The authors would like to thank Dr. Shaun Coughlin for hosting the filming of this procedure in his laboratory, and for general support. R.A. was supported by the NIH (F32HL110489) and the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation. S.R. was supported by a Research Fellowship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) and the American Heart Association (AHA). D.Y.R.S was supported by the NIH (RO1HL54737), the Packard Foundation, and the Max Planck Society.

NOTA: Certifique-se sempre de que a aprovação IACUC ou comitê de ética está no lugar antes de iniciar qualquer procedimento experimental usando peixe-zebra. 1. Prepare os reagentes e configuração <ol><li> Prepare as seguintes soluções. Encontrar as receitas para todas estas soluções em manuais de peixe-zebra padrão de 10. <ul><li> 500 ml de água ovo </li><li> 200 ml de 0,03% em tricaina ovo Água </li><li> 1x 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) </li><li> Tampão de lise de RBC (opcional) </li><li> Destino tampão de escolha (fixador, Trizol, PBS, etc.) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo NOTA: fixador e Trizol são tóxicos se entrarem em contacto com a pele. Usar luvas ao manusear estas substâncias. </li></ul></li><li> Prepare configuração dissecção: <ol><li> Posicione a fonte de luz gooseneck sobre o microscópio de dissecação. Colocar a tampa de uma placa de Petri de 9 centímetros na fase de microscópio de dissecação, e verter uma fina camada de fosfato em 1x-lo (a tampa é usada porque o prato em si é muito profunda para a dissecção fácil). </li><li> Coloque a própria placa de Petri (não a tampa) na bancada perto do escopo de dissecação e despeje cerca de 15 ml de PBS 1x nele. Use-o para lavar o coração após a dissecação. Em alternativa, utilizar um tampão de lise de RBC. </li><li> Lâmina de barbear lugar, dois pares de pinças, microtesouras (opcional), e uma pipeta de transferência ao lado do microscópio. Obter um recipiente de gelo, se a eutanásia de um arrefecimento rápido é escolhido. </li><li> Despeje 200 ml de 0,03% tricaina em Egg água em um copo de vidro de 250 ml, se a eutanásia por tricaina é escolhido. Prepare um pequeno saco de risco biológico para eliminação de carcaças de peixe-zebra. </li></ol></li></ol> 2. Prepare Zebrafish <ol><li> Para peixes fixo, trazer peixe fixo, lavadas em PBS, para a configuração do microscópio. <ol><li> Eutanásia todo o peixe-zebra adulto de um arrefecimento rápido com gelo durante&gt; 10 min. </li><li> Use uma pinça para fazer um furo na pele sobre o peritoneu(Longe do coração) para auxiliar a penetração do fixador, e, em seguida, colocá-los em 4% de paraformaldeído em tampão de Fix 10 durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Alternativamente, para o peixe fresco, peixe local para ser sacrificado em um pequeno tanque de retenção e trazer para a configuração do microscópio. Dependendo do protocolo de peixes da instalação individual e os usos a jusante para os corações de peixes dissecados, anestesiar peixe com tricaina ou eutanásia de um arrefecimento rápido antes de decapitação. <ol><li> Para usar o gelo, pegar um peixe com a rede de pesca e coloque em água gelada até que o peixe pára de se mover, cerca de 5 min. </li><li> Como alternativa, para usar tricaina, pegar um peixe com a rede de pesca e coloque no copo da solução até movimentos de emalhar parar. </li></ol></li><li> Rapidamente pegar os peixes mortos por sua barbatana caudal e colocá-lo em seu lado na tampa placa de Petri que foi preenchido com 1x PBS. Use a pinça para levantar uma nadadeira peitoral com uma mão, enquanto estiver usando o razolâmina r para decapitar o peixe com o outro lado, apenas posterior à fixação da barbatana peitoral (Figura 1A). Execute esta etapa ou olhando através do microscópio ou apenas visualizar diretamente os peixes no palco microscópio. NOTA: Peixes recentemente sacrificados ainda vai sangrar após a decapitação. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52248/52248fig1highres.jpg" /> Figura 1. Zebrafish dissecção coração adulto utiliza marcos anatômicos de peixe-zebra. (A) para decapitar o peixe, levante a nadadeira peitoral com uma pinça e usar uma lâmina limpa afiada ao longo da linha pontilhada vermelha, como mostrado. (B) Para firmar a cabeça de peixe, coloque um dente do fórceps na boca dos peixes enquanto o outro tine fica do outro lado do olho, e, em seguida, virar a cabeça de peixe de modo que a superfície ventral é para cima e as duas pontas da pinça são estáveis ​​contra a parte inferior da placa de Petri. (C) Use a forc livreeps para cortar a ligação do opérculo (seta). (D) elevação isso, a aorta dorsal é visível como uma estrutura branca com uma listra rosa denotando sangue luminal (seta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52248/52248fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 3. Dissecar o Coração <ol><li> Visualize a cabeça de peixe sob o microscópio. Com uma pinça, estabilizar a cabeça de peixe, colocando um dente da pinça na boca de peixe, através do cérebro, enquanto que o outro dente é fora da cabeça, através do olho (Figura 1B). Certifique-se de ambas as garras de pinça são estáveis ​​contra o fundo do prato de petri. Segurando a cabeça de peixe desta forma, a sua superfície ventral deve estar voltado para cima. </li><li> Com a outra mão, utilizar a segunda pinça para cortar a ligação ventral do opérculo ao corpo (seta, Figura 1C). Levantar esta ligeiramente com a pinça, o dØrsal aorta aparece por baixo como uma estrutura branca com uma listra vermelha de sangue na luz aórtica (seta, Figura 1D). Corte as aorta dorsal, com a pinça por beliscar a aorta e puxando para cima; em alternativa, usar microtesouras para cortar a aorta dorsal. </li><li> Agora, use a segunda pinça para agarrar a barbatana peitoral de sua base, incluindo a cartilagem corpo, na base da nadadeira, e levante esta off. Repita com a outra barbatana peitoral. Ocasionalmente, o coração sai com as nadadeiras peitorais, então examinar estas peças para certificar-se o coração não está conectado antes de descartá-los. NOTA: Neste ponto, o coração deve estar visível, ainda intacto e conectado à cabeça de peixe restante (embora ocasionalmente ele sai com as nadadeiras peitorais). O coração pode ser identificado pela sua forma, a sua cor-de-rosa, e os seus estar rodeado por pericárdio pigmentada. Porque a eutanásia dos peixes é realizada rapidamente, corações peixe acabado de eutanásia pode ainda estar batendo slowly. </li><li> Deixe de lado a cabeça de peixe com os primeiros fórceps, para que ambas as mãos segurando uma pinça e são gratuitas. Use as duas pinças de provocar o coração longe do pericárdio. Agarrar o coração pelo restante da aorta dorsal, enquanto o restante pericárdio é puxado para fora. NOTA: Se fixa ou fresco, o coração é robusto a suave puxando enquanto o tecido conjuntivo circundante é mais friável. Portanto, qualquer tecido de pericárdio circundante pode ser dissecado com o coração restante intacto. </li><li> Descarte a carcaça de peixe sobra no saco de risco biológico. </li></ol> 4. Prepare o coração para aplicações a jusante <ol><li> Utilizando uma pinça, segure o coração pela borda da aorta dorsal / arterial bulbus e colocar o coração no prato fresco de 1x PBS. Em alternativa, utilizar uma pipeta de transferência. Mova o coração e para trás na PBS cerca de 10x para lavar o máximo de sangue possível. </li><li> Para aplicações em que é importante para remover todos possibiliOs glóbulos le, lavar em uma placa de Petri de 9 centímetros, com 15 ml de tampão de lise de RBC em vez de PBS, usando o mesmo movimento de vai-e-vem. Se preservar a estrutura do coração não é importante para a aplicação a jusante (por exemplo, tornando o RNA), usar os fórceps ou microtesouras para abrir a cavidade do coração e facilitar enxaguando de células sanguíneas. </li><li> Para aplicações em que são desejados diferentes câmaras cardíacas, utilize uma pinça ou microtesouras para dissecar o bulbo arterial, átrio, e ventrículo afastados uns dos outros. </li><li> Transferir o coração, ou câmaras separadas, para o buffer de destino em gelo. NOTA: destinos comuns incluem buffers para dissociação celular, paraformaldeído 4%, ou Trizol. </li></ol>

<ol>
	<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome.">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li><li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiologic+dissection+of+the+vertebrate+cardiac+conduction+system.">Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system.</a> PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li><li>Manoli, M., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS)+of+fluorescently+tagged+cells+from+zebrafish+larvae+for+RNA+isolation.">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).</li><li>Cannon, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+haematopoietic+and+endothelial+transcriptome+during+zebrafish+development.">Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development.</a> Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , (1993).</li></ol>

The authors have no disclosures.

Embora os métodos para dissecar o coração de adulto peixe-zebra foram descritos, estes métodos foram demorada e normalmente causado dano ao coração durante a dissecção. Para realizar experiências onde pode ser necessário um grande número de coração do adulto, e / ou ao evitar a degradação do tecido do coração é importante para aplicações a jusante, o tempo necessário utilizando técnicas tradicionais de dissecção é proibitivo. Da mesma forma, a obtenção de reprodutível, corações intactos nã...

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration3.
More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.
Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.
Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >small tank for transporting fish</td>
			<td >Aquaneering</td>
			<td >ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fish net</td>
			<td >Petsmart</td>
			<td >36-16731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250mL glass beaker</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >14005-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9cm polystyrene petri dish</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >172958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >razor blade</td>
			<td >Personna American Safety Razor Company</td>
			<td >94-120-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >two Dumont #5SF forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dissecting microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >plastic transfer pipette</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gooseneck light source</td>
			<td >Dolan-Jenner Industries, Inc</td>
			<td >Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fluorescent light source</td>
			<td >Lumen Dynamics</td>
			<td >X-Cite 120Q</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >micro-scissors</td>
			<td >Biomedical Research Instruments, Inc</td>
			<td >11-1000</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RBC Lysis Buffer</td>
			<td >eBioscience</td>
			<td >00-4333-57</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recovery of adult zebrafish hearts for high-throughput applications

A utilização do sistema modelo para estudar o desenvolvimento do peixe-zebra, a regeneração, e a doença está a expandir para utilização de coração do adulto para dissociação de células e purificação de RNA, DNA e proteínas. Todas estas aplicações exigem a rápida recuperação de um número significativo de corações de peixe-zebra para evitar gene regulador, metabólicas e outras mudanças que começam após a morte. Corações de peixe-zebra adultos são também necessários para estudar a estrutura do coração para uma variedade de mutantes e para estudar a regeneração cardíaca. No entanto, a dissecção do coração do peixe-zebra tradicional é lento e difícil e requer ferramentas especializadas, tornando dissecção em larga escala de corações de peixe-zebra adultos tedioso. Os métodos tradicionais também abrigam o risco de danificar o coração durante a dissecção. Aqui, descrevemos um método para dissecção de corações peixe-zebra adulto que é rápido, reprodutível, e preserva a arquitetura coração. Além disso, este método não requer ferramentas especializadas, é indolor para o peixe-zebra,pode ser realizada em amostras frescas ou fixos, e pode ser realizado em peixes-zebra tão jovens como um mês de idade. A abordagem descrita amplia o uso de peixe-zebra adulto para a investigação cardiovascular.

Usando este método, um peixe-zebra coração adulto pode ser dissecado em menos de 1 minuto, em comparação com mais de 5 min, utilizando métodos tradicionais 8. Corações dissecados utilizando este método são seguramente intacta (Figura 2A), enquanto que os métodos tradicionais requerem 8 cortar cegamente no pericárdio e, portanto, comumente causar dano ou perda do átrio ou bulbus arterial (Figura 2B). Corações dissecados manter a sua integridade estrut...

Watch this Scientific Journal Video about Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications at JoVE.com

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

recovery-of-adult-zebrafish-hearts-for-high-throughput-applications

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K visualizações.  University of California San Francisco. Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.