We would like to thank the Children&#8217;s Hospital at Montefiore, Department of Pediatrics, for providing support for these studies. We would like to thank the National Alopecia Areata Foundation for providing financial support for conducting studies with C3H/HeJ engrafted mice.

Etica Dichiarazione: Tutti gli studi che coinvolgono animali devono essere approvate dal IACUC dell&#39;istituzione (per i dati che segue, i protocolli sono stati approvati dal Montefiore IACUC, protocollo # 11-6-240 e 13-7-100 #). Gli animali vengono forniti anestesia leggeri come indicato al solo scopo di tenerli fermi durante fotografia, non esistono procedure dolorose richieste per questo protocollo. 1. Acquisizione di fotografie <ol><li> Impostare fuoco e campo visivo per imager gel utilizzando carta con il testo stampato. Verificare uniformità della fonte di luce in tutta regione fotografato. Per garantire l&#39;uniformità, utilizzare un imager gel con un costruito in fonte di luce per la fotografia riflettente. Non utilizzare una fonte di luce transilluminazione, in quanto ciò creerebbe una silhouette dell&#39;animale, che non è adatto per ulteriori analisi in scala di grigi. NOTA: Questo metterà il mouse leggermente fuori fuoco, che fornisce media ottica in tutta la regione di interesse (ROI) e volontàridurre gli errori quantali molto piccoli (cioè &lt;10 pixel) regioni di interesse. Regioni più grandi d&#39;interesse non saranno interessati da questo piccolo fuoco di regolazione, né saranno influenzati dalle differenze nelle dimensioni dell&#39;animale. </li><li> Anestetizzare animali utilizzando ketamina (100 mg / ml) / xilazina (20 mg / ml) (2: 1), in quanto fornisce un rapido effetto anestesia e rapido recupero ed è ottimale per fotografare multipli animali. NOTA: L&#39;anestesia è confermata quando l&#39;animale è ancora sufficiente per permettere fotografia. Come animali in genere recuperano da questa luce anestesia entro 10-15 minuti, il veterinario non ha raccomandato l&#39;uso di pomate oculari. </li><li> Inserire animali anestetizzati su gel imager in allineamento verticale (più vicino a parallelo possibile). <ol><li> Per le fotografie dorsali, mettere gli animali in posizione prona con gli arti estesi. </li><li> Per le fotografie ventrali, mettere gli animali in posizione supina, facendo attenzione che gli animali non sono ruotati lateralmente. </li&gt; </ol></li><li> Luogo di serie in scala di grigi nella regione fotografato. </li><li> Chiudere la porta di accesso. Importante: luce ambientale può introdurre variazioni di esposizione. </li><li> Set F-stop di un&#39;esposizione che pone la regione di interesse all&#39;interno della gamma lineare di acquisizione (lettura F-stop). NOTA: La maggior parte dei sistemi saranno visualizzare in cui l&#39;immagine è satura. </li><li> Prendere fotografia. </li><li> Change F-Stop un&#39;altra impostazione dell&#39;esposizione che pone la regione di interesse all&#39;interno del range lineare aumentando o diminuendo il F-stop da 1, tale che sia il livello e la regione di interesse rimangono in una serie lineare di acquisizione (domanda F- stop). </li><li> Prendere fotografia. </li><li> Una volta che la fotografia è completata, posizionare gli animali su un tavolo di riscaldamento e monitorare fino a che non possono mantenere decubito sternale. Animali tornare alle loro gabbie. Restituisce il gruppo di animali di vivaio una volta che tutti gli animali sono completamente recuperati. </li></ol> 2. Quantificazione di assorbimento della luce &lt;/ P&gt; <ol><li> Regioni Mark di interesse sulle immagini degli animali uso del software fornito per il gel imager. <ol><li> Per tutta la vista dorsale animale, utilizzare un&#39;immagine rettangolare o ovale estende dalle arti superiori agli arti inferiori, che si estende lateralmente per quanto possibile tale che nessuna parte della scatola si estende oltre la parte posteriore dell&#39;animale come mostrato nella Figura 1A. NOTA: Si potrebbe anche segnare l&#39;area di interesse utilizzando uno strumento di disegno a mano libera. </li><li> Per animale intero vista ventrale, utilizzare 2 rettangoli: coprire la regione pelvica e coprire la zona del torace come mostrato nella Figura 1B. </li><li> Per una regione più piccola di interesse, vale a dire, la posizione di somministrazione del farmaco, marchio a seconda dei casi. </li></ol></li><li> Regione Mark (s) di interesse sullo standard di assorbimento in scala di grigi. </li><li> Assorbimento Registrare da ciascuna delle regioni marcate di interesse. </li></ol> 3. Analisi Livelli di assorbimento richiederlod per le regioni di interesse potrebbe essere necessario normalizzato allo standard di sfondo per il confronto tra le fotografie. Il rapporto di esposizione ad assorbimento è log-log (cioè, il rapporto è lineare tra log (esposizione) e di registro (assorbimento)). Con questo rapporto, l&#39;assorbimento della regione di interesse può essere normalizzato ad un valore sfondo standard, che permetterà assorbimenti di essere confrontati direttamente tra diverse fotografie, comprese quelle prese a diversi momenti (ad esempio, le misurazioni seriali all&#39;interno di un protocollo di studio). La procedura per l&#39;esecuzione di queste correzioni è dettagliata in passaggi facoltativi 3.1 e 3.2. <ol><li> (Opzionale) curva Aree log (esposizione) vs. log (assorbimento) con valori ottenuti dallo standard di assorbimento in scala di grigi. </li><li> (Opzionale) Regolare le variazioni di livello di ogni fotografia come segue: <ol><li> Selezionare F-stop per la lettura (come determinato al punto 1.6) e F-stop di riferimento (come determinato in sTep 1.8). </li><li> Calcolare assorbimento medio dello standard in tutte le fotografie alla lettura F-stop. Questa media è il valore di riferimento standard (RSV). </li><li> Calcolare differenza di assorbimento tra la lettura e le impostazioni di F-stop di riferimento in ogni fotografia per lo standard (delta-S) e per ogni ROI definita (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X) </li><li> Calcolare l&#39;assorbimento corretto per ogni ROI come segue: assorbimento corretto (ROI-X) = Assorbimento (ROI-X) a lettura F-stop + (RSV - assorbimento di serie a leggere F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S) </li></ol></li><li> Compilare i dati sperimentali ed eseguire l&#39;analisi dei dati utilizzando tecniche statistiche standard per le variabili continue (ad esempio, ANOVA, T-test). </li></ol>

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</ol>

Authors have nothing to disclose.

In questo rapporto una descrizione dettagliata è dotata di una nuova tecnica per quantificare la perdita dei capelli nei roditori. Questa tecnica utilizza un imager gel per l&#39;acquisizione delle immagini e analisi, apparecchi che è prontamente disponibile in molti laboratori. Le misurazioni hanno dimostrato di essere robusto per piccole variazioni nella tecnica (figure 4 - 5), e sono ben correlati al grado di perdita di capelli visiva in modelli di trattamento (Figura 6). Queste tecniche sono state impiegate con successo nella valutazione delle terapie sperimentali per alopecia 17. Uno strumento per la valutazione quantitativa della crescita dei capelli nei roditori può essere molto utile nel portare avanti la ricerca in terapie per l&#39;alopecia. Molti modelli di mouse per alopecia hanno variabilità intrinseca, che rende difficile basare i risultati su valutazioni soggettive di interventi terapeutici. Analogamente, una valutazione quantitativa che fornisce un risultato sotto formadi una misura continua può essere riassunto da medie di gruppo e deviazione standard / errore standard, e può essere testato con tecniche statistiche standard (ANOVA, T-test). Questa valutazione quantitativa può essere utilizzato per misurare le risposte su una serie di punti di tempo, e può essere utilizzato per generare una curva dose-risposta per un composto in esame. L&#39;analisi quantitativa permette quindi per le valutazioni basate sulle prove di efficacia di terapie che sono in fase di sviluppo. Questa tecnica sfrutta la differenza di colore tra mantello e la pelle presente in molti ceppi di topi. Per i topi con capelli scuri, maggiore è la densità dei capelli, la maggiore quantità di assorbimento ottico. Questo assorbimento ottico può essere quantificato utilizzando un apparato di imaging gel, che è stato progettato per valutare assorbimento ottico in una regione definita di interesse per quantificare quantità di proteine ​​in western blot. Simile ad analisi Western Blot, le conseguenti misure di assorbimento può essere analeyzed utilizzando metodi statistici standard per confrontare la densità dei capelli tra i gruppi di topi (cioè, il trattamento contro il controllo). Analisi Western blot viene generalmente eseguita su una singola immagine che viene analizzato rispetto agli standard previsti su quell&#39;immagine. Tuttavia, con questa applicazione, diventa necessario fare confronti tra immagini diverse, che possono essere presi in tempi diversi. Con la tecnica fotografica molto consistente, variazioni tra fotografie possono essere ridotti al minimo. Tuttavia, per l&#39;applicazione sperimentale, è utile se lievi variazioni di esposizione tra le fotografie possono essere compensati. Pertanto, è importante che una norma scala di grigi essere inclusa nella fotografia (cioè, grafico scala di grigi del Tiffen 15). Tuttavia, il rapporto tra assorbimento e l&#39;esposizione varia a seconda della densità ottica del bersaglio (Figura 2A). Pertanto, se lo standard scala di grigio ha una densità ottica diversa dalla target, le opportune correzioni possono essere diverse. Correzioni logaritmiche sono utili, ma non forniscono una soluzione perfetta a questo problema (Figura 2B). Per scattare fotografie a 2 diversi F-stop, si può calcolare una approssimazione lineare per lo standard in scala di grigi e per ogni destinazione sulla fotografia, e quindi fornire una scala adeguata della correzione per i singoli obiettivi. Figura 3 illustra come bersagli con diverse ottiche densità avranno altri fattori di correzione, che possono essere interpolati da differenze di assorbimento di ciascun target a 2 diversi F-stop. Così, se si vuole normalizzare il livello al valore di 150, un bersaglio a densità ottica Tiffen 19 sarebbe 148, uno alla Tiffen 18 sarebbe 140, uno alla Tiffen 17 sarebbe 119, e così via. Invece di risolvere queste correzioni graficamente, si può utilizzare un rapporto di piste tra la norma in scala di grigi e il target tra il 2 f-stop per calcolare la correzione for ogni bersaglio, come spiegato nell&#39;esempio fornito (Tabella 1). Come tutte le tecniche, l&#39;analisi quantitativa della crescita dei capelli attraverso l&#39;analisi in scala di grigio ha diversi limiti. In primo luogo, vi è una significativa complessità computazionale in applicazione di questa tecnica. Ciò è dovuto al fatto che il software di analisi per imager gel è ottimizzato per analizzare ogni figura come un esperimento separato. Pertanto, vi è un requisito per correggere manualmente per qualsiasi variazione esposizioni tra immagini. L&#39;approssimazione linearizzato per tali correzioni aiuta a semplificare questo processo. Un esempio è fornito in Tabella 1: simulato dati di 2 set di fotografie, prese a F-stop 2.0 e 3.0, con uno standard comune. Ogni set di fotografie ha 2 ROI che devono essere confrontati tra le serie. Variazioni minime nelle condizioni fotografiche hanno causato la prima serie di fotografie per avere una leggermente maggiore esposizione rispetto al secondo set, evident per sfumature di assorbimento dello standard comune. L&#39;esempio mostra come piccole differenze nelle condizioni fotografiche possono creare differenze apparenti di assorbimento in un dato ROI, ma questi può essere corretto con uno standard di riferimento, in questo caso mostra che l&#39;assorbimento alle ROI non differiscono tra i 2 set di immagini. E &#39;importante notare che il cambiamento in assorbimento della luce non sempre direttamente correlate alla quantità di capelli depigmentazione o altri cambiamenti di colore potrebbe essere scambiata per la perdita di capelli o la crescita dei capelli. Purtroppo, la precisione di questa tecnica non può essere valutata perché non c&#39;è attualmente alcuna gold standard con cui confrontare. Tuttavia, in cui è evidente perdita di capelli, la tecnica non produrre i risultati attesi (Figura 6). Infine, non ci sono attualmente dati per valutare se i risultati con questa tecnica sono correlati con i risultati in studi clinici di potenziali terapie. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; L&#39;analisi in scala di grigi per quantificare la perdita dei capelli in varie forme di alopecia rappresenta un&#39;opportunità per perfezionare e uniformare i metodi per la caratterizzazione di modelli di alopecia e per le risposte di test a potenziali terapie. L&#39;applicazione di questa tecnica dovrebbe migliorare l&#39;identificazione e lo sviluppo di terapie più efficaci per alopecia.

Alopecia (perdita dei capelli) può essere un evento psicologicamente ed emotivamente angosciante con molteplici cause. Maschio-calvizie è la causa più comune di alopecia, che colpisce circa due terzi dei maschi per età 35 1. Un modello simile di perdita dei capelli può essere osservato nelle donne con sindrome dell&#39;ovaio policistico. In entrambi questi disturbi, la perdita di capelli è mediata androgeni. Alopecia può verificarsi anche come una malattia autoimmune, alopecia areata, che colpisce 1,7% della popolazione 2. Alopecia può verificarsi come un effetto collaterale di alcuni trattamenti medici, come la chemioterapia 3. Una percentuale elevata (65-85%) dei pazienti in chemioterapia esperienza un certo grado di alopecia 4,5. Le conseguenze psicologiche della perdita di capelli sono stati ben studiati in ambito chemioterapia. Alopecia indotta da chemioterapia può causare ansia, depressione, un&#39;immagine negativa del corpo, abbassato l&#39;autostima e una riduzione del senso di benessere 6,7. Un alto percentuale (47-58%) dei pazienti oncologici femminili considerare la perdita di capelli per essere l&#39;aspetto più traumatico della chemioterapia, e fino a 8% trattamento calo per paura di perdita di capelli 4,6. Ci sono anche prove in alopecia androgenetica per sostenere la terapia per ridurre le conseguenze psicologiche e anche medici di perdita di capelli 8,9. Allo stesso modo, l&#39;alopecia areata è stato segnalato per avere gravi conseguenze psicologiche 2, e la natura irregolare della perdita dei capelli può portare a un risultato estetico più sgradevole rispetto alla maggior parte altre cause di perdita dei capelli. Mentre i farmaci con effetti anti-androgenici lieve (cioè, spironolattone) erano stati utilizzati con successo limitato come terapia per l&#39;alopecia, il primo farmaco efficace per l&#39;alopecia era minoxidil 10. Questo antipertensivo ha un osservato effetto collaterale di causare la crescita dei capelli, ed è ora utilizzato come terapia topica per molte forme di alopecia. Tuttavia, le risposte sono spesso incomplete, con alcuni soggetti che mostra solo lentoing di perdita di capelli, piuttosto che la ricrescita reale 10. Finasteride è un antagonista competitivo di tipo II 5α-reduttasi che blocca la conversione del testosterone in diidrotestosterone, con conseguente miglioramento della alopecia androgenetica a scapito di parziale androgeni blocco sistemico. I tassi di risposta con-lungo termine (10 anni) terapia sono circa il 50% 11. Nel complesso, nonostante una notevole ricerca in questo settore, non c&#39;è ancora una terapia adeguata per la perdita dei capelli. Per decenni, gli scienziati e medici hanno esaminato i metodi di misurazione della crescita dei capelli del cuoio capelluto in studi clinici. Con lo sviluppo di farmaci che trattano alopecia, vi è stata una maggiore necessità di mezzo affidabile, economico e minimamente invasivi per misurare la crescita dei capelli e, in particolare, la risposta alla terapia. Tecnologia di analisi di immagine per una quantificazione precisa della densità dei capelli in pazienti con disturbi di perdita dei capelli ha dato risultati coerenti e validi in passato utilizzando una varietà di techniques, compresa l&#39;analisi delle immagini digitalizzate 12, l&#39;analisi delle immagini di singoli peli e lesioni 13 della pelle, e la scansione microscopica per quantificare la massa di capelli in una regione del cuoio capelluto definita 14. Purtroppo, mentre le metodologie di cui sopra hanno fornito una migliore valutazione dell&#39;efficacia per i capelli la crescita-promuovere interventi in studi clinici, questi metodi non siano state applicate a studi su roditori in studi preclinici. Il nostro obiettivo è quello di sviluppare un metodo coerente e affidabile per quantificare la perdita dei capelli nei topi, che permetterà ai ricercatori di valutare con maggiore precisione e confrontare nuovi approcci terapeutici per varie forme di alopecia. Abbiamo sviluppato una metodologia utilizzando attrezzature facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori che permetteranno la quantificazione rapida e affidabile della densità dei capelli nei topi con capelli castani o neri. Questa metodologia è stata testata in modelli murini di chemioterapia-indotta alopecia, alopecia areata, e alopecia da waxing. Un protocollo dettagliato è presentato per l&#39;esecuzione di queste misure, compresi i dati di convalida da C57BL / 6 e C3H / ceppi HeJ di topi. Poiché questa tecnica si basa sulla rilevazione di assorbimento della luce da pigmenti nel capello, non può essere utilizzato per rilevare la crescita dei capelli in topi bianchi o topi albini.

<table><tbody><tr><td>KODAK Gel Logic 100 Imaging System</td><td>Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA</td><td></td><td>Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.</td></tr><tr><td>The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale</td><td><a href="http://www.imatest.com/docs/q13/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Imatest</a></td><td></td><td>Greyscale standard</td></tr><tr><td>C57BL/6J Mice</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Mice for representative study</td></tr><tr><td>C3H/HeJ engrafted mouse</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Mice for representative study</td></tr></tbody></table>

a new technique for quantitative analysis of hair loss in mice using grayscale analysis

Alopecia è una forma comune di perdita dei capelli che può verificarsi in diverse condizioni, tra cui la perdita di capelli maschile-modello, la sindrome dell&#39;ovaio policistico, e alopecia areata. Alopecia può verificarsi anche come effetto collaterale della chemioterapia in pazienti affetti da cancro. In questo studio, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo coerente e affidabile per quantificare la perdita dei capelli nei topi, che permetterà agli investigatori di valutare con precisione e confrontare nuovi approcci terapeutici per queste varie forme di alopecia. Il metodo utilizza un imager gel standard per ottenere ed elaborare immagini di topi, misurando l&#39;assorbimento di luce, che si verifica in proporzione agitato per la quantità di capelli nero (o grigio) sul mouse. Dati che sono stati quantificati in questo modo possono essere analizzati con tecniche statistiche standard (ad esempio, ANOVA, T-test). Questa metodologia è stata testata in modelli murini di chemioterapia-indotta alopecia, alopecia areata e alopecia da ceretta. In questo rapporto, il protocollo dettagliato è presENTED per l&#39;esecuzione di queste misure, compresi i dati di convalida da C57BL / 6 e C3H / ceppi HeJ di topi. Questa nuova tecnica offre una serie di vantaggi, tra cui relativa semplicità di applicazione, dipendenza apparecchiature che è prontamente disponibile nella maggior parte dei laboratori di ricerca, e l&#39;applicazione di un obiettivo, valutazione quantitativa che è più robusto di valutazioni soggettive. Miglioramenti nella quantificazione della crescita dei capelli nei topi miglioreranno studio di modelli alopecia e facilitare la valutazione di promettenti nuove terapie in studi preclinici.

Questa tecnica è stata convalidata utilizzando C3H / HeJ trapiantate, il modello murino di alopecia areata 16. Questi animali sviluppano la perdita di capelli globale che progredisce gradualmente nel tempo. Tuttavia, la perdita dei capelli avviene a chiazze, e può variare da un mouse al successivo, introducendo notevole variabilità e ostacolando valutazioni qualitative. Questo modello ha fornito l&#39;occasione per testare le correlazioni tra misurazioni della densità ottica in diversi punti il ​​mouse come un giudizio di validità. La prima domanda è stata se le misure usando diverse esposizioni, variazioni di ROI di demarcazione, e il ROI di da aree che non si sovrappongono sul erano correlate stesso mouse. C&#39;è stata una correlazione significativa (p &lt;0,0001) visto confrontando ROI definita da standard ovali rettangolari vs. sulla superficie dorsale del mouse (Figura 4A). Allo stesso modo elevate correlazioni sono stati visti in diversi siti sull&#39;animale ea diffeaffittare livelli di esposizione (non illustrato). Ciò indica un elevato grado di precisione in queste misurazioni. C&#39;è stata anche una significativa correlazione tra assorbimento a F-stop 2.0 vs. 1.2 sulla superficie dorsale della schiena utilizzando ROI rettangolari (p &lt;0,0001, Figura 4B). Una correlazione significativa è stata osservata anche quando si confrontano le misurazioni di assorbimento tra la dorsale e superficie ventrale del mouse stesso (p &lt;0,0001, Figura 4C). Questi dati forniscono la prova che le misure di assorbimento prelevati da siti differenti sullo stesso animale sono correlati, come previsto nel C3H / HeJ innestato modello di topo, e queste correlazioni restano lineare in una vasta gamma di perdita di capelli. Questo aiuta a stabilire la validità delle misure in scala di grigi e stabilisce anche la robustezza di questa tecnica alle variazioni di acquisizione delle immagini e la tecnica di analisi. La seconda domanda è se vi sia coerenza tra le misure seriali presi dalo stesso animale a tempi diversi. Per valutare questo, le immagini sono state ottenute delle C3H / HeJ innestato topi su base settimanale per 3 settimane. Il C3H / mouse HeJ innestato ci si aspetterebbe per visualizzare la perdita di capelli graduale su questo tempo. Analisi Scala di grigi sulla superficie ventrale (regione toracica, ROI scatolare) mostrava questa perdita di capelli attesa, con costante tendenza decrescente da un punto temporale al successivo (Figura 5). Da notare, solo l&#39;80% dei C3H / HeJ topi engrafted mostrano la perdita di capelli, e quelli con i più alti valori di scala di grigi non mostrano questo declino, anzi presentano risultati costanti in tutto il periodo sperimentale. Questa coerenza della misura in animali senza perdita dei capelli è stato verificato anche in C57BL / 6 del mouse 19. La stessa analisi effettuata sulla regione coscia della superficie ventrale e sulla superficie dorsale ha mostrato risultati simili nel tempo (non mostrato). Con questi risultati incoraggianti di applicazione di questa tecnica in C3H / HeJ innestato animali,ulteriori indagini sono state condotte in un modello animale diverso, uno di alopecia indotta da chemioterapia. C57BL / 6 topi che ricevono 3 corsi settimanali di ciclofosfamide sarà variabile svilupperà diradamento dei capelli globale e depigmentazione. La tecnica di analisi in scala di grigi qui descritta è stata utilizzata per quantificare questi cambiamenti, e di valutare la risposta agli interventi terapeutici 17. In questo modello, l&#39;analisi in scala di grigi si è rivelato uno strumento potente nel fornire valutazioni quantitative dei cambiamenti indotti dalla chemioterapia in pelo, e permesso la verifica degli effetti del trattamento per l&#39;analisi statistica. In un altro modello di chemioterapia alopecia, ci sono stati problemi particolari in utilizzando questa analisi in scala di grigi. In questo modello, gli animali vengono spalmati sulla superficie dorsale per sincronizzare i follicoli piliferi, quindi trattati con una singola dose di ciclofosfamide dopo 9 giorni, quando i follicoli piliferi sono entrati fase anagen VI e sono massimamente sensibile a chemioterapici 18. La ceraregione è la regione di interesse per lo studio, ma la zona della ceretta potrebbe essere di dimensione variabile. Limitare il ROI per all&#39;interno della regione cerata consente di quantificare sia la perdita e la ricrescita dei capelli dopo la somministrazione di ciclofosfamide 19. Inoltre, la tecnica consente una valutazione accurata delle differenze di dose-dipendente in risposta al trattamento di una terapia sperimentale. Questa applicazione illustra i vantaggi di avere flessibilità nel definire la ROI in questa tecnica. Per illustrare ulteriormente l&#39;applicazione di questa tecnica, purché siano un&#39;analisi dei dati ad interim di uno studio in corso in C57BL / 6 utilizzando il protocollo di somministrazione di ciclofosfamide settimanale sopra indicato. 8 settimane di età topi sono stati trattati con veicolo o 50 mg / kg / sett ciclofosfamide per 3 settimane. Topi trattati con chemioterapia ha mostrato la perdita di capelli dall&#39;aspetto dopo 2 mesi, mentre gli animali di veicoli trattati avevano un normale mantello (Figura 6A). Analisi Scala di grigi era performata come sopra indicato, mostrando significativa (p &lt;0.05) differenza tra topi chemioterapia e comandi del veicolo (Figura 6B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig1highres.jpg" /> Figura 1: vista lordo delle variazioni di capelli sulla dorsale e superficie ventrale C3H / HeJ innestato topi, il modello murino di alopecia areata noti gli animali sviluppano la perdita di capelli globale che progredisce gradualmente nel tempo vista (A) dorsale, con delimitazione rappresentante.. di regioni di interesse (ROI) per l&#39;analisi in scala di grigi, ovale o rettangolare, come indicato. (B) Vista ventrale con diverse regioni di interesse per l&#39;analisi in scala di grigi in petto, corrispondenti ad un&#39;area ungroomed, o la coscia, corrispondenti ad un&#39;area curato. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig2highres.jpg" wIDþ = &quot;450&quot; ​​/&gt; Figura 2:.. Livello di pixel su analisi in scala di grigi rispetto al numero di serie del Tiffen grafico Uno standard di Tiffen è stato fotografato su un imager gel a gli F-stop indicati (A) grafico di livello Pixel rispetto al numero di Tiffen, mostrando atteso rapporto logaritmica (B. ) trasformazione logaritmica, in questa gamma continua a seguire una relazione non lineare. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig3highres.jpg" width="450" /> Figura 3:. Livello di pixel in scala di grigi rispetto all&#39;analisi F-stop chart Uno standard di Tiffen è stato fotografato su un imager gel a gli F-stop indicati. Tracciati sono le variazioni del livello di pixel visti per diversi standard di Tiffen diversi vs F-stop. Si noti che le linee non sono parallele, che indica che le correzioni di allineare gli standard tra photograPHS devono essere calcolati singolarmente per ciascuna regione di interesse. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig4highres.jpg" width="450" /> Figura 4:. Correlazione tra diverse tecniche e regioni di interesse fotografiche in scala di grigi di analisi riportati sono correlazioni tra le tecniche di misurazione indicati prese dalla stessa C3H / HeJ innestato mouse allo stesso tempo punto (A) Correlazione di rettangolo vs. regione ovale. interessi sulla vista dorsale. (B) Correlazione di F fermare 2.0 vs. 1.2 utilizzando un&#39;area rettangolare di interesse. (C) Correlazione dei valori in scala di grigi da vista dorsale e ventrale, un&#39;area rettangolare di interesse. Tutti correlazioni erano statisticamente significative come determinato mediante analisi di regressione lineare (p &lt;0,0001). <img alt="Figura 5" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52185 / 52185fig5highres.jpg&quot; width = &quot;550&quot; /&gt; Figura 5: corso Tempo di cambiamenti in assorbimento utilizzando l&#39;analisi in scala di grigi in C3H / HeJ innestato topi colori indicano le misurazioni seriali da singoli topi.. Nota la consistenza per ogni mouse da un punto temporale al successivo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig6highres.jpg" /> Figura 6:.. Analisi in scala di grigi indotta da chemioterapia alopecia 6 settimane topi C57BL6 / J sono stati trattati con veicolo (N = 6) o 3 dosi settimanali di ciclofosfamide (50 mg / kg) (N = 6) (A) gruppo rappresentativo di 3 topi di ciascuno dei gruppi di trattamento, fotografato 2 mesi dopo l&#39;inizio della chemioterapia. (B) i dati compilati da analisi in scala di grigi da ciascun gruppo, mostrando una diminuzione di assorbimento con somministrazione di ciclofosfamide (p &lt;0.05). Si noti la correlazione tra i capelli visibiliperdita di pannello A e una riduzione statisticamente significativa in assorbimento nel pannello B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> Valori di assorbimento sono i seguenti: </td></tr><tr><td> Fotografia </td><td> F-stop </td><td> ROI </td><td> Assorbimento </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> Standard </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> ROI-1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> ROI-2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 3 </td><td> Standard </td><td> 150 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 3 </td><td> ROI-1 </td><td> 160 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 3 </td><td> ROI-2 </td><td> 230 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2 </td><td> Standard </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2 </td><td> ROI-1 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2 </td><td> ROI-2 </td><td> 210 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3 </td><td> Standard </td><td> 160 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3 </td><td> ROI-1 </td><td> 170 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3 </td><td> ROI-2 </td><td> 235 </td></tr><tr><td colspan="4"> Lettura F-Stop scelto come 2.0, Riferimento F-Stop scelto come 3.0. </td></tr><tr><td colspan="4"> Riferimento Valore standard (RSV) = medio di assorbimento di norma dal 1 fotografia e fotografia 2 a F-stop 2.0, RSV = media (90, 110) = 100 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> Per fotografia 1: </td></tr><tr><td colspan="4"> Delta-S = 150-90 = 60 </td></tr><tr><td colspan="4"> Delta-ROI-1 = 160-100 = 60 </td></tr><tr><td colspan="4"> Delta-ROI-2 = 230-200 = 30 </td></tr><tr><td colspan="4"> Assorbimento corretto per il ROI-1 = 100 + (100 - 90) * (60/60) = 110 </td></tr><tr><td colspan = &quot;4&quot;&gt; assorbimento corretto per il ROI-2 = 200 + (100 - 90) * (30/60) = 205 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> Per fotografia 2: </td></tr><tr><td colspan="4"> Delta-S = 160-110 = 50 </td></tr><tr><td colspan="4"> Delta-ROI-1 = 170-120 = 50 </td></tr><tr><td colspan="4"> Delta-ROI-2 = 235-210 = 25 </td></tr><tr><td colspan="4"> Assorbimento corretto per il ROI-1 = 120 + (100 - 110) * (50/50) = 110 </td></tr><tr><td colspan="4"> Assorbimento corretto per il ROI-2 = 210 + (100 - 110) * (25/50) = 205 </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Esempio di calcolo per correggere le differenze di esposizione tra fotografie La tabella mostra un esempio di come per compensare piccole differenze di assorbimento degli standard tra fotografie (step opzionale 3.2).

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A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

a-new-technique-for-quantitative-analysis-hair-loss-mice-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.9K Views.  Children's Hospital at Montefiore. Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Video: A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Ricerca

Neuroscienze

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Bioluminescenza-Based Metodo Tumore quantificazione per il monitoraggio del tumore Progressione e gli effetti del trattamento in modelli murini linfoma

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

Medicina

Analysis of Craniomaxillofacial Malformations in Mice Using Three-dimensional Microcomputed Tomography

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to specifically inhibit RAR transcriptional activity in mice. This approach allowed us to investigate the effects of VAD on cranial hypomineralization, mandibular deformity, and clavicular hypoplasia in clinical cases. In this study, microcomputed tomography (microCT) scanning of the craniomaxillofacial region of mice represented a valuable tool for studying the growth and development of this animal model. The manual estimation of images is both time-consuming and inaccurate. Hence, here, we present a straightforward, efficient, and accurate approach for segmenting and quantifying the microCT images of each craniomaxillofacial bone. MicroCT software was used to slice the mandible, frontal bone, parietal bone, nasal bone, premaxilla, maxilla, interparietal bone, and occipital bone of mice and measure their corresponding lengths and widths. This segmentation method can be applied to study growth and development in developmental biology, biomedicine, and other related sciences and allows researchers to analyze the effects of genetic mutations on individual craniofacial bones.

Here, we describe in depth a method, which is based on microcomputed tomography, to segment and measure 3D models of craniomaxillofacial bones in mice, for better assessment of craniomaxillofacial bone development in mice than what is possible with current methods.

Analisi delle malformazioni craniomaxillo-facciali nei topi mediante tomografia microcomputerizzata tridimensionale

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to ...

Biologia dello sviluppo

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Biologia

Digital Planimetry for Assessing Wound Closure Kinetics in a Mouse Model

Chronic wounds, due to their high prevalence, are a serious global health concern. Effective therapeutic strategies can significantly accelerate healing, thereby reducing the risk of complications and alleviating the economic burden on healthcare systems. Although numerous experimental studies have investigated wound healing, most rely on qualitative observations or quantitative direct measurements. The objective of this study was to standardize an indirect wound measurement method using digital planimetry, incorporating digital scaling and segmentation. This approach addresses the lack of detailed, step-by-step methodologies for accurate wound assessment. A photodocumentation booth was designed and constructed, and computer-assisted digital planimetry tools were employed to minimize variability in measurements of the wound area, perimeter, and the distance from the wound center to its edges. A circular traumatic wound (5 mm in diameter) was created on the dorsal midline at the shoulder blade level of male CD1 mice (n = 4, 10 weeks old, 30-35 g). Wound evolution was photodocumented for 14 days using the custom-designed photo booth, which controlled lighting conditions, focal distance, and subject positioning. Scaling and wound measurements were performed using segmentation in ImageJ software, and statistical analysis was conducted using statistical analysis software. The kinetics of wound closure showed a slight increase in wound size and perimeter between day 0 and day 2, followed by a gradual decrease until complete closure by day 14. The photodocumentation booth and computer-assisted digital planimetry enabled quantitative measurements with minimal variability. In conclusion, these tools provide a reliable and reproducible method for evaluating wound closure kinetics in pre-clinical models.

Wounds represent a global health challenge. This study developed a standardized photo booth utilizing digital planimetry to minimize wound measurement variability. Monitoring wounds in mice over 14 days revealed an initial increase in wound area and perimeter, followed by gradual closure. This methodology may aid in evaluating wound closure kinetics in pre-clinical models.

Planimetria digitale per la valutazione della cinetica di chiusura della ferita in un modello murino

Chronic wounds, due to their high prevalence, are a serious global health concern. Effective therapeutic strategies can significantly accelerate healing, ...

Bioingegneria

Non-invasive Skeletal Muscle Quantification in Small Animals Using Micro-computed Tomography

Skeletal muscle size, mass, and composition are critical properties for studying metabolic and muscle-related diseases, as they directly impact the understanding of disease progression and treatment outcomes. Quantifying a live animal's lean, adipose, and skeletal mass is important in metabolic, physiology, pharmacologic, and geroscience studies. However, obtaining accurate body composition measurements, especially of lean mass, remains challenging due to the inherent limitations of conventional assessment techniques. Micro-computed tomography (micro-CT) is a non-invasive radiological technique that enables high-resolution visualization of internal structures in small animal models. A standardized micro-CT method can significantly enhance translational research with more reliable and impactful results, particularly during aging studies or at different time points within the same animal. Despite its potential, the lack of standardization in image acquisition and analysis methods significantly hinders the comparability of results across different studies. Herein, we present a comprehensive and detailed low-cost protocol for lean mass analysis using micro-CT to address these challenges and promote consistency in research involving small animal models.

This protocol uses micro-computed tomography to enable the cost-effective quantification of lean mass, including skeletal muscle and visceral tissue, adipose tissue, and skeletal tissue in small animals. It distinguishes between lean and adipose tissue, which offers significant advantages for biomedical research, particularly in translational research in small animals.

Quantificazione non invasiva del muscolo scheletrico in piccoli animali mediante microtomografia computerizzata

Skeletal muscle size, mass, and composition are critical properties for studying metabolic and muscle-related diseases, as they directly impact the ...

Non-Invasive Visualization of Nailbed Microvascular Morphology in Mice Using Capillaroscopy

Imaging microcapillary networks of the skin in humans using nailfold capillaroscopy (NFC) has underscored the importance of microcirculation as a target organ system in critical systemic illnesses. Nailfold capillaroscopy is applied clinically to detect peripheral microvascular dysfunction and abnormalities in a range of systemic conditions, including rheumatic, cardiac, ocular (e.g., glaucoma), and endocrine disorders (e.g., hypertension and diabetes mellitus). NFC is useful not only in detecting peripheral systemic microvasculature disruption but also in assessing drug efficacy. However, translating clinical NFC findings to animal disease models can be challenging. Detecting microvascular dysfunction or abnormalities in animals is often invasive (e.g., endoscopic), carried out ex vivo (e.g., post-mortem imaging of tissues), or expensive, requiring specialized equipment such as those used in microcomputed tomography and photoacoustic imaging techniques. Developing quick, non-invasive, and inexpensive techniques to image peripheral microvasculature in animal models of disease is warranted to decrease research expenses and increase translatability to the clinic.
Capillaroscopy has previously been used to visualize the nailfold microvasculature in animal models, including in guinea pigs and mice, thus demonstrating the capability of capillaroscopy as a non-invasive imaging tool in animal models. This study provides a protocol that applies capillaroscopy to a mouse nailbed, allowing researchers to easily and inexpensively assess the morphology of its microvasculature. Representative images of typical nailbed microvascular architecture in wild-type mice using two commonly used laboratory strains, SV129/S6 and C57/B6J, are provided. Further studies using this method are essential for applying nailbed capillaroscopy to a wide range of mouse disease models with peripheral microvascular abnormalities.

Capillaroscopy is an accessible tool for direct, inexpensive, and non-invasive visualization of microvasculature. The goal of this protocol is to enable researchers to use capillaroscopy for the visualization of peripheral microvascular morphology in the nailbeds of mice.

Visualizzazione non invasiva della morfologia microvascolare del letto ungueale nei topi mediante capillaroscopia

Imaging microcapillary networks of the skin in humans using nailfold capillaroscopy (NFC) has underscored the importance of microcirculation as a target ...

A Technique for Human Skin Grafting in a Mouse Model

Source: Moss, M. I. et al., <a href="https://app.jove.com/v/64040">Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses&#160;In Vivo.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for grafting human skin onto an immunodeficient mouse with a suppressed neutrophil response. The method involves applying human split-thickness skin to the mouse&#39;s graft bed, sealing it, and covering it for recovery. Eventually, the human skin adheres to the mouse&#39;s skin, establishing vascularization and circulation, resulting in a successful skin xenograft.

Una tecnica per l'innesto di pelle umana in un modello murino

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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