O sistema bacteriano CRISPR-Cas9 aumentou substancialmente as opções experimentais para os cientistas da vida. No entanto, várias abordagens CRISPR dependem da entrega simultânea de RNAs guia múltiplos em células individuais. A clonagem de gRNA de montagem de string permite a geração simples e rápida de vetores de expressão multiplex gRNA em uma única etapa de clonagem.
Mas o STAgR não é apenas simples, como também é eficiente, barato e fácil de personalizar. Para começar, adicione as sequências de gRNA N20 aos primers de amplificação para a frente para a sequência de DNA STAgR como saliências. Adicione sequências de gRNA de sentido cinco primos ao primer dianteiro, primer para frente do andaime, para um andaime convencional, ou para o primer avançado SAM para um andaime contendo MS2.
Em seguida, adicione as sequências de gRNA de complemento reverso N20 às sequências de primer reversa, escolhendo primers RP, dependendo dos promotores e strings específicos utilizados. Para começar a gerar os fragmentos de clonagem individuais para a Gibson Assembly, transfira 10 microliters do buffer de alta fidelidade para um tubo. Adicione um microliter de 10 dNTPs milimolares e 0,25 microlitros de ambos os 100 primers de saliência de micromolar.
Adicione 10 nanogramas da sequência de modelos de DNA, ou vetor, e 1,5 microliters de DMSO. Adicione água suficiente para trazer o volume final para 49,5 microliters e, em seguida, adicione 0,5 microliters de polimerase HF. Incubar as reações em um termociclador, conforme descrito no protocolo de texto.
Depois disso, pegue uma alíquota de 5,5 microliter da reação do PCR. Adicione corante de carregamento a todas as alíquotas e carregue-o em um gel de 1% de agarose. Carregue uma escada de DNA apropriada para dimensionamento, e execute o gel em um buffer de gel apropriado a 120 volts por 30 minutos.
Enquanto o gel estiver em execução, adicione cinco microliters do buffer fornecidos com a enzima de restrição, e 0,5 microliters DpnI aos 44,5 microliters restantes de reação pcr vetorial para remover o modelo de plasmídeo residual usado durante o PCR. Incubar a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Verifique se as amplicons são do tamanho correto.
Para iniciar a purificação do DNA, adicione 1,8 microliters de contas magnéticas por um microliter de produto PCR, e misture por tubulação para cima e para baixo. Incubar em temperatura ambiente por dois minutos. Usando um ímã, separe as contas em fragmentos de DNA do líquido residual.
Enxágüe a pelota com 70% de etanol sem resusususá-la totalmente, para lavar as contas. Repita esta lavagem mais uma vez. Usando uma pipeta, retire todo o etanol e deixe o ar da pelota secar.
Em seguida, adicione 15 a 20 microliters de água, e pipeta para cima e para baixo para misturar e dissolver a pelota. Use um ímã para separar as contas do líquido. Transfira o supernatante claro para um novo tubo.
Depois disso, use um espectrômetro para determinar as concentrações de DNA. Primeiro, prepare o buffer de reação isotemal 5x conforme detalhado no protocolo de texto. Para o Gibson Assembly Master Mix, combine 320 microliters do tampão de reação isoterálmica de 5x com 697 microliters de água.
Adicione 3 microliters de exonuclease T5, 20 microliters de polimerase de DNA, e 160 mciroliters de ligase de DNA Taq. Transfira 7,5 microliters da Mistura Mestre de Montagem para um tubo fresco. Em seguida, adicione 2,5 microliters de inserção no vetor, conforme descrito no protocolo de texto.
Incubar as amostras a 50 graus Celsius por 45 a 60 minutos. Depois disso, armazene amostras no gelo, ou a 20 graus Celsius, para posterior transformação. Quando estiver pronto para transformar as bactérias, descongele as bactérias TOP10 E.Coli quimicamente competentes no gelo.
Em seguida, adicione cinco microliters do Gibson Mix a 50 microliters de bactérias competentes, e misture suavemente o fundo do tubo. Incubar no gelo por 30 minutos. Coloque o tubo em um banho de água de 42 graus Celsius ou bloco de calor por 45 segundos para aquecer as bactérias.
Então, coloque os tubos de volta no gelo. Adicione 250 microliters de soc médio à bactéria, e deixe-os se recuperar a 37 graus Celsius em uma incubadora de agitação por 30 a 45 minutos. Depois que as bactérias se recuperarem, coloque-as em placas de ágar de 1,5%LB que contenham 100 microgramas por ampicillina mililitro.
Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Para começar, prepare pelo menos dois conjuntos de tubos de reação PCR de 200 microliter para cada construção. Encha um dos conjuntos de tubos de reação com 100 microliters LB médio, contendo 100 microgramas por mililitro de ampicillina.
Usando uma ponta de pipeta estéril, raspe o material biológico de uma colônia bacteriana, e espalhe-o no fundo de um tubo de reação PCR vazio de 200 microliter. Transfira imediatamente a ponta da pipeta para o segundo tubo de reação correspondente que contenha meio LB. Gire a ponta para garantir que algumas das bactérias sejam transferidas para a mídia LB.
Incubar a 37 graus Celsius para uso posterior. Em seguida, prepare 10 microliters de PCR Master Mix por tubo de reação, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 10 microliters do PCR Master Mix aos tubos de reação PCR rotulados, sem a mídia LB.
Usando um termociclador, incubar as reações conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, adicione corante de carga aos fragmentos amplificados e carregue-os em um gel de 1% de agarose. Carregue uma escada de DNA apropriada para dimensionamento, e execute o gel em um buffer de gel apropriado a 120 volts por 30 minutos.
Calcule o tamanho teórico do amplicon somando os tamanhos individuais dos promotores usados, andaimes de gRNA e número de sequências N20. A partir dos resultados da colônia PCR, identifique os clones bacterianos, com base no tamanho correto da banda, e se eles provavelmente abrigarão vetores corretos. Usando a cultura correspondente de 100 microliter, inocular uma cultura LB de 2,5 mililitros durante a noite contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro.
Incubar a 37 graus Celsius por 12 horas. Em seguida, use um mini-kit de plasmídeo comercial para extrair o DNA plasmídeo, de acordo com as instruções do fabricante. Neste procedimento, a clonagem de gRNA de montagem de string é usada para gerar rapidamente plasmídeos de expressão de gRNA.
Um resultado típico dos PCRs usados para obter as peças STAgR é visto aqui. Os seis amplicons representam peças de DNA lineares, cada uma contendo as sequências individuais de gRNA N20 em suas extremidades. A espinha dorsal plasmida é estendida com as sequências de segmentação de gRNA1 e gRNA6, e, portanto, possui as sobreposições necessárias a dois outros PCRs para Gibson Assembly.
Após a purificação, um rendimento de DNA de pelo menos um micrograma para vetores e pastilhas pode ser alcançado. Após a Montagem Gibson, a transformação bacteriana resulta em 100 a 700 colônias bacterianas. A análise representativa de 22 colônias bacterianas, via COLÔNIA PCR seguindo um protocolo STAgR com seis gRNA, indica que sete clones mostram o tamanho de amplicon esperado para montagem completa.
Os outros clones provavelmente receberam vetores STAgR, contendo uma a cinco fitas gRNA, enquanto um clone está completamente vazio. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucas horas. Realizado corretamente, permite a geração de uma infinidade de vetores de expressão multiplex gRNA em menos de uma semana de trabalho.
Ao tentar este procedimento, é importante prestar atenção à atribuição correta e combinação de primers de saliência N20. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como criar seus próprios vetores de expressão de RNA guia multiplex.
