Gostaríamos de agradecer a Michaela Jansen no Centro de Ciências da Saúde da Universidade Texas Tech, Lubbock, TX e Mladen Yovchev na Universidade de Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA para o generosamente fornecer pcDNA 3.1 myc-His (A) e hEF1α promotor contendo plasmídeos . Research informou nesta publicação foi apoiada pelo Kennedy Shriver Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano dos Institutos Nacionais de Saúde Eunice sob o número prêmio R01HD037109 (a CCM). Suporte adicional foi do Instituto Bush, Laura W. de Saúde da Mulher (para CCM e PNG). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health. Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

In Silico 1. Concepção do plasmídeo e Geração dos iniciadores sobrepostos NOTA: O objectivo deste passo é o de montar sequência de nucleótidos completa da construção e conceber os iniciadores para ser utilizada para gerar fragmentos com extremidades sobrepostas para GA clonagem. <ol><li> Projete uma sequência de nucleotídeos contínua para representar o plasmídeo final. </li><li> Obter ou listar os plasmídeos reais e os fragmentos de ADN que vão ser utilizadas como moldes em PCR. NOTA: fragmentos de DNA que não estão prontamente disponíveis - como a combinação de diferentes marcas e promotores - pode ser encomendado como um único ou vários fragmentos sintéticos de cadeia dupla de DNA (DNAs). Estes fragmentos estão comercialmente disponíveis a custo relativamente baixo e pode ser de até 2 kb de comprimento (ver Tabela de Materiais). </li><li> Dividir a sequência de nucleótidos da construção contínua montado na etapa 1.1 em fragmentos de DNA adequados para a PCR. Confirm que os fragmentos corresponder plasmídeos disponíveis e fragmentos DNAs. Evitar os fragmentos de DNA menores do que 200 nt. </li><li> Acesse a ferramenta de geração de primer (ver Tabela de Equipamentos). Selecione o menu &quot;Definir preferências&quot;. Escolha as configurações apropriadas, clicando na aba &quot;MUDANÇA PREFS&quot; na janela pop-up &quot;Alterar configurações de montagem Gibson&quot;. NOTA: Primer desenho também pode ser realizada sem a utilização da ferramenta de geração de iniciador. No entanto, a utilização da ferramenta de geração de iniciador simplifica o processo. </li><li> Comece a construir a construção, selecionando o menu &quot;Build Construct&quot;. Insira os fragmentos de DNA de divisão no sequencialmente ferramenta de geração de iniciador de 5 &#39;para 3&#39;. NOTA: O fragmento de ADN utilizado como uma espinha dorsal de plasmídeo pode ser convenientemente dividido em duas partes. No produto final de PCR &#39;final deste primeiro fragmento e a 3&#39; da extremidade 5 do último fragmento são ligados entre si num DN contínuaUm fragmento representando o esqueleto do vector. </li><li> Cole o primeiro fragmento de DNA que representa a extremidade 5 &#39;do DNA vetor no formato FASTA (uma representação baseada em texto de sequência de nucleotídeos) na janela pop-up &quot;Enter Vector ou Insert Fragment&quot;. Nomeie o fragmento de DNA. Escolha a forma adequada para obter o fragmento de DNA, quer como PCR, RE Digest ou Synthesis. Clique na aba &quot;Continuar&quot;. </li><li> Se houver a necessidade de acrescentar nucleotídeos extra / sítios de restrição na junção da construção final utilizar os espaços &quot;espaçador Fwd ou Rev cartilha&quot;, previsto no &quot;Adicionar um fragmento de inserção para a montagem&quot; janela. Adicionar nucleótidos extra / locais de restrição para apenas um dos fragmentos de DNA e não para ambos os fragmentos. Clique na aba &quot;DONE&quot;. </li><li> Repetir para todos os fragmentos até que a construção esteja completa. Selecione o menu &quot;Ver Primers&quot; e rever as seqüências de primers. </li><li> Repita o procedimento para todas as construções (vector backbones e pastilhas), ou para fragmentos de ADN que são diferentes. </li></ol> 2. Amplificação dos fragmentos de ADN por PCR Utilizando Hot Start Revisão ADN Polimerase (2x Master Mix) NOTA: O objectivo deste passo é obter ADN suficiente para a reacção de PCR usando a montagem. <ol><li> Compre os iniciadores de PCR concebidos no passo anterior como produtos dessalinizada e na menor escala possível. Dilui-se-lhes a 10 uM em água ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,9, EDTA 1 mM). </li><li> Comprar fragmentos de DNA que não estão prontamente disponíveis como fragmentos de DNAs. </li><li> Dilui-se todos os fragmentos de ADN, incluindo os fragmentos de DNAs que serão usados ​​como moldes para as PCRs para 1 ng / mL em água. </li><li> Montar as reacções de PCR à temperatura ambiente. Resumidamente, usar 2,5 ul (10 uM de solução de reserva) da respectiva cada iniciador do par de iniciadores, 1 ul (solução a partir de 1 ng / ul de estoque) do fragmento de ADN molde, 25 μl de polimerase quente revisão início DNA (DNA pol; 2x mix mestre; consulte a Tabela de Materiais) e 19 mL de água. Misture o tubo através de um toque suave e recolher as gotículas de líquido por centrifugação breve. </li><li> Amplificar simultaneamente em tubos separados fragmentos de DNA de tamanho similar de acordo com as recomendações para a pol DNA. Realizar 25-28 ciclos de PCR ou determinar o número de ciclos que produzem um rendimento de ADN suficiente. </li><li> Executar 10% do volume de reacção de PCR (5 ul) numa electroforese em gel de agarose padrão manchado com brometo de etídio (0,2 ug / ml de concentração final). Assegure-se que uma única banda de ADN que representa o produto de PCR é visível. Determinar o tamanho e quantidade relativa dos fragmentos de ADN utilizando ADN padrões de peso molecular. Se necessário, repetir a PCR para se obter uma quantidade suficiente de fragmentos de ADN. </li></ol> 3. Dpnl digestão dos produtos de PCR NOTA: O objetivo deste passo é Diger plasmídeo residual molde de ADN a partir dos PCRs na Secção 2. Dpnl irá digerir o ADN plasmídeo somente se é metilado, tal como ocorre ao plasmídeo de ADN cultivadas em barragem + estirpes bacterianas. Portanto, não se tratar com Dpnl ADN plasmídeo será utilizado como um fragmento de ADN na reacção GA. <ol><li> Adicionar 2 ul da enzima de restrição Dpnl para os 45 ul dos produtos de PCR produzidos na Secção 2. Incubar a 37 ° C durante 1 h. Prossiga com o ponto 4 ou congelar a -20 ° C até ser necessário. </li></ol> 4. purificação e concentração dos fragmentos de DNA sobre DNA Purificação esferas magnéticas NOTA: O objectivo deste passo é o de purificar e concentrar os produtos de PCR obtidos nos pontos 2 e 3. Outros métodos de purificação de PCR podem ser usados ​​também. <ol><li> Equilibrar a purificação DNA esferas magnéticas à temperatura ambiente. Re-suspender as contas por breve vortex. </li><li> Transfira os PCRs wi pré-digeridoth Dpnl para a tubos de 1,5 ml e adicionar 81 uL de pérolas magnéticas de purificação do ADN para cada tubo. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Colocar os tubos no colector magnético durante cerca de 2 min. Descartar o líquido limpo usando uma pipeta. Lavar duas vezes com 200 ul de etanol a 80% durante 30 segundos. </li><li> Permitir que as pelotas para secar. Manter a tampa aberta dos tubos, com os tubos posicionados no colector magnético. </li><li> Re-suspender as pérolas secas em 10 ul de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Girar rapidamente para recolher o líquido, na parte inferior dos tubos. </li><li> Posicionar os tubos sobre o colector magnético durante 2 min. Remover 8,5-10 ul da solução límpida e introduzi-la num tubo novo pré-rotulados. Determinar a concentração dos fragmentos de DNA por espectroscopia de UV (ver Tabela de equipamento). </li></ol> Reação 5. Assembléia Clonagem e Transformação dos produtos em E. coli &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: O objetivo desta etapa é calcular 3: 1 de inserção: vector e realizar a reação de montagem. <ol><li> Use pelo menos 100 ng de fragmento de ADN representando o esqueleto do vector ou fragmento de DNA contendo o marcador selectivo. Calcula-se o excesso molar de 3 vezes para os fragmentos de ADN que vão ser utilizadas como inserções. </li><li> Converter o excesso molar em ng necessária de cada inserto em particular. NOTA: Uma maneira conveniente de fazer os cálculos é usar um aplicativo baseado na web (ver Tabela de Equipamentos). </li><li> Misture quantidades calculadas de fragmentos de ADN em um tubo de PCR, ajustar o volume para 10 mL. Adicionar 10 ml da mistura principal GA (2x, consulte a Tabela de Materiais). Incubar a reacção a 50 ° C durante 1 hora para o conjunto de 4 - 6 ou fragmentos de 15 min para a montagem de fragmentos de 2-3 num termociclador de PCR. </li><li> Prossiga com a transformação do produto em conjunto E. competente coli ou congelar os produtos a -20° C, até ser necessário. </li><li> Siga o processo de transformação que acompanha a células electro competentes ou químicas. Normalmente, utilizar 2 uL da reacção de montagem por reacção de transformação. </li><li> Após a transformação está completa, a propagação das células transformadas em placas de agar suplementado com o antibiótico selectivo apropriado. </li></ol> 6. O plasmídeo isolamento, restrição de digestão enzimática e Sequencing NOTA: O objectivo deste passo é isolar o DNA de plasmídeo a partir de E. coli, em seguida, para verificar a construção, por digestão de restrição e sequenciação. <ol><li> Propagar várias colónias individuais para mini-preps e isolamento de plasmídeos. Durante a noite cultura LB líquido Uso 2-5 ml suplementado com antibiótico apropriado. Isolar os plasmídeos correspondentes, seguindo o procedimento descrito no mini-kit de preparação que é usado. </li><li> Determinar a quantidade e concentração dos plasmídeos obtidos usando espectrofotometriafotômetro. </li><li> Executar a digestão de restrição com uma ou várias endonucleases de restrição para ~ 0,5 ug dos plasmídeos purificados. Utilização de enzimas de restrição que proporcionam padrão distinto de digestão característicos para as construções de DNA. </li><li> Confirme DNA sucesso clonagem por sequenciação de ADN usando primers específicos ou padrão. Analisar os dados de sequenciamento de precisão. </li></ol>

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O uso bem sucedido de clonagem GA deve ser sempre precedida por uma concepção cuidadosa da construção completa (Figura 2 e Figura 3). Verificação cuidadosa das seqüências dos iniciadores desenhados pela ferramenta de geração de cartilha também é altamente recomendável. Os primers para a GA podem ser gerados, sem a utilização da ferramenta de geração de iniciador. No entanto, a utilização da ferramenta é altamente recomendável, porque simplifica o processo. Geralmente, o iniciador para a clonagem GA deve ter duas sequências funcionalmente diferentes. A primeira sequência é um fragmento de ADN específico, e permite a amplificação do fragmento utilizando PCR. A segunda sequência coincide com o fragmento adjacente, o que é necessário para a montagem GA. Uma sequência típica de ADN específica para o fragmento seria 18-22 nt de comprimento. Sequências específicas de ADN-fragmento utilizados para amplificar o ADN mesma deve ter temperaturas de fusão semelhantes e conteúdo em GC. Sequência de sobreposição deve ser pelo menos de 15nt de comprimento com uma temperatura de fusão de pelo menos 48 ° C. O conjunto de mais de 4 fragmentos de DNA exigirá a sequência de sobreposição de modo a ser pelo menos 20 nt. Sobreposições mais longos permitirá o aumento da especificidade do recozimento resultando em fragmentos de DNA mais devidamente montado. Recomenda-se evitar seqüências que estão tortos em seu GC ou AT conteúdo no desenvolvimento de sequências sobrepostas, porque sequências distorcidas podem comprometer montagem DNA adequado. Também sugerem utilizar como controlo negativo, o qual não deve produzir colónias de bactérias resistentes a drogas, apenas o fragmento de ADN correspondente à estrutura do vector numa reacção de GA. Alternativamente, um dos fragmentos de DNA compreendendo as &quot;pastilhas&quot; pode ser omitido da reacção de GA, a qual também deverá resultar em nenhum colónias bacterianas resistentes a drogas. A razão pela qual não há colónias irão crescer vai ser a falta de sobreposição extremidades dos fragmentos de ADN adjacentes, o que irá tornar o conjunto de um complplasmídeo ete. No protocolo descrito, sequências sobrepostas de 25 nt foram usadas para gerar os conjuntos de iniciadores, porque o número de fragmentos de DNA usadas (Figura 3). A recomendação do website ferramenta de geração de primer (ver Tabela de Equipamentos) é a utilização de pelo menos 20 sequências de nt sobrepor para montar 4-6 fragmentos de DNA. Além disso, a sobreposição de sequência mais longa vai garantir a complementação adequada das cadeias de ADN (ver Figura 1) aumentar o número de produtos montados com precisão. Actualmente, vários sistemas para clonagem estão disponíveis sem costura. No entanto, alguns destes sistemas ainda utilizar enzimas de restrição (por exemplo, Golden Gate clonagem 18). Outros usam misturas patenteadas de enzimas baseados em vírus vaccinia polimerase de ADN e da proteína de ligação ao ADN de cadeia simples a partir da mesma fonte biológica 19. Ambos os sistemas são limitados em comparação com GA por o shcomprimento ter de sobreposição de sequências. Porque sequências sobrepostas mais curtos podem não fornecer especificidade suficiente para a etapa de recozimento de fragmentos de DNA adjacentes, tornando a montagem correta de mais de 23 fragmentos de DNA problemáticos. Estes defeitos não estão presentes no sistema de GA. O tamanho dos fragmentos de ADN a ser amplificado deve ser também considerado, de modo a não exceder o tamanho de maneira confiável amplificável por PCR (isto é, menos de 8 kpb em comprimento). Mesmo com as melhorias na função de polimerases de ADN dos últimos 10 anos, grandes fragmentos de ADN serão amplificados com menos eficiência e precisão. Se necessário, os fragmentos de ADN maiores podem ser obtidas a partir de outras fontes alternativas para PCR, por exemplo, através do isolamento de plasmídeo e de ADN adequada digestão com enzimas de restrição. Especificamente, para o protocolo descrito no manuscrito actual, o nosso racional para utilizar PCR foi baseada no tamanho dos fragmentos de ADN disponíveis, que foram todos inferiores a5 kbp. Se houver mais do que um produto de PCR identificado por electroforese em gel de agarose, purificação em gel do fragmento de tamanho desejável é recomendada a utilização de qualquer das técnicas de biologia molecular ou kits disponíveis adequados. No protocolo atual de um DNA polimerase termoestável é utilizado (ver Tabela de Materiais). No entanto, qualquer ADN-polimerase de alta fidelidade e proporcionando rendimento será adequado para ser utilizado com este protocolo. Se polimerases de DNA de alta fidelidade diferentes do que o descrito no protocolo estão disponíveis, use as condições estabelecidas, tal como descrito nos respectivos manuais. No protocolo atual, E. quimicamente competente coli são usados ​​que são fornecidos com o kit GA. E. Alternativamente, química ou electro competente estirpes de E. coli DH5a tal como DH10B ou pode ser usado. O conjunto de clonagem mix mestre 2x é fácil de usar com as mãos sobre o mínimo de tempo. No entanto, pipetagem precisa é necessária por causa dos pequenos volumes neEDED a ser misturados em conjunto. Boa técnica de biologia molecular deve ser exercido em todos os momentos assim. A clonagem GA oferece possibilidades ilimitadas para a construção dos fragmentos de DNA, plasmídeos e vectores que são mais longos do que 3 kpb de tamanho. Além disso, tem um impacto mais amplo no campo da biologia sintética, porque permite a síntese e montagem de, por exemplo, um (Mycoplasma mycoides) genoma bacteriano inteira ou uma levedura (Saccharomyces cerevisiae) cromossoma 20,21. A técnica é também aplicável a clonagem convencional necessita para gerar as construções sem costura. Em conclusão, GA clonagem oferece alternativa rápida, confiável e flexível para o procedimento de clonagem de DNA convencional.

Procedimentos de clonagem de ADN convencionais contam com a utilização de enzimas de restrição para clivar o ADN e ligase de ADN para juntar os fragmentos de DNA em conjunto. Geração de construções de expressão que contenham diferentes mercadorias de fragmentos de ADN é um processo sequencial que inclui a clivagem do ADN com uma e / ou várias endonucleases de restrição e a subsequente inserção de fragmentos de ADN através da ligadura. O inconveniente principal deste procedimento é que as enzimas de restrição adequadas para um dos fragmentos de DNA pode ser difícil de identificar (ou seja, pode ter vários locais de clivagem) tornando a clonagem bem sucedida de ADN da proteína de comprimento completo de interesse impossível. Portanto, a geração de expressão personalizada constrói sob a regulação da transcrição de promotores específicos para o tipo de célula eficiente com personalizados proteína-tags requer design muito cuidado. É também uma técnica que consome tempo e trabalho. Recentemente, vários estudos descrevem metodologias para montar multipdiferentes fragmentos de ADN sintético le numa sequência contínua, ao mesmo tempo, quer em reacções de um ou dois passos, sem a utilização de enzimas de restrição 1-3. A reacção de clonagem de um passo (excluindo todos os passos de preparação), depende da utilização de uma mistura de exonuclease de ADN, ADN-polimerase, ligase de ADN de 2,3 e as extremidades sobrepostas de fragmentos de ADN (Figura 1). Uma vez que não há nenhuma utilização de enzimas de restrição, os fragmentos de ADN de qualquer tamanho e composição da sequência (excluindo as sequências altamente repetitivas) podem ser fundidos em conjunto num constructo sem costura. Recentemente, um kit comercial (montagem Gibson; GA) para as reações de clonagem de uma etapa tornou-se disponível. Este kit permite uma montagem rápida e eficiente custo de quaisquer fragmentos de DNA em um único vector com os promotores personalizadas e tags de proteína. Os vectores de expressão de plasmídeos disponíveis amplamente utilizados para expressar proteínas exógenas em modelos de cultura de células de mamíferos são muitas vezes sob a reg transcricionalulação do citomegalovírus viral (CMV) ou vírus SV40 (40) os promotores de Simian. Estes promotores virais proporcionam a expressão transiente robusta das proteínas exógenas na maioria dos modelos baseados em cultura de células de mamíferos. No entanto, a geração de linhas celulares que expressam estavelmente proteínas exógenas é frequentemente mal sucedida por causa de silenciamento transcricional de CMV ou promotores de SV40, durante o processo de estabelecimento de 4,5. Além disso, os promotores de SV40, CMV viral e não serão suficientes para promover a expressão de proteínas exógenas em células da linhagem linfóide ou células estaminais embrionárias 6,7. A solução para a limitação inerente de promotores virais é a utilização de promotores fortes constitutivos não virais 8-10. Um promotor constitutivo forte bem caracterizados não-viral de origem humana é o promotor do factor de alongamento 1α (hEF1α) (hEF1α está envolvido na catálise da associação dependente de GTP de aminoacil-ARNt de ribossomas 11). No entanto,Os vectores de expressão contendo o promotor hEF1α não são tão amplamente quanto a-promotor viral contendo plasmídeos, especialmente aqueles que contenham também 3 × FLAG na extremidade do terminal amino da proteína de interesse. A proteína de factor de estimulação de clivagem de 64.000 MW (CstF-64) é envolvido na direcção 3 &#39;de processamento final da maioria dos mRNAs de histonas 12,13, incluindo ARNms dependentes de replicação 14,15. CstF-64 é expresso em todos os tecidos somáticos 12. Seu motivo de reconhecimento RNA se liga a seqüências de RNA GU-ricos em transcrições nascentes a jusante da clivagem e poliadenilação local 16. Esta ligação de CstF-64 para o pré-mRNA promove a clivagem endonucleolítica eficiente do transcrito nascente. Aqui, é descrito um protocolo que utiliza amplificação por PCR dos fragmentos de ADN, um kit de clonagem de montagem Gibson (que inclui células bacterianas quimicamente competentes) para produzir vectores de mercadorias m 3xFLAG-tagouse CstF-64 ou mutante CstF-64 para a sua extremidade terminal amino sob a expressão de hEF1α promotor 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="553">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:196px;">Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA)</td>
			<td style="width:71px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">DNA purification magnetic beads</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Plasmid Isolation Mini Kit</td>
			<td style="width:71px;">Omega Bio-Tek Inc</td>
			<td style="width:119px;">D6942-01</td>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0494S</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">DpnI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NheI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NotI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">HindIII</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>NanoDrop device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">EditSeq</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">SeqBuilder</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Word</td>
			<td style="width:71px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of&#160; Microsoft Office</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBuilder</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>primer generation tool: http://nebuilder.neb.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBioCalculator</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of plasmid vectors expressing flag-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1&#945; promoter using gibson assembly

Montagem Gibson (GA) clonagem oferece uma alternativa rápida, confiável e flexível para métodos de clonagem de DNA convencionais. Usamos GA para criar plasmídeos personalizadas para expressão de genes exógenos em células-tronco embrionárias (mESCs). A expressão de genes exógenos, sob o controlo do SV40 ou promotores de citomegalovírus humanos diminui rapidamente após a transfecção em mESCs. Um remédio para esta expressão diminuída é usar o promotor humano fator de alongamento-1 alfa (hEF1α) para conduzir a expressão do gene. Vetores plasmídeo contendo hEF1α não são tão amplamente disponível como SV40 ou plasmídeos contendo CMV, especialmente aqueles que contêm também N-terminal 3xFLAG-tags. O protocolo descrito aqui é um método rápido para criar plasmídeos que expressam FLAG-marcado CstF-64 e CstF-64 mutante sob a regulação expressional do promotor hEF1α. GA utiliza uma mistura de exonuclease de ADN, polimerase de ADN e ligase de ADN para fazer a clonagem de extremidades sobrepostas de fragmentos de ADN possíveis.Com base nos DNAs de modelo que tínhamos disponível, nós projetamos nossas construções a ser montado em uma única seqüência. Nosso projeto usou quatro fragmentos de DNA: pcDNA backbone 3.1 vetor, hEF1α promotor parte 1, parte 2 hEF1α promotor (que continha 3xFLAG-tag comprado como um fragmento de DNA de cadeia dupla sintético), e quer CstF-64 ou específica CstF-64 mutante. As sequências destes fragmentos foram carregados para uma ferramenta de geração de iniciador para conceber iniciadores de PCR adequados para gerar os fragmentos de DNA. Após PCR, os fragmentos de DNA foram misturados com o vector contendo o marcador selectivo e a reacção clonagem GA foi montado. Plasmídeos de colônias bacterianas transformadas individuais foram isolados. Ecrã inicial dos plasmídeos foi realizada por digestão de restrição, seguido de sequenciação. Em conclusão, GA nos permitiu criar plasmídeos personalizadas para a expressão do gene em 5 dias, incluindo construção de telas e verificação.

Um fluxo de trabalho do protocolo que foi seguido é mostrado na Figura 2A. Queríamos clonar CstF-64 e mutantes CstF-64 proteínas fundidas para 3xFLAG-tag ao abrigo do regulamento expressional de hEF1α promotor (Figura 2B e Figura 3). A hEF1α plasmídeo contendo seguido por 3xFLAG-tag não estava disponível para nós. No entanto, os seguintes plasmídeos estavam disponíveis: pcDNA 3.1 myc-His (A; uma oferta generosa de Michaela Jansen), hEF1α contendo plasmídeo (uma oferta generosa de Mladen Yovchev) e mouse CstF-64 plasmídeos 12 (Figura 3). Toda a sequência para a construção (s) foi montado utilizando os aplicativos de edição de texto e de nucleotídeos (Figura 3; veja tabela de equipamento). Subsequentemente, a sequência (s) foi dividida em quatro pedaços convenientes (Figura 2B, blocos vermelho e Figura 3) correspondentes aos ADN plasmídicos disponíveis. Amplification primers foram projetados usando a ferramenta de geração de primer (ver Tabela de Equipamentos) com restrições de 4-6 fragmentos com sobreposição mínima de 25 nt, criada na janela pop-up &quot;Alterar configurações de montagem Gibson&quot;. Sítios de restrição NheI e NotI foram incluídas na concepção de iniciadores para a finalidade de identificar os plasmídeos correctamente montados. NheI está localizado na sequência de iniciador entre pcDNA 3.1 e na extremidade 5 &#39;do promotor hEF1α. Local Notl situa-se após o codão de paragem (UGA) de CstF-64 e pcDNA 3.1 vector de espinha dorsal. Após a digestão simultânea com ambos os enzimas fragmento de ADN que consiste em hEF1α promotor, 3xFLAG e CstF-64 mutante ou CstF-64 será libertado (ver abaixo e na Figura 2B). Primers foram encomendados em menor escala possível e dessalinizada. A segunda parte do promotor hEF1α contendo fragmento de DNA 3xFLAG-tag (490 bp, figura 2B, Figura 3) foi comprado como um único fragmento DNAs (see Table of Materials). Os fragmentos de DNA usados ​​na reacção de reunião foram amplificados utilizando pol do ADN de (ver Tabela de Materiais). Fragmentos de DNA de hEF1α promotor parte 1, parte 2 hEF1α promotor, de corpo inteiro e mutante CstF-64 foram amplificados simultaneamente em um tubos separados por 28 ciclos (Figura 4A), seguindo as recomendações do fornecedor da pol DNA (ver Tabela de Materiais , para cada ciclo de desnaturação foi de 7 segundos a 98 ° C, 45 s de recozimento a 55 ° C, alongamento de 90 segundos a 72 ° C). Inicialmente, a espinha dorsal pcDNA 3.1 foi amplificado durante 22 ciclos (utilizando as mesmas condições como acima com a excepção de o tempo de alongamento, o qual foi ajustado para 3 min a 72 ° C). No entanto, o rendimento de ADN resultante não foi suficiente para ser usado numa reacção de montagem (Figura 4A). Portanto, uma amplificação adicional foi realizado para obter suficiente ADN. Os produtos de PCR obtered partir de um molde de plasmídeo deve ser digerido com a enzima de restrição Dpnl para remover o ADN de plasmídeo, que de outra forma contaminar os produtos resultantes da reacção de montagem e irá produzir colónias bacterianas resistentes a drogas falso-positivos. Por conseguinte, os produtos de PCR foram digeridos com a enzima de restrição Dpnl, que cliva o DNA de plasmídeo desnaturado e hemi-metilado isolado a partir de barragem + E. estirpes de E. coli. Os produtos de PCR obtidos a partir de fragmentos de ADN sintéticos, como moldes não precisam de ser digerido com Dpnl já que o ADN sintetizado quimicamente não contém bases metiladas ou hemi-metilado. Os fragmentos de ADN foram purificados e concentrados através de purificação do ADN pérolas magnéticas (ver Tabela de Materiais) como descrito no passo protocolo 4. Os PCRs para o vector pcDNA 3.1 espinha dorsal foram combinados em conjunto e a quantidade de purificação de ADN esferas magnéticas utilizado foi ajustado em conformidade. O rendimento de ADN foi determinadautilizando um espectrofotômetro (Tabela 1 e Tabela de Equipamentos). Reacções de Montagem de CstF-64 e mutantes CstF-64 construções foram montadas em gelo (Tabela 1). Um excesso molar de 3 vezes de fragmentos de ADN consideradas como &quot;pastilhas&quot; foi utilizada (Tabela 1, Figura 3). O volume final dos fragmentos de ADN mistos foi ajustado a 10 ul com água e 10 ul de mistura de base de montagem (2x) foi adicionado. As reacções foram misturadas e incubadas a 50 ° C durante 1 h. Reacção de controlo positiva, também foi montada de acordo com a recomendação do manual do kit GA e incubadas simultaneamente com os CstF-64 e mutantes CstF-64 reações. Tal como recomendado no protocolo, 2 ul da cada uma das reacções foram transformadas de montagem na E. quimicamente competente coli fornecido com o kit de clonagem de montagem (ver Tabela de Materiais). A transformação foi realizada como descrito no kitmanual. Os clones positivos foram seleccionados em placas de agar / LB ampicilina. 6 colónias por cada reação montagem foram selecionados aleatoriamente para ser propagada. Os DNAs de plasmídeo foram isolados utilizando uma mini-kit de isolamento de plasmídeo (ver Tabela de Materiais). Na digestão in silico das construções com as enzimas de restrição Nhel e NotI resultou em dois fragmentos com tamanhos de 4590 pb, 3032 pb para o CstF-64 e 4590 pb, 2711 pb para o mutante CstF-64 (Figura 2B e Figura 4B). A digestão com as enzimas de restrição HindIII e NotI resultou em três fragmentos com os seguintes tamanhos: 5872 pb, 1005 pb e 745 pb (CstF-64) e 5872 pb, 1005 pb e 424 pb (mutante CstF-64, Figura 2B e Figura 4C). De facto, a digestão dos plasmídeos isolados apresentado os padrões característicos esperados (Figura 4B, C). Note-se que o fragmento de ADN de 424 pb produziu por digestão com HindIII e Notl do mutante de CstF-64plasmídeos na Figura 4C é fracamente manchado devido ao seu pequeno tamanho. 2 dos 6 plasmídeos isolados foram enviados para o seqüenciamento. Nós sequenciado o promotor hEF1α, e CstF-64 mutante ou CstF-64 partes das construções para verificar que não existem deleções, inserções ou substituições. Recomendamos seqüenciamento das construções de DNA resultantes deste ou de qualquer protocolo baseado em PCR. A sequenciação revelou que uma de cada plasmídeo sequenciado continha a sequência esperada na região de hEF1α, 3xFLAG-tag e CstF-64 mutante ou CstF-64. Cada um dos outros plasmídeos tinham um ponto de mutação introduzidas durante a amplificação do fragmento de ADN correspondente. A expressão do plasmídeo contendo CstF-64 de ratinho em células estaminais embrionárias, produziu uma quantidade abundante de proteínas exógenas comparável à expressão do tipo selvagem 17. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" width="450" /> Figura 1. Representação esquemática do mecanismo de montagem Gibson. Os fragmentos de ADN com extremidades sobrepostas isotermicamente foram montados numa única sequência contínua. A sobreposição termina primeiro são mastigados de volta por 5 &#39;exonuclease, que é gradualmente inativados pelo calor. Por conseguinte, fragmentos de ADN com diferentes extremidades que se podem sobrepor recozer isotermicamente. DNA polimerase para preencher as lacunas e ligase DNA termoestável ligates os nicks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2. (A) Diagrama de fluxo do protocolo descrito para a clonagem de montagem. (B) Representação do plasmídeo, pGA-CstF-64 gerado utilizando o kit de GA vermelhos - fragmentos de DNA usados ​​na reacção de montagem:. PcDNA3,1; hEF1α promotor part 1 (hEF1a - 1); hEF1α promotor part 2 (hEF1a - 2) pedido como um DNA sintético; rato CstF-64 (mCstF-64). Azuis - grelhas de leitura abertas. Violeta - promotores virais e não virais. Verde -. Regiões de clivagem e poliadenilação <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" width="650" /> Figura 3. projeto do conjunto Gibson CstF-64 plasmídeo. Preto caixas representam os fragmentos de DNA que estavam disponíveis para projetar um conjunto único Gibson CstF-64 em sequência silico. Subsequentemente, a sequência foi dividido em quatro partes de ADN, os quais foram amplificados por PCR. Note-se que, devido à pequena dimensão do-tag 3xFLAG a sequência foi concebido como um DNAs juntamente com o pr hEF1α<html> omoter parte 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig4highres.jpg" width="650" /> Figura 4. A PCR dos fragmentos de ADN utilizados nas reacções de clonagem e a digestão com enzimas de restrição representante dos plasmídeos obtidos (A) PCRs usando representativos quente iniciar de alta fidelidade master mix 2x para os fragmentos de ADN utilizados em reacções de montagem:. (B) representativas plasmídeos de hEF1α, comprimento completo CstF-64, pcDNA 3.1 construto (pGA-CstF-64) e hEF1α, mutante CstF-64, pcDNA 3.1 construto (pGA-mutCstF-64), digerido com NheI e NotI. (C) os mesmos plasmídeos como em B digerido com as enzimas HindIII e NotI.&quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome de fragmentos de DNA </td><td> O tamanho esperado (pb) </td><td> Concn. (Ng / mL) </td><td> Diluída a (ng / mL) </td><td> ul utilizado em GA CstF-64 a partir diluído </td><td> ul utilizado em mutCstF GA-64, a partir diluído </td><td> Razão molar (ins: VEC) </td></tr><tr><td> pcDNA 3.1 (vector) </td><td> 4.618 </td><td> 158 </td><td> undiluted </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> hEF1_ parte promotor 1 </td><td> 825 </td><td> 213 </td><td> 75 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ promotor parte 2 para CstF-64 </td><td> 516 </td><td> 229 </td><td> 50 </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> CstF-64 </td><td> 1.796 </td><td> 161 </td><td> undiluted </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ promotor parte 2 para o mutante CstF-64 </td><td> 516 </td><td> 199 </td><td> 50 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> mutante CstF-64 </td><td> 1.448 </td><td> 201 </td><td> 171 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Produção de fragmentos de ADN após concentração em esferas magnéticas, diluição e definir-se as reacções de montagem.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1Î± Promoter Using Gibson Assembly at JoVE.com

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

generation-plasmid-vectors-expressing-flag-tagged-proteins-under

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

36.7K visualizações.  Texas Tech University Health Sciences Center. Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning. 

Vídeo: Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Biologia

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

Métodos para descobrir Uso Promotor Alternativa e regulação da transcrição de Murino Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed specifically for this protocol and allows for the quantification of terminator efficiency. As a proof of concept, six terminators were bioinformatically identified in the mycobacteriophage Bernal13. Once identified, terminators were then made as oligonucleotides with the appropriate sticky ends and annealed together. Using Golden Gate Assembly (GGA), terminators were then cloned into pGR-Blue. Under visible light, false positive colonies appear blue and positively transformed colonies are white/yellow. After induction of an arabinose inducible promoter (pBad) with arabinose, colony strength can be determined by measuring the ratio of green fluorescent protein (GFP) produced to red fluorescent protein (RFP) produced. With pGR-Blue, the protocol can be completed in as little as three days and is ideal in an educational setting. Additionally, results show that this protocol is useful as a means for understanding in silico predictions of terminator efficiency related to the regulation of transcription.

This protocol utilizes Golden Gate Assembly and the plasmid pGR-blue to rapidly quantify the strength of terminators found in silico.

Rápida Verificação de Exterminadores Usando o PGR Azul plasmídeo e Montagem Golden Gate

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the original plasmid recovery method and introduces restriction enzyme digestion to ease DNA ligation reactions (required for chimera assembly). For this protocol, users clone wildtype genes into the same plasmid (pUC18 or pUC19). After the in silico selection of amino acid sequence regions where chimeras should be assembled, users obtain all the synonym DNA sequences that encode them. Ad hoc Perl scripts enable users to determine all synonym DNA sequences. After this step, another Perl script searches for restriction enzyme sites on all synonym DNA sequences. This in silico analysis is also performed using the ampicillin resistance gene (ampR) found on pUC18/19 plasmids. Users design oligonucleotides inside synonym regions to disrupt wildtype and ampR genes by PCR. After obtaining and purifying complementary DNA fragments, restriction enzyme digestion is accomplished. Chimera assembly is achieved by ligating appropriate complementary DNA fragments. pUC18/19 vectors are selected for CAPRRESI because they offer technical advantages, such as small size (2,686 base pairs), high copy number, advantageous sequencing reaction features, and commercial availability. The usage of restriction enzymes for chimera assembly eliminates the need for DNA polymerases yielding blunt-ended products. CAPRRESI is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI), a protocol based on the insertion of restriction enzyme sites into synonym DNA sequences and functional plasmid recovery. This protocol is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de sítio de enzima de restrição

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Análise do promotor de planta: Identificação e caracterização de raiz nódulo promotor específico no feijão comum

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

Co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...