Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research concessione R01-DE021683-01 e National Institutes of Health Research concessione R01-DE019434 a MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship per MTCDCW è stata sostenuta dalla ACS Franklin Martin Faculty Research Fellowship, Il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa, e la Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

NOTA: Tutti i campioni dei pazienti sono stati ottenuti con il consenso informato, e protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati da Stanford University Institutional Review Board (protocollo # 2188 e # 9999). 1. Isolamento delle cellule e Cultura: <ol><li> Ottenere tessuto adiposo sottocutaneo umano da pazienti di sesso femminile sani sottoposti a lipoaspirazione elettiva del ventre, fianchi, e / o regione della coscia in anestesia locale / generale. Assicurarsi che Institutional Review Board (IRB) di approvazione è stata ottenuta per il protocollo di isolare ASC da tessuti umani, e seguire le precauzioni di sicurezza istituzionali mentre si lavora con questi materiali. </li><li> Per ottenere il SVF dal tessuto adiposo lipoaspirated, prima lavare il lipoaspirato tre volte con volumi uguali di 1x tampone fosfato salino (PBS) sterile. Con attenzione aspirare ed eliminare lo strato acquoso inferiore. </li><li> Preparare il buffer collagenasi digestione: 0,075% Tipo I collagenasi a Hank diSoluzione salina bilanciata (HBSS). Preparare tampone FACS: 2% FBS, 1% P188 e l&#39;1% Pen-Strep in PBS. Filtro entrambe le soluzioni che utilizzano una dimensione dei pori 0,22 micron filtro polietersulfone flusso veloce disponibile in commercio. </li><li> Per digerire il tessuto adiposo lavato, aggiungere un volume uguale di tampone di digestione collagenasi e posizionare vaso di digestione saldamente in un bagno d&#39;acqua agitazione per 60 min a 37 ° C (circa 180 frullati / min). NOTA: E &#39;meglio utilizzare un volume di digestione nave più grande del necessario, in quanto ciò permette di digestione massima durante l&#39;agitazione (cioè, 250 ml di tampone collagenasi digestione, 250 ml di tessuto adiposo lavati in un pallone sterile 1L). </li><li> Neutralizzare attività enzimatica aggiungendo un volume uguale di tampone FACS e consentendo di sedersi a temperatura ambiente per 5 min. Successivamente, centrifugare a 233 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare accuratamente e scartare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet SVF ad alta densità. </li><li> Risospendere il pellet in 5-10 ml di RT rossotampone di lisi cellulare, in base alle dimensioni del pellet. Lasciare soluzione sedersi a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a 233 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo 5-10 ml di mezzi di crescita tradizionali, in base alle dimensioni del pellet (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% soluzione di penicillina-streptomicina [pen-strep]). </li><li> Filtrare la sospensione attraverso un 100 micron filtro cella nylon per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet in 5-10 ml di mezzi di crescita tradizionali, in base alle dimensioni del pellet. </li><li> Inserire 2 x 10 6 cellule in un piatto di coltura standard di 15 cm, stabilire colture primarie O / N a 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2. Mantenere a livelli sub-confluenti per impedire differenziazione spontanea a 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 nei substrati. Densità cellulare in uno completamente: NOTAconfluenti 15 centimetri piatto è di circa 4-6 x 10 6 cellule. </li></ol> 2. Colorazione <ol><li> ASC culturali in mezzo di crescita tradizionale a 37 ° C / 21% O 2, 5% di CO 2, per 36 ore prima della colorazione / smistamento. </li><li> ASC Ascensore da piastre di coltura utilizzando Accutase (come da protocollo del produttore). </li><li> Lavare le cellule una volta con tampone FACS (PBS con il 2% e l&#39;1% FBS pen-strep). </li><li> Centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 0,5-1 ml di tampone FACS (a seconda del numero di cellule e la quantità di anticorpo desiderato). NOTA: Il volume della sospensione cellulare, in conformità con le raccomandazioni del costruttore l&#39;anticorpo FACS, determina la concentrazione di anticorpi. Tuttavia, la titolazione di concentrazione di anticorpi, utilizzando una concentrazione iniziale di 1: 100, è di solito consigliata se è la prima volta di utilizzare un anticorpo. </li><li> Contare il numero totale dicellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Riserva 100 aliquote ul a 1,5 ml provette da utilizzare per un campione senza macchia e controlli solo colore (in base al numero di anticorpi fluorescenti utilizzate). </li><li> Aggiungere gli anticorpi monoclonali fluorescenza marcata adeguati (a concentrazioni predeterminate, secondo le istruzioni del produttore) e incubare per 20-30 minuti sul ghiaccio, al riparo dalla luce. <ol><li> Per etichettare sottopopolazione osteogenic: Diluire anti-CD90 (APC CD90 anti-umano (Thy1)) o anti-CD105 (FITC anti-umano CD105 (endoglin)) in tampone FACS ad una concentrazione di 1:50. </li><li> Per etichettare altre popolazioni cellulari (ad esempio, ematopoietiche e cellule endoteliali): Diluire anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), e / o anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS tampone a una concentrazione di 1:50. </li><li> Se non si usa anticorpi coniugati direttamente, utilizzare un anticorpo primario biotinilato con un secondo streptavidina coniugato appropriatoanticorpi ary, quali streptavidina PE-Cy7, a una diluizione di 1: 100. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule due volte: riempire tubi con tampone FACS e centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C, aspirando surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 400-500 campioni microlitri FACS tampone e filtro attraverso un colino 70 micron cella nylon per rimuovere grumi di cellule. </li><li> Trasferire cellule marcate in tubi FACS con piano filtro e mantenere i campioni in ghiaccio per la durata dell&#39;analisi. </li></ol> 3. Fluorescence-activated cell sorting NOTA: Le seguenti operazioni impongono conoscenza nella cella fluorescenza attivate (FACS) o l&#39;assistenza di un tecnico specializzato. <ol><li> Utilizzando il software FACS appropriate, trame di analisi progettuale esaminare forward scatter (FSC), side scatter (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Red, Pacific Blue, fluoresceina isotiocianato (FITC), Allophycocyanin (APC) e qualsiasi altro uso fluoroforod per etichettare le cellule. </li><li> Prima di essere caricato nel cell sorter, brevemente vortice ogni campione per sospendere nuovamente le cellule. </li><li> Iniziare con analisi del campione non colorato per impostare porte per la popolazione totale di cellule, di escludere detriti cellulari, e determinare autofluorescenza basale. </li><li> Aggiungere ioduro di propidio (PI) al campione non colorato e analizzarlo per visualizzare la popolazione di cellule vive all&#39;interno della popolazione cellulare totale. Costruire un cancello intorno a questa popolazione. </li><li> Analizzare un campione di controllo unico colore per ogni fluorocromo per impostare la compensazione della fluorescenza. </li><li> Analizzare il campione colorato per impostare la posizione di porte per l&#39;ordinamento. </li><li> Aggiungere PI al campione macchiato per macchiare cellule morte. </li><li> Ordina le popolazioni di cellule etichettate. Ordina in entrambi 1,5 ml provette o tubi conici (15 ml) contenenti terreno di coltura. </li><li> Cessare manualmente classificare una volta ottenuta la quantità necessaria di cellule. </li><li> Noiing FACS, eseguire un controllo della purezza analizzando una piccola frazione (ad es., 500 cellule) della popolazione cellulare acquisita. NOTA: Questo passaggio conferma la purezza delle popolazioni cellulari ordinati. Idealmente, la purezza dovrebbe essere maggiore di 90-95%. </li><li> Cellule centrifugare a 233 xg per 5 min a 4 ° C immediatamente dopo il completamento della cernita e risospendere in 1 ml di mezzo fresco contenente 10% FBS. NOTA: La quantità di materiale utilizzato può essere aumentato in base alle dimensioni del pellet di cellule. </li><li> Piatto su piastre rivestite di gelatina per migliorare la vitalità cellulare. A seconda del rendimento cellulare finale, piastra 300.000 cellule per bene in un 6-pozzetti, 100.000 cellule per pozzetto in una piastra di 12 pozzetti. </li></ol>

<ol>
	<li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298, 580-584 (2002).</li><li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+profiling+in+individual+hematopoietic+progenitors+by+digital+RT-PCR.">Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).</li><li>Warren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+instability+is+not+a+universal+attribute+of+aging.">Transcriptional instability is not a universal attribute of aging.</a> Aging Cell. 6, 775-782 (2007).</li><li>Aalami, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+mouse+model+of+calvarial+healing:+differences+in+regenerative+abilities+of+juveniles+and+adults.">Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults.</a> Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).</li><li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+(TGF-beta1)+signaling.">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).</li><li>Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+antigen+expression+by+cells+in+the+osteoblast+lineage.">Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).</li><li>Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+vitamin+D,+retinoic+acid,+and+dexamethasone+in+mouse+adipose-derived+mesenchymal+cells.">Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells.</a> Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).</li><li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depot-specific+variation+in+the+osteogenic+and+adipogenic+potential+of+human+adipose-derived+stromal+cells.">Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).</li><li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen/estrogen+receptor+alpha+signaling+in+mouse+posterofrontal+cranial+suture+fusion.">Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion.</a> PloS one. 4, e1720 (2009).</li><li>Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+human+adipose-derived+stem+cells:+separating+promise+from+clinical+need.">Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need.</a> Stem Cells. 29, 404-411 (2011).</li><li>Glotzbach, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Information+Theoretic,+Microfluidic-Based+Single+Cell+Analysis+Permits+Identification+of+Subpopulations+among+Putatively+Homogeneous+Stem+Cells.">An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells.</a> PLoS One. 6, e21211 (2011).</li><li>Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+isolation+of+adipose-derived+stem+cells+from+human+lipoaspirates.">Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates.</a> J. Vis. Exp. , e50585 (2013).</li><li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells:+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers.">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li><li>McMurray, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surfaces+for+the+long-term+maintenance+of+mesenchymal+stem+cell+phenotype+and+multipotency.">Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency.</a> Nat Mater. 10, 637-644 (2011).</li><li>Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+and+transcriptional+characterization+of+human+adipose-derived+adherent+stromal+(hADAS)+cells.">Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells.</a> Stem Cells. 23, 412-423 (2005).</li><li>McIntosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunogenicity+of+human+adipose-derived+cells:+temporal+changes+in+vitro.">The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro.</a> Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).</li><li>Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+negatively+impacts+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion+and+differentiation.">Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation.</a> Journal of translational medicine. 12, 8 (2014).</li><li>Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem/progenitor+cells:+roles+in+adipose+tissue+remodeling+and+potential+use+for+soft+tissue+augmentation.">Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.</a> Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).</li><li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD90+(Thy-1)+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells.">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li></ol>

Nessuno degli autori ha un interesse finanziario in uno qualsiasi dei prodotti, dispositivi, o farmaci citati in questo manoscritto. Nessuno degli autori ha alcun concorrente interesse finanziario a riferire.

Attualmente, l&#39;isolamento di sottopopolazioni omogenei di ASC dal SVF di tessuto adiposo umano rimane una sfida anche se obiettivo auspicabile. Isolamento di sottopopolazioni ASC pro-osteogeniche è particolarmente desiderabile, poiché tali cellule possono essere usati per studiare la formazione e l&#39;omeostasi dei tessuti scheletrici. Tuttavia, la SVF di tessuto adiposo ospita una significativa eterogeneità in materia di staminali la capacità delle cellule e potenziale di differenziazione. 11 Le bas...

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.1-5
In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.6 However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:112px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:79px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Disposable 250 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:152px;">Corning (Thomas Scientific)</td>
			<td style="width:112px;">2602A43</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:152px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15140-122</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td>
			<td style="width:152px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">10566-016</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:152px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution</td>
			<td style="width:152px;">Purdue&#160;</td>
			<td>PFC-67618015017</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution, 1X</td>
			<td style="width:152px;">Cellgro</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin</td>
			<td style="width:152px;">Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130-5G</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ACCUTASE Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">APC Mouse Anti-Human CD90</td>
			<td style="width:152px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:112px;">559869</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)</td>
			<td style="width:152px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:112px;">561443</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)&#160;</td>
			<td style="width:152px;">eBioscience</td>
			<td style="width:112px;">48-9459-41</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Anti-Human CD34 APC</td>
			<td style="width:152px;">eBioscience</td>
			<td style="width:112px;">17-0349-41</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE</td>
			<td style="width:152px;">eBioscience</td>
			<td style="width:112px;">12-0319-41</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Streptavidin PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:152px;">eBioscience</td>
			<td style="width:112px;">25-4317-82</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">BD FACS Aria II instrument</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">BD FACSDiva Software</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and enrichment of human adipose-derived stromal cells for enhanced osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

Utilizzando CD90 come marcatore per le cellule con risultati migliorati osteogenesi in isolamento di una popolazione altamente arricchito di ASC umani (Figura 1A, 1B). ASC sono state colorate con Pacific Blue coniugati CD45 anti-umane, coniugati con coniugato CD105 anti-umana, e APC-coniugato anti-CD90 umano. Dopo la cernita, il livello di purezza era superiore al 98%, come quantificato mediante analisi post-ordinamento. Gruppi di cellule in base ai profili trascrizionali co...

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Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K Views.  Stanford University School of Medicine. The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.