A enumeração das unidades formadoras de colônias limitava a reprodutibilidade da pesquisa no campo da UTI. A imagem de bioluminescência avançará na pesquisa vivo UTI sobre fisiologia da bexiga, patogênese UTI e suscetibilidade. A imagem de bioluminescência permite o acompanhamento longitudinal com visão em tempo real da evolução da infecção.
Além disso, reduz drasticamente o número de animais necessários. A bioluminescência de imagens facilita a pesquisa sobre infecções recorrentes ou crônicas, que são frequentes em humanos. Além disso, os pesquisadores podem identificar infecções ascendentes ou disseminação no sangue usando imagens de bioluminescência.
Obtenha colônias únicas, espalhando o estoque de glicerol de bactérias com um laço de inoculação em placas LB suplementadas com sulfato de kanamicina, e culminando durante a noite a 37 graus Celsius. Encha um tubo traseiro redondo de poliestireno de 14 mililitros, com tampas de encaixe de dupla posição com cinco mililitros de caldo LB complementados com sulfato de kanamycin. Escolha uma única colônia bacteriana com um laço de inoculação, e adicione isso ao caldo LB.
Vórtice por 10 segundos para garantir a mistura adequada. Cultura estaticamente com a tampa de estalo na posição aberta a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, o vórtice do tubo por 10 segundos para garantir a homogeneização adequada da cultura bacteriana.
Faça uma subcultura no Erlenmeyer adicionando 25 microliters da suspensão bacteriana a 25 mililitros de meio LB fresco sem antibióticos. Feche o Erlenmeyer e a cultura estaticamente da noite para o dia. No dia da instalação, despeje a cultura do Erlennmeyer em um tubo de cultura de 50 mililitros, e centrífuga.
Decante o supernatante e resuspenque a pelota bacteriana em 10 mililitros de PBS estéreis. Vórtice o tubo novamente por 10 segundos. Escolha a concentração experimental do inóculo e determine o OD correspondente em 600 nanômetros usando a curva padrão.
Adicione um mililitro da cultura bacteriana resuspended em nove mililitros de PBS estéreis e ajuste até que o od 600 nanômetro desejado seja atingido. Monte uma ponta de angiocateter de calibre 24 estéril em uma seringa de 100 microliter. Encha a seringa com a solução bacteriana preparada.
Coloque um animal em uma superfície de trabalho na posição supina e mantenha uma anestesia isoflurane estável usando um cone de nariz durante a instalação. Aplique a pomada ocular. Expelir a urina residual aplicando compressão suave e fazendo movimentos circulares na região suprapúbica e, em seguida, limpe o abdômen inferior com 70% de etanol.
Lubrifique a ponta do cateter com soro fisiológico normal. Coloque o dedo indicador na mão não dominante no abdômen e empurre-o suavemente para cima. Inicie o cateterismo da uretra verticalmente em um ângulo de 90 graus.
Uma vez encontrada resistência, incline-a horizontalmente antes de inseri-la ainda mais. Realize uma instalação lenta de 50 microliters do inóculo bacteriano. Após a instalação, mantenha a seringa e o cateter no lugar por mais alguns segundos e, em seguida, retraia lentamente para evitar vazamentos.
Use um cateter por grupo experimental. Posicione o animal em uma posição supina no cone do nariz para prepará-lo para a imagem, e prepare-o para a imagem usando um cateter por grupo experimental. Se necessário, administre antibióticos ou medicamentos experimentais, conforme mencionado no manuscrito do texto.
Abra o software de aquisição da BLI e clique em Initialize no dispositivo de imagem para testar a câmera e o sistema do controlador de palco e resfriar a câmera do dispositivo acoplado a menos 90 graus Celsius. Clique em Aquisição, AutoSave To.Select Luminescence and Photograph. Verifique as configurações luminescentes padrão definindo o filtro de excitação para bloquear e filtro de emissão para abrir.
Defina o tempo de exposição ao auto ao tirar a primeira imagem. Para medições in vivo e sinais brilhantes, ajuste o tempo de exposição para cerca de 30 segundos. Reduza o tempo de exposição se um aviso aparecer devido a uma imagem saturada.
Selecione o binning médio, F/stop um e escolha o FOV correto. Ajuste a altura do sujeito para um centímetro ao fotografar ratos. Imagem de até cinco milhas simultaneamente e separar os animais usando o defletor de luz para evitar o reflexo.
Feche a porta e clique em Adquirir para iniciar a sequência de imagens e, em seguida, preencha informações detalhadas sobre o experimento. Remova os ratos da câmara de imagem e devolva-os para a gaiola. Verifique se há recuperação completa após a anestesia e, em seguida, devolva as gaiolas aos racks ventilados até o próximo ciclo de imagem.
Inicie o software de imagem e carregue o arquivo experimental clicando em Procurar. Use a paleta de ferramentas para ajustar a escala de cores da imagem. Use as ferramentas do ROI para desenhar uma região de interesse na imagem, garantindo que ela seja grande o suficiente para cobrir a área completa e usando as mesmas dimensões para todas as imagens.
Em seguida, clique na medição do ROI para quantificar a intensidade da luz. Imagens subsequentes de camundongos obtidas imediatamente após a instalação mostraram que era robustamente detectável acima de 20.000 unidades formadoras de colônias, e uma correlação linear entre as unidades formadoras da colônia do inóculo e a bioluminescência in vivo foi estabelecida. A evolução natural de uma infecção do trato urinário foi estudada em um grupo controle que não recebeu nenhum tratamento.
O efeito do tratamento antibiótico na cinética da infecção foi visualizado em detalhes em um grupo de animais tratados com antibióticos. Uma diminuição imediata da carga bacteriana, medida pelo fluxo total de fótons, foi observada após a primeira dose de Enrofloxacina. Nenhum dos animais tratados teve um aumento subsequente na carga bacteriana.
A carga bacteriana geral de cada animal foi calculada utilizando-se a área sob a curva do fluxo de fótons transformado no tronco, mostrando uma diferença significativa entre animais tratados com Enrofloxacina e animais não tratados ao longo de 10 dias. Esses resultados comprovam o conceito de que o BLI pode ser usado para avaliar diferenças na cinética da infecção por UTI. A bioluminescência é uma técnica não invasiva que pode ser combinada com outros métodos, como a coleta regular de amostras urinárias para análise bacteriana ou bioquímica ou para os experimentos.
Aqui demonstramos que a bioluminescência é uma ferramenta poderosa para avaliar novas estratégias terapêuticas sobre o curso da doença de infecções do trato urinário.
