Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health Research concessão R01-DE021683-01 e National Institutes of Health Research concessão R01-DE019434 para MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship para MTCDCW foi apoiado pela ACS Franklin Martin Faculdade Research Fellowship, O Laboratório Hagey for Pediatric Regenerative Medicine, e do Instituto de Pesquisa de Saúde Infantil da Universidade de Stanford Faculdade Scholar Award.

NOTA: Todas as amostras dos pacientes foram obtidos com o consentimento informado, e os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Stanford University Institutional Review Board (Protocolo nº 2188 e # 9999). 1. Isolamento celular e Cultura: <ol><li> Obter tecido adiposo subcutâneo humano de pacientes saudáveis ​​do sexo feminino submetidos a lipoaspiração eletiva do abdômen, flanco, e / ou região de coxa sob anestesia local / geral. Certifique-se de que Institutional Review Board (IRB) a aprovação foi obtida para o protocolo de isolar ASC de tecidos humanos, e siga as precauções de segurança institucionais ao trabalhar com esses materiais. </li><li> Para obter o SVF a partir do tecido adiposo lipoaspirated, lava-se a primeira lipoaspirado três vezes com volumes iguais de solução salina tamponada 1x com fosfato estéril (PBS). Aspirar cuidadosamente e descartar a camada aquosa inferior. </li><li> Preparar o tampão de digestão de colagenase: 0,075% de colagenase do Tipo I em HankBalanced Salt Solution (HBSS). Preparar tampão de FACS: 2% de FBS, 1% P188 e 1% de Pen-Strep em PBS. Filtrar ambas as soluções através de um tamanho de poro de 0,22 um fluxo rápido filtro polietersulfona disponível comercialmente. </li><li> Para digerir o tecido adiposo lavada, adicionar um volume igual de tampão de digestão com colagenase e colocar vaso de digestão de forma segura em um banho de água com agitação durante 60 min a 37 ° C (cerca de 180 agitações / min). NOTA: É melhor utilizar um vaso de digestão volume maior do que o necessário, pois isso permite uma digestão durante a agitação máxima (isto é, 250 ml de tampão de digestão com colagenase, de 250 ml de tecido adiposo lavado em um frasco estéril 1L). </li><li> Neutraliza-se a actividade enzimática por adição de um volume igual de tampão de FACS e permitindo a sentar-se à TA durante 5 min. Em seguida, centrifugar a 233 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o SVF pellet de alta densidade. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5-10 ml de RT vermelhocélulas de tampão de lise, com base no tamanho da pelota. Deixar a solução sentar à temperatura ambiente durante 5 min e centrifugar a 233 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento, adicionando 5-10 ml de meio de crescimento tradicional, com base no tamanho da pelota (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / FBS a 10% / 1% de solução de penicilina-estreptomicina [pen-strep]). </li><li> Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 100 mm de nylon para remover os detritos celulares. </li><li> Centrifuga-se a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5-10 ml de meio de crescimento tradicional, com base no tamanho do sedimento. </li><li> Coloque 2 x 10 6 células em uma placa de cultura de 15 centímetros padrão e estabelecer culturas primárias O / N a 37 ° C / 21% de O2, 5% de CO 2. Mantém-se a níveis sub-confluente para impedir a diferenciação espontânea a 37 ° C / 21% de O2, 5% de CO 2 em meio de crescimento. A densidade celular em um plenamente: NOTAconfluente 15 centímetros da placa é de aproximadamente 4-6 x 10 6 células. </li></ol> 2. Coloração <ol><li> ASC Cultura em meio de crescimento tradicional, a 37 ° C / 21% de O2, 5% de CO 2, por 36 horas antes da coloração / classificação. </li><li> ASC carona de placas de cultura utilizando Accutase (de acordo com o protocolo do fabricante). </li><li> Lave as células uma vez com tampão de FACS (PBS com 2% de FBS e 1% de pen-strep). </li><li> Centrifuga-se a 233 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspender as células em 0,5-1 mL de tampão de FACS (dependendo do número de células e a quantidade de anticorpo desejado). NOTA: O volume da suspensão de células, de acordo com as recomendações do fabricante do anticorpo FACS, determina a concentração de anticorpos. No entanto, a titulação da concentração de anticorpo, utilizando uma concentração de partida de 1: 100, é normalmente aconselhada se é a primeira vez que a utilização de um anticorpo. </li><li> Contar o número total decélulas utilizando um hemocitómetro. </li><li> Reserva alíquotas de 100 ul em tubos de 1,5 ml de centrífuga a ser utilizado para uma amostra não corado e controlos de cor única (de acordo com o número de anticorpos fluorescentes utilizados). </li><li> Adicionar os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência adequados (em concentrações pré-determinadas, segundo as instruções do fabricante) e incubar durante 20-30 minutos em gelo, protegida da luz. <ol><li> Para etiquetar subpopulação osteogénico: Diluir anti-CD90 (APC CD90 anti-humano (Thy1)) ou anti-CD105 (FITC anti-CD105 humano (endoglina)) em tampão de SCAF até uma concentração de 1:50. </li><li> Para identificar as outras populações de células (por exemplo, hematopoiética e células endoteliais): Diluir anti-CD45 (anti-CD45 humano do Pacífico azul), anti-CD34 (anti-CD34 humano APC), e / ou anti-CD31 (anti-humano CD31 PE ) em tampão de FACS para uma concentração de 1:50. </li><li> Se não utilizando anticorpos directamente conjugados, utilizar um anticorpo primário biotinilado com um segundo conjugado de estreptavidina-apropriadaanticorpo ária, tal como estreptavidina PE-Cy7, a uma diluição de 1: 100. </li></ol></li><li> Após a incubação, lavar as células duas vezes: encher os tubos com tampão de SCAF e centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, o sobrenadante por aspiração. </li><li> Ressuspender as células em 400-500 amostras ul FACS tampão e filtro através de um 70 um filtro de células nylon para remover aglomerados de células. </li><li> Transferir células marcadas em tubos de FACS com topo do filtro e manter as amostras em gelo durante a duração da análise. </li></ol> 3. activadas por fluorescência celular NOTA: Os passos seguintes mandato conhecimento prévio em células activadas por fluorescência (FACS) ou a assistência de um técnico especializado. <ol><li> Usando o software FACS adequadas, parcelas de análise de projeto para examinar dispersão para a frente (FSC), dispersão lateral (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Red, Blue Pacific, Fluorescein Isothiocyanate (ITCF), aloficocianina (APC) e qualquer outro uso fluorophored para marcar as células. </li><li> Antes de carregar no separador de células, brevemente vórtice cada amostra para voltar a suspender as células. </li><li> Começar com a análise da amostra não corado, de modo a definir portas para a população total de células, para excluir os detritos celulares, e para determinar a linha de base da autofluorescência. </li><li> Adiciona-se iodeto de propídio (PI) para a amostra não corado e analisá-lo, a fim de visualizar a população de células vivas na população total de células. Construir um portão em torno desta população. </li><li> Analisar uma amostra de controlo de cor única para cada fluorocromo, a fim de definir a compensação de fluorescência. </li><li> Analisar a amostra corada para definir a posição de portas para a classificação. </li><li> Adicionar PI para a amostra corada de forma a corar as células mortas. </li><li> Organize as populações de células marcadas. Separar por quer tubos de 1,5 ml de centrífuga ou tubos cónicos (15 ml) contendo meio de cultura. </li><li> Cessar a triagem manual, uma vez a quantidade necessária de células foi obtido. </li><li> Nósing FACS, executar uma verificação de pureza por análise de uma pequena fracção (por exemplo., células 500) da população de células obtidas. NOTA: Este passo confirma a pureza das populações de células classificadas. Idealmente, a pureza deverá ser superior a 90-95%. </li><li> Centrifugar células a 233 xg durante 5 min a 4 ° C imediatamente após a conclusão de triagem e ressuspender em 1 ml de meio fresco contendo 10% de FBS. NOTA: A quantidade de material utilizado pode ser aumentado com base no tamanho do sedimento celular. </li><li> Placa em placas revestidas com gelatina para melhorar a viabilidade celular. Dependendo do rendimento celular final, a placa de 300.000 células por cavidade em uma placa de 6 poços, 100000 células por poço numa placa de 12 poços. </li></ol>

<ol>
	<li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298, 580-584 (2002).</li><li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+profiling+in+individual+hematopoietic+progenitors+by+digital+RT-PCR.">Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).</li><li>Warren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+instability+is+not+a+universal+attribute+of+aging.">Transcriptional instability is not a universal attribute of aging.</a> Aging Cell. 6, 775-782 (2007).</li><li>Aalami, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+mouse+model+of+calvarial+healing:+differences+in+regenerative+abilities+of+juveniles+and+adults.">Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults.</a> Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).</li><li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+(TGF-beta1)+signaling.">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).</li><li>Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+antigen+expression+by+cells+in+the+osteoblast+lineage.">Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).</li><li>Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+vitamin+D,+retinoic+acid,+and+dexamethasone+in+mouse+adipose-derived+mesenchymal+cells.">Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells.</a> Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).</li><li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depot-specific+variation+in+the+osteogenic+and+adipogenic+potential+of+human+adipose-derived+stromal+cells.">Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).</li><li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen/estrogen+receptor+alpha+signaling+in+mouse+posterofrontal+cranial+suture+fusion.">Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion.</a> PloS one. 4, e1720 (2009).</li><li>Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+human+adipose-derived+stem+cells:+separating+promise+from+clinical+need.">Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need.</a> Stem Cells. 29, 404-411 (2011).</li><li>Glotzbach, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Information+Theoretic,+Microfluidic-Based+Single+Cell+Analysis+Permits+Identification+of+Subpopulations+among+Putatively+Homogeneous+Stem+Cells.">An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells.</a> PLoS One. 6, e21211 (2011).</li><li>Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+isolation+of+adipose-derived+stem+cells+from+human+lipoaspirates.">Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates.</a> J. Vis. Exp. , e50585 (2013).</li><li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells:+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers.">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li><li>McMurray, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surfaces+for+the+long-term+maintenance+of+mesenchymal+stem+cell+phenotype+and+multipotency.">Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency.</a> Nat Mater. 10, 637-644 (2011).</li><li>Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+and+transcriptional+characterization+of+human+adipose-derived+adherent+stromal+(hADAS)+cells.">Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells.</a> Stem Cells. 23, 412-423 (2005).</li><li>McIntosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunogenicity+of+human+adipose-derived+cells:+temporal+changes+in+vitro.">The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro.</a> Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).</li><li>Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+negatively+impacts+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion+and+differentiation.">Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation.</a> Journal of translational medicine. 12, 8 (2014).</li><li>Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem/progenitor+cells:+roles+in+adipose+tissue+remodeling+and+potential+use+for+soft+tissue+augmentation.">Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.</a> Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).</li><li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD90+(Thy-1)+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells.">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li></ol>

Nenhum dos autores têm um interesse financeiro em qualquer um dos produtos, dispositivos ou drogas mencionadas neste artigo. Nenhum dos autores tem qualquer interesse financeiro competindo para relatar.

Actualmente, o isolamento de subpopulações homogéneas de ASC de SVF de tecido adiposo humano continua a ser um desafio embora objectivo desejável. Isolamento de subpopulações ASC pró-osteogénicas é particularmente desejável, uma vez que tais células podem ser utilizadas para estudar a formação e a homeostase do tecido esquelético. No entanto, o SVF de tecido adiposo abriga heterogeneidade significativa no que diz respeito a conter capacidade celular e potencial de diferenciação. 11 A base mole...

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.1-5
In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.6 However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:112px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:79px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Disposable 250 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:152px;">Corning (Thomas Scientific)</td>
			<td style="width:112px;">2602A43</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:152px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15140-122</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td>
			<td style="width:152px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">10566-016</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:152px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution</td>
			<td style="width:152px;">Purdue&#160;</td>
			<td>PFC-67618015017</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution, 1X</td>
			<td style="width:152px;">Cellgro</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin</td>
			<td style="width:152px;">Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-5G</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ACCUTASE Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">APC Mouse Anti-Human CD90</td>
			<td style="width:152px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:112px;">559869</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)</td>
			<td style="width:152px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:112px;">561443</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)&#160;</td>
			<td style="width:152px;">eBioscience</td>
			<td style="width:112px;">48-9459-41</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Anti-Human CD34 APC</td>
			<td style="width:152px;">eBioscience</td>
			<td style="width:112px;">17-0349-41</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE</td>
			<td style="width:152px;">eBioscience</td>
			<td style="width:112px;">12-0319-41</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Streptavidin PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:152px;">eBioscience</td>
			<td style="width:112px;">25-4317-82</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">BD FACS Aria II instrument</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">BD FACSDiva Software</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and enrichment of human adipose-derived stromal cells for enhanced osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

Usando CD90 como um marcador para células com melhores resultados de osteogénese no isolamento de uma população altamente enriquecidas de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC foram coradas com azul-Pacífico CD45 conjugado anti-humano, conjugado com FITC anti-CD105 humano, e CD90 anti-humano conjugado com APC. Após a separação, o nível de pureza foi superior a 98%, tal como quantificado por análise post-tipo. Definição de grupos de células com base em perfis de trans...

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Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K visualizações.  Stanford University School of Medicine. The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.