássio de L-receptores acoplados à proteína em células intactas utilizando este método.

O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K visualizações.  Yale School of Medicine.  Técnicas de biossensor ópticos podem detectar alterações na massa perto da membrana plasmática em células vivas e permite que se siga as respostas celulares em ambas as células individuais e as populações de células. Este protocolo descreve a detecção da modulação de canais de potássio de L-receptores acoplados à proteína em células intactas utilizando este método. 

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Bioengenharia

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...