Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pela Subcomissão de Investigação Animal Care, que serve como Cuidado e Uso Comitê de animal Institucional (IACUC) para o Hospital Geral de Massachusetts, e estão de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde. 1. animal Habitação e Procedimento Handling <ol><li> Após a chegada, os ratos fêmeas casa adulto Sprague Dawley cerca de 8-10 semanas de idade (pesando 200-225 g) em grupos de caixas de plástico 3-4 polegadas com cama de lascas de madeira. Mantê-los em uma dieta de acesso ad libitum à comida e água e um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz. Deixar ratos para se aclimatar às condições de habitação e de animais facilidade para um mínimo de 1 semana. NOTA: Todos os procedimentos deste manuscrito são realizados durante o ciclo de luz. </li><li> Após este período de aclimatação, lidar com todos os animais durante 5 min cada, para 2-3 dias. Adequadamente pegar a ratos, uma de cada vez (suportado pelo tronco e não pela cauda),mantê-los de forma segura, e acariciá-los durante este tempo. Lidar com os animais que aparecem mais estressado, nervoso ou ansioso por longos períodos de tempo. Faça isso para minimizar a lidar com o estresse, o que pode afetar os seguintes passos neste protocolo. NOTA: O número de dias e quantidade de tempo lidar com os animais pode variar entre diferentes laboratórios; no entanto, estes devem ser coerentes entre os experimentos dentro do mesmo laboratório. </li></ol> 2. Monitorização do ciclo estral: Vaginal Swab Manchas e Procedimento de coloração <ol><li> Adicione solução salina a 0,9% (cloreto de sódio dissolvido em água destilada). Umedeça um aplicador com ponta de algodão nesta solução. Blot a ponta usando uma toalha de papel para evitar a saturação excessiva, o que poderia levar a coleta de amostra insuficiente ou perda de células. Segurando a cauda para cima longe da abertura vaginal, insira suavemente a ponta de algodão dentro do canal vaginal e rolar em torno das paredes para capturar células vaginais soltos. </li><li> Se o animal urina na camaponta ton, substitua-o por um novo, como a contaminação da urina irá tornar mais difícil para a identificação de fase. Tenha muito cuidado para não causar sofrimento ao animal durante este procedimento, porque a exposição ao estresse vai interromper o ciclo estral. Ao recolher amostras, visam alcançar uma inserção rápida e retirada que não é muito profundo como para minimizar o estímulo extra para o colo do útero, o que pode induzir a pseudociese. NOTA: pseudogestação pode ser identificado como um ciclo estral acíclicos que tipicamente dura cerca de 12 dias, isto é, dias consecutivos de diestro 25. </li><li> Retire com cuidado a ponta do aplicador e enrolá-lo sobre uma lâmina de microscópio pré-rotulados. Evite pressioná muito difícil como muito líquido no slide pode fazer identificação de fase difícil, uma vez seco. NOTA: Um slide pode conter vários dias para cada animal, embora isso possa ser feito de acordo com as preferências individuais. </li><li> Certifique-se que as transferências de amostra para o slide. Coleta de amostras para Several dias consecutivos em uma lâmina para ser capaz de melhor acompanhar e identificar fases estral diárias alterações. NOTA: Se possível, também é ideal se as pessoas que coletam amostras de continuar a ser a mesma para todos os animais. </li><li> Uma vez que a lâmina é seco, comece o protocolo de coloração para a identificação da fase. Usando o kit de coloração (ver Tabela de Materiais), mergulhar slides de 10 vezes no fixador (azul claro), 10 vezes em solução corante (cor de rosa), e 5 vezes em solução counterstain (roxo). Lavar as lâminas com cuidado em água corrente. Vamos lâminas completamente ar seco antes de ver ao microscópio. NOTA: O longo ciclo estral tipicamente 4-5 dias consiste de (nesta ordem): estro (E), metaestro (M), diestro (D), e proestro 26 (P). O estro é caracterizado por células azuis, cornificado, metaestro por leucócitos e uma combinação de células cornificadas e nucleadas, diestro é semelhante ao metaestro na presença de tipos de células excepto eles são muito escassos, e por agregados proestro roxo-coradascélulas de nucleadas (Figura 1). Existem vários procedimentos de coloração, em adição às descritas acima, que são igualmente eficazes para citologia vaginal esfregaço. </li><li> Recolha de amostras para, pelo menos, dois ciclos completos (~ 8-10 dias), a fim de controlar com precisão as fases antes da experimentação. Seja consistente com a hora do dia da colheita de amostras. Coletar amostras de esfregaço vaginal diariamente durante e até o final do experimento. </li></ol> 3. Pré-exposição <ol><li> Antes do início do experimento, pré-expor os animais ao condicionamento câmaras que os animais possam se adaptar ao contexto (câmaras de condicionamento) antes de qualquer teste comportamental. <ol><li> Pré-expor as fêmeas para as câmaras de condicionamento (localizados em caixas atenuantes de sons), com as luzes da casa por 20-30 min por dia durante 3 dias antes de qualquer experimentação. Atribuir a caixa eles são pré-expostos a como a sua câmara para o estudo. Limpe bem tele caixas (paredes e bandejas) entre as sessões e animais para remover os odores, pois podem afetar o comportamento e ciclo estral. </li></ol></li></ol> 4. Dia 1: Habituação / Medo Condicionado <ol><li> Uma vez que os animais tenham sido verificada na fase do estro dos seus ciclos estrais, começar a fase de habituação / condicionamento da experiência de 3 dias. <ol><li> Tome pré-tom medidas iniciais de congelamento prévio para o estímulo condicionado primeiro tom (CS) apresentações em cada dia do experimento. Faça isso por meio da aquisição pontuações por cento de congelamento (calculado dividindo o segundos gastos imóvel pela duração do julgamento, multiplicado por 100) durante o intervalo de tempo de estímulo ausente no início do primeiro julgamento CS-alone antes do início CS. NOTA: Estas medidas podem ser usados ​​para avaliar e comparar os níveis de congelamento da linha de base com aquelas durante habituação, condicionado, extinção, e recall. </li><li> Para realizar o treinamento extinção durante a fase de metaestro,condicionar os ratos no seu último dia de estro. Swab e identificar fase de estro (passo 2) todos os dias antes de iniciar o protocolo experimental (condicionado / extinção / chamada). Como a fase do cio pode durar mais de um dia, o uso história ciclo de prever duração das fases para determinar quando os animais estão prontos para começar a treinar. </li></ol></li><li> Nas câmaras condicionado, ligue o chão grade pé-choque para um gerador de estimulação elétrica. Usar um nível de estimulação de 0,5-0,6 mA como o estímulo não condicionado (US). Use um kHz 4, 80 dB tom como o estímulo condicionado (CS). NOTA: Estes parâmetros podem variar entre laboratórios e podem ser modificados para o condicionamento ideal. <ol><li> Se o programa de análise de congelação requer sinais visuais (em oposição a temporal), co-activar uma luz LED com o tom. Posicionar a luz do lado de fora da câmara operante, dentro do quadro de vídeo. No início de cada ensaio, activar o diodo emissor de luz iluminada e mantê-lo até que a extremidade do the julgamento. NOTA: Esta luz não é visível pelo animal e serve apenas como um marcador para o início e final do julgamento dentro dos arquivos de vídeo gravados (a ser usado para medir o comportamento de congelamento). </li></ol></li><li> Coloque os animais para dentro das câmaras de condicionamento para 5 ensaios CS-alone de habituação. Imediatamente após a sessão de habituação, executar 7 ensaios CS-americanas de medo condicionado emparelhados. Certifique-se de que o tom CS tem a duração de 30 segundos e coterminates com o choque sec US 0,5. Ensaios são executados em todas as sessões (habituação, condicionado, extinção, e de recall), com um intervalo entre variável média de 3 minutos. </li><li> No fim da sessão de condicionamento, os animais regressar às suas gaiolas de alojamento e à instalação para animais até ao dia seguinte. </li></ol> 5. Dia 2: Estradiol Preparação <ol><li> Swab e identificar a fase de estro para todos os animais que foram submetidos Dia 1 do presente protocolo. Prepare o estradiol (também conhecida como E2, 17beta-estradiol, oubeta-estradiol) para a 15 ug / kg de dose de injecção subcutânea utilizando óleo de sésamo ou de 0,9% solução salina como veículo. </li><li> Para calcular a quantidade de estradiol para se preparar para injeções, use os pesos corporais de todos os animais, que foram medidos e registados quando eles foram condicionados no dia 1 deste protocolo. </li><li> Faça os cálculos para padronizar o volume administrado de estradiol (ou seja, 0,2 ml) por rato. Dado que o estradiol é de difícil dissolução, devido à sua insolubilidade em água e requer um grande volume de solvente para a dose pequena, preparar uma solução de reserva por mistura de estradiol em óleo de sésamo sobre o calor até se dissolver. A solução pode então ser passada através de um filtro de 0,22 um, para remover contaminantes. Por exemplo, adicionar um volume calculado de a / 1 ml de solução de óleo de sésamo 3,000 ug de estradiol para o volume total necessário de óleo de sésamo, a fim de atingir um 15 ug / kg num volume de 0,2 ml injecção por animal. NOTA: Como alternativa, utilizar outras formas de estrogênio tha<html> t são solúveis em água e mais fácil de dissolver. </li></ol> 6. Dia 2: Administração Estradiol / Formação Extinction <ol><li> Administrar o estradiol subcutaneamente. Levante a pele solta entre a escápula pelo pescoço em uma pitada suave e inserir a agulha da seringa no triângulo que é formada pelas dobras. </li><li> 30 minutos após as injecções subcutâneas de estradiol, colocar os animais nas câmaras de condicionamento e de novo começar a formação de extinção. Nesta sessão extinção, realizar 20 CS-alone ensaios, com cada ensaio que consiste em um 30 seg, 4 kHz, 80 tom dB, apresentado em um intervalo entre variável média de 3 min. NOTA: O efeito do estradiol na recordação ocorre quando o estradiol é administrado antes da formação extinção ou imediatamente após a extinção. O efeito não é observado 4 horas após a extinção, por isso é recomendado para injetar próximo da hora de início ou no final da sessão de treinamento 15. </li></ol>. le &quot;&gt; 7 Day 3: Extinction recall <ol><li> 24 horas após o treinamento extinção, pincelar os animais que Dia 1 e 2 do presente protocolo concluídas. </li><li> Coloque os animais em suas câmaras de condicionamento atribuídos (o mesmo que o dia 1 e 2). Inicie a sessão recordação extinção, apresentando 3 CS-alone ensaios (os três ensaios de recordação extinção), que consiste de apenas 3,80 dB CS-alone ensaios com intervalos entre tentativas semelhantes às 20 ensaios administrados para o treinamento extinção como descrito no passo 6.2. </li><li> Após a conclusão da sessão de recall, retornar os animais para suas gaiolas. </li></ol> Análise 8. Dados <ol><li> Adquirir dados comportamentais através de vídeo e analisá-los utilizando programas de computador. NOTA: Congelamento pontuações também podem ser contadas manualmente por um experimentador que é cego para o tratamento medicamentoso cronometrando episódios de congelamento durante a apresentação CS de cada julgamento, expresso em percentagem do tempo gasto congelamento durante o tom. O congelamento édefinido pela completa falta de movimento, com excepção da respiração durante os ensaios 30 sec CS-americanos. Calcule por cento congelamento dividindo os segundos gastos congelamento (imóvel) por 30 segundos (duração do julgamento) multiplicado por 100. </li></ol>

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Os autores deste manuscrito não tem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse a divulgar.

Extinção do medo tem sido extensivamente estudada em ratos machos com os mecanismos neurais que medeiam extinção medo condicionado identificados e avaliados sob várias manipulações. Relativamente poucos estudos analisaram ratas ou o papel das hormonas sexuais na extinção do medo. Para estudar especificamente os efeitos do estrogénio sobre a extinção do medo, naturalmente ciclagem ratas são submetidos a um paradigma comportamental de três dias. Este procedimento consiste em fases habituação / condicionado...

Diferenças sexuais inerentes são observados em vários comportamentos cognitivos e paradigmas de aprendizagem em humanos e roedores. Por exemplo, foi relatado que as mulheres geralmente têm habilidades verbais e orientada para o detalhe mais fortes, enquanto os homens têm melhores habilidades espaciais 1-3. Estas diferenças entre os sexos pode ser em parte devido à influência dos hormônios sexuais. Altos níveis de estradiol melhorar o desempenho em tarefas em que as mulheres são melhores, mas pioram o desempenho em tarefas que os homens geralmente fazem bem 4-6. Embora esta evidência é convincente, a capacidade limitada de controlar completamente ambientes experimentais em estudos humanos torna difícil determinar se esses efeitos sobre o comportamento pode ser atribuído especificamente aos hormônios. Os estudos em animais, em contraste, permite a circunstâncias totalmente controladas. Embora os mecanismos neurais básicos de extinção do medo, foram identificados e são bem estudada em machos, não é claro seestes sistemas são os mesmos em fêmeas ou como eles mudam ao longo do ciclo estral. O condicionamento do medo e extinção são amplamente utilizados paradigmas comportamentais em roedores e humanos para realizar estudos relacionados a transtornos de ansiedade. Dado que as mulheres têm um maior risco de transtornos de ansiedade, bem como a duração dos sintomas e a gravidade maior 7-13, é crítico para incluir fêmeas nestes estudos. A sub-representação das mulheres na pesquisa pode ser atribuída aos desafios de monitoramento fase de estro e contábil para os efeitos comportamentais de hormônios sexuais. Laboratórios que fazem examinar fêmeas nesta problemas encontro em conta que muitas vezes passam não declarada ou não estão descritos nos métodos para seus estudos. Emergentes evidência em roedores sugere que as diferenças sexuais em extinção do medo são modulados por hormonas sexuais 14-18. Com medo condicionado, os animais são treinados para temer um estímulo particular. Depois de uma série de apresentações de unreinforcedo estímulo, os animais aprendem a não temer a sugestão, um processo chamado de extinção. Como bem o animal aprende e consolida a memória de aprender esta tarefa pode ser observado durante um teste de recordação extinção dado algum tempo após o treinamento extinção. Menos expressão medo durante a chamada extinção demonstra boa consolidação da memória extinção. Descobertas recentes de nosso laboratório sugerem que o estrogênio pode modular a consolidação da memória de extinção do medo e melhorar a recordação extinção. Especificamente, os ratos fêmeas que são extintas em proestro, a fase do ciclo estral, durante o qual os níveis circulantes de estrogênio pico, apresentam uma melhor retenção de memória extinção. Em contraste, as mulheres que se extinguem no visor fase metaestro baixo estrogênio relativamente pobre recordação extinção, o que pode ser melhorado com a administração de estradiol exógeno antes ou imediatamente após o treino extinção 15,16. Os mecanismos neurais da extinção consolidação da memória (including o papel dos hormônios sexuais) em fêmeas não são claras. Em animais de laboratório, o papel dos hormônios pode ser investigado utilizando procedimentos de remoção cirúrgicos invasivos, como a castração e ooforectomia. Após a recuperação da cirurgia, os hormônios sexuais são frequentemente exogenamente manipulada durante a realização de uma tarefa comportamental 19. Esta abordagem tem fornecido informações importantes sobre os hormônios sexuais e é útil porque permite manipulações bem controlados de hormônios sexuais (em termos de tempo e dose) 20-23. Esta abordagem, no entanto, não se avaliar a influência das flutuações naturais que ocorrem em todo o ciclo estral nem representam animais &quot;normais&quot;, limitando assim o potencial de translação para estudos em seres humanos. Tem sido bem documentado que os níveis das hormonas sexuais femininas pico e declínio em fases específicas do ciclo estral, e as alterações de expressão de receptor de estrogénio no ciclo, ae 24 após a ovariectomia. Assim, existe a necessidade de realizar estudos sobre as fêmeas com gônadas intactas e refinar modelos experimentais para estudar com segurança os efeitos que os estados altos e baixos de estrogênio pode ter sobre as mulheres ao longo da sua vida útil. Este protocolo incide sobre o efeito do estrogênio sobre os sistemas neurobiológicos envolvidos na extinção do medo. Ele descreve como: 1) monitorar cuidadosamente o ciclo estral, 2) preparar as doses eficazes de estradiol para administração sistêmica, e 3) seguem um paradigma comportamental que inclui o condicionamento do medo, extinção, e recordar na naturalmente ciclismo ratas. Este protocolo pode ser modificado com outras manipulações farmacológicas e ferramentas celulares e moleculares para auxiliar estudos para compreender melhor as diferenças de sexo que são observados no medo condicionado comportamento extinção. Note-se que os procedimentos descritos abaixo são aqueles utilizados no nosso laboratório, e existe uma série de variações destes procedimentos in literatura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="613">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog number</td>
			<td style="width:199px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Fear conditioning chamber</td>
			<td style="width:159px;">Coulbourn Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Graphic State</td>
			<td style="width:159px;">Coulbourn Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Sound-attenuating box</td>
			<td style="width:159px;">Med Associates, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">NIR-022MD</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Estradiol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E1024</td>
			<td style="width:199px;">In sesame oil for subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Sesame oil</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S3547-250ML</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Freezescan</td>
			<td style="width:159px;">Cleversys, Inc.</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Dip quick stain</td>
			<td style="width:159px;">Jorgensen Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">J0322A1, J0322A2, J0322A3</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">23-400-114</td>
			<td style="width:199px;">6-inch, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">0.9% saline</td>
			<td style="width:159px;">LabChem, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">LC23460-2</td>
			<td style="width:199px;">Sodium chloride w/v</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Selectfrost microscope slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-550-003</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Virex II 256</td>
			<td style="width:159px;">Diversey, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">5019317</td>
			<td style="width:199px;">Dilute 1:256 with water</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Luer-Lok Tip 1ml Syringes</td>
			<td style="width:159px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:135px;">309628</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:120px;">Hypodermic disposable needles</td>
			<td style="width:159px;">Exelint International, Co.</td>
			<td style="width:135px;">26402</td>
			<td style="width:199px;">26-gauge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats

A extinção do medo condicionado tem sido extensivamente estudada em roedores machos. Recentemente, tem havido um número crescente de estudos que indicam que os mecanismos neurais para certas tarefas comportamentais e comportamentos de resposta são diferentes em fêmeas e machos. Usando fêmeas em estudos de pesquisa pode representar um desafio por causa da variação de hormônios sexuais durante o ciclo estral. Este protocolo descreve procedimentos bem estabelecidos que são úteis para investigar o papel do estrogénio na extinção medo a consolidação da memória em ratos fêmeas. Fase do ciclo estral e administração de estrogênio exógeno antes do treino extinção pode influenciar recordação extinção 24 horas mais tarde. A técnica de swab vaginal para identificação fase de estro descrito aqui ajuda o exame e manipulação de ciclismo naturalmente hormônios sexuais. O uso deste modelo básico roedor pode delimitar melhor os mecanismos pelos quais o estrogênio podem modular memória extinção do medo emfêmeas.

Neste protocolo recordação extinção do medo, por cento congelamento foi medida como um indicador do medo. Animais que extinguiu bem e retidos a memória da formação extinção exibiu baixa medo no último dia do teste comportamental durante a chamada extinção. Ratos machos e fêmeas não apresentam diferenças significativas na expressão de medo condicionado durante o condicionamento, extinção, e recordar as fases (Figura 2). No entanto, a diferença entre os sexos se torna evidente quando os...

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Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Protocolo de Estudos de Extinção do medo condicionado em Naturally Ciclismo ratas

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

protocol-for-studying-extinction-conditioned-fear-naturally-cycling

Research

JoVE Journal

Behavior

13.1K visualizações.  Massachusetts General Hospital. Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.