Agradecemos a V. Zimmermann para a assistência técnica excelente e de cuidado dos peixes. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation suíço, número de concessão: 310000_120611.

1. Equipamento Set-up <ol><li> A principal ferramenta usada para executar cryoinjury é o cryoprobe, o instrumento pen-like que é feita de aço inoxidável (Figura 1A). O identificador cilíndrica é de 40 mm de comprimento e tem um diâmetro de 8 mm. A ponta do aplicador é de 6 mm de comprimento e 0,8 mm de diâmetro. A junção entre a ponta eo identificador é cónica 4 mm de comprimento. Além disso, o identificador do cryoprobe deve ser isolado com um tubo de plástico e fita para evitar o congelamento dos dedos enquanto mantém a ferramenta durante o procedimento. </li><li> Outros materiais que são necessários para a criocirurgia são um estereomicroscópio, fórceps afiadas, micro tesoura de mola de dissecação e uma pipeta de transferência de plástico. Além disso preparar um copo para anestesiar os peixes e uma colher de plástico para transferir o peixe. </li><li> Durante a cirurgia, os peixes são colocados em uma esponja úmida com o seu lado ventral para cima (Figura 1B). Para segurar o animal num procedimento estável, umaranhura apropriada deve ser cortado manualmente na esponja. </li><li> Preparar um tanque com água do sistema para transferir o peixe após a cirurgia. </li><li> Defina um temporizador duplo pela primeira vez com uma contagem regressiva de 10 segundos e, então, automaticamente contagem regressiva de 24 segundos. </li></ol> 2. O procedimento Cryoinjury <ol><li> Arrefecer a cryoprobe por imersão da ponta em 3-5 cm de azoto líquido durante pelo menos 3 min. </li><li> Anestesiar um peixe-zebra adulto por imergindo-o em tricaina 0,02% até o peixe se transforma em suas costas e suas brânquias quase parar de se mover (aproximadamente 90 segundos). </li><li> Transferir o peixe com uma colher de plástico a uma esponja húmido que foi cortado para segurar um peixe de cabeça para baixo (Figura 1B). Segure firme peixe com uma pinça, utilizando mão não dominante. Localizar visualmente a margem posterior medial do coração e usar a tesoura iridectomia retas para perfurar a pele. (Figura 1C). </li><li> Faça uma incisão (aprox. mm 2) pequeno acima do coração pelo cuObtenção de hetero anteriormente através da pele, dos músculos (Figura 1D). Não corte através do aparelho branquial óssea, como isso vai matar o animal. </li><li> Suavemente rasgar a camada prateada epitelial da hipoderme (Figura 1E), com a ponta da tesoura para ter um acesso directo ao ventrículo de bater. Não inserir as tesouras mais profunda na cavidade do corpo, como esta punção vontade do coração. O batimento cardíaco deve ser bem visível, e sem sangramento extensa deve ocorrer durante a toracotomia (Figura 1F). </li><li> Inicie o temporizador programado que foi definido para 10 segundos, seguido por 24 segundos. Durante 10 segundos tirar o cryoprobe a partir do azoto líquido. Certifique-se que não há mais nitrogênio no cryoprobe agitando-o suavemente. Espalhe a incisão lateral usando uma pinça para abrir o tórax (Figura 1F). </li><li> Uma vez que o temporizador anéis 10 segundos, tocar imediatamente, mas suavemente o ventrículo com a ponta do pre-arrefecida cryoprobe (Figura 1G). </li><li> Uma vez que os anéis do temporizador 24 segundos, despeje 2-3 mL de água do sistema usando uma pipeta de plástico para o baú para liberar a cryoprobe de tecido, e transferir os peixes no tanque com água do sistema. </li><li> O peixe deve reiniciar a respiração depois de alguns segundos, e então ele deve retomar a natação. Se ele não respirar após cerca de 45 segundos, estimular o animal por injecção de água nas guelras com uma pipeta de plástico, até que começa a respirar por si só. Na nossa experiência, 95% dos peixes sobreviver a cirurgia, e todas as mortes ocorrer no dia da cirurgia. Não será necessário para suturar incisões. </li></ol> 3. Colecção coração e Fixação <ol><li> Prepare 1 mL de formalina a 2% em um tubo de microcentrífuga de fixação do coração, duas pinças, micro-dissecando tesoura ea esponja húmida ranhurada. </li><li> No dia seleccionados após cryoinjury, euthanize o peixe em tricaina 0,1% durante 5 minutos. </li><li> Colocar opeixe lado ventral para cima em uma esponja, úmido entalhada. Faça uma incisão (cerca de 4 mm) grande acima do coração através da cartilagem branquial com a tesoura micro dissecação. Abra amplamente incisão a com uma pinça (Figura 1H). </li><li> Beliscar fora do bulbo arterial, uma estrutura branca anterior para o ventrículo (Figura 1 HI), e remover o coração da cavidade puxando-o. Um todo o coração dissecado é mostrado na Figura 1J e Figura 2a. </li><li> Coloque até 3 corações para um tubo de microcentrífuga com 1 ml de formalina a 2%. Suavemente ligar o tubo várias vezes e mantê-lo durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 4. Coração de montagem <ol><li> Lavar os corações em PBS durante 5 minutos. Transfira os corações em 10 mL de sacarose a 30% que devem ser pré-arrefecido a 4 ° C, e misturar suavemente. A amostra deve inicialmente flutuar na superfície da solução de sacarose. Continue a incubação durante 1 hora e 20 minutos a 4 ° C. DepoisNeste momento, os corações irá afundar para o fundo do tubo. </li><li> Prepara-se uma caixa com gelo seco. Tomar um molde de encaixe, e verta uma camada de 5 mm de outubro meio de montagem na parte inferior do molde. </li><li> Com uma pinça colocar o coração no T OC meio de montagem no molde. Sob o microscópio estereoscópico, ajustar a orientação do espécime para atingir o ápice ventricular na parte inferior do molde, eo bulbus arterial em direcção ao topo. </li><li> Colocar os moldes com a amostra em gelo seco. Quando o meio de montagem começa a congelar, encher o resto do molde com o meio de outubro e deixá-lo congelar completamente. Manter o molde durante pelo menos 1 h à temperatura de -80 ° C antes de seccionamento. A amostra congelada pode ser armazenado durante muitos meses à temperatura de -80 ° C. </li></ol> 5. Corações seccionadoras <ol><li> Configurar um criostato com um tamanho de corte de 16 uM, uma temperatura da câmara de -24 ° C ea temperatura da amostra a -22 ° C. </li><li> Colocar o bloco congelado com oespécime no criostato e fixar a sua orientação para iniciar o corte paralelo para a parte inferior do bloco. </li><li> Preparar seis Superfrost-plus lâminas por um bloco e numerar-os de 1 a 6. Inicie o corte até o tecido é atingido, e cortar o bloco em torno da amostra com uma lâmina. </li><li> Para obter 6 repetições de um coração, ocupam a primeira seção slide 1, a segunda seção no slide 2, o terceiro em slide 3, etc Uma vez que você colocou a sexta seção em slide 6, reinicie com slide 1 e continuam até o órgão inteiro é cortado. Coletar duas fileiras de cerca de 8 seções no slide (Figura 3). </li><li> Deixe as lâminas seca durante 1 hora à temperatura ambiente. Armazená-los durante até 1 ano em caixas hermeticamente fechados a -20 ° C. </li></ol> 6. Os resultados representativos Lesão cardíaca representativas seguindo este protocolo é mostrado na dissecados todo o coração a 4 DPCI (cryoinjury pós dia; Figura 2D-F). Para visualize o tecido do miocárdio in vivo, foram utilizados os peixes transgénicos expressando EGFP e DsRed2 nuclear sob o controlo de cardíaco promotor específico CMLC-2 11,12. A ausência de EGFP e DsRed2 sinais fluorescentes demarcada uma zona de enfarte em forma de disco ao longo da parede ventricular apical-lateral. Para realizar análises celulares e moleculares do tecido, os corações foram fixados e cortados com um criostato. Uma lâmina representativa com uma série consecutiva de secções transversais do coração é mostrado na Figura 3. As secções podem ser analisados ​​com vários métodos (Figura 4). Para determinar a extensão da regeneração cardíaca versus cicatrizes, foi realizada uma análise histológica utilizar o ácido Fucsina Orange-G (AFOG) de coloração, que diferencialmente rotula tecidos cardíacos e fibrótico 9. As análises de expressão de genes foram alcançados de acordo com o processo de hibridação in situ <sup&gt; 13. Para detectar a distribuição de proteínas marcadoras, aplicou-se imunofluorescência com anticorpos específicos 9. Uma combinação de procedimentos de coloração diversas conduz à identificação dos mecanismos moleculares e celulares envolvidas na cryoinjury cardíaca regeneração seguinte. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> Figura 1. Induzir cryoinjury do ventrículo no peixe-zebra adulto. (A) Uma fotografia do criossonda. (B) Um peixe-zebra adulto é colocado na fenda da esponja com o seu lado ventral para cima. (CF) incisão no peito para acessar o coração. (C) Um pequeno corte através da pele e musculatura é feita entre as duas aletas peitorais (linha vermelha). (D) A tesoura são inseridos na incisão para cortar a pele após a seta vermelha. (E) por debaixo da pele, a camada fina de hipoderme prateado (rodeado por linha tracejada azul) é suavemente aberta para acesso ao coração. (F) A incisão é espalhado com ofórceps e do ventrículo batendo (seta verde) é acessível para cryoinjury. (G) A cryoprobe frio é suavemente inserido no peito para tocar o coração. (HJ) coleta de coração. (H) A incisão profunda e longa é feita através dos arcos branquiais do tórax para acessar a cavidade pericárdica. Duas estruturas cardíacas são visíveis: bulbo arterial (seta branca) e do ventrículo esquerdo (seta verde). (I) O bulbo arterial é segurar com uma pinça e retirado da cavidade do corpo. (J) O coração inteiro é excisada a partir de do corpo. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> Figura 2. Controle Representante e corações dissecados cryoinjured de zebrafish transgênicos expressando EGFP adulto e DsRed2 nuclear em cardiomiócitos. (AC) ileso coração. (A) A iluminação de campo escuro mostra o ventrículo (V), bulbus arterial (Ba, branco) e as válvulas (Va), em que o átrio foi ligado para o ventrículo. (B e C) imagens fluorescentes de t<html> ele EGFP exibição intacta ventrículo e DsRed2 expressão em cardiomiócitos. (DF) Coração a 4 dias pós cryoinjury (4 DPCI) (D) A iluminação de campo escuro revela um enfarte em forma de disco (linha a tracejado amarelo). (EF) Cardiomyocyte marcadores EGFP e DsRed2 não são detectados na área do enfarte, indicando o miocárdio danificado (rodeado por linha tracejada). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> Figura 3. Seccionamento do coração. (A) de todo o coração com o desenho de secções transversais de partida a partir do fundo do coração (1 e 2, em vermelho) para o topo do coração (3 e 4 em verde). (B) Fotografia de um slide com a série de sucessivos cortes transversais corados com AFOG (fucsina ácida Orange-G). As primeiras seções (1 e 2, quadrados vermelhos) contêm o ápice ventricular, e as últimas seções do coração (3 e 4, quadrados verdes) compreendem bulbo arterial. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; A Figura 4. Exemplos de análise realizada em secções de coração a 7 dias pós cryoinjury. (A) AFOG etiquetas (fucsina ácida Orange-G) de coloração saudáveis ​​musculares células em laranja, o tecido da cicatriz contendo colagénio em azul e fibrina em vermelho. (B) A hibridação in situ da cadeia pesada da miosina ventricular (vmhc) ARNm visualiza o miocárdio intacta (coloração com azul). O tecido lesionado é desprovida da transcrição do gene cardíaco (linha tracejada vermelho). (C) imunoenzimático de tropomiosina (verde) rotula cardiomiócitos intactas e não tecido danificado (cercado com a linha pontilhada). DAPI (azul) manchas os núcleos de todas as células. (D) cardiomiócitos geneticamente marcadas expressa DsRed2 (vermelho) em seus núcleos. DAPI (azul) rotula todos os núcleos. A zona do enfarte não contém DsRed2 células positivas (linha a tracejado branco).

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+of+newt:+a+recipe+for+regeneration.">Heart of newt: a recipe for regeneration.</a> J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Ausoni, S., Sartore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fish+to+amphibians+to+mammals:+in+search+of+novel+strategies+to+optimize+cardiac+regeneration.">From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration.</a> J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).</li><li>Borchardt, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+regeneration+in+non-mammalian+model+systems:+what+are+the+differences+between+newts+and+man.">Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man.</a> Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).</li><li>Bos, E. J. v. a. n. d. e. n., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+cryoinjury-induced+myocardial+infarction+in+the+mouse:+a+comparison+with+coronary+artery+ligation.">A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).</li><li>van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoinjury:+a+model+of+myocardial+regeneration.">Cryoinjury: a model of myocardial regeneration.</a> Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).</li><li>Gonz&#225;lez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptin+and+pontin+antagonistically+regulate+heart+growth+in+zebrafish+embryos.">Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos.</a> Cell. 111, 661-672 (2002).</li><li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate.">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li><li>Chablais, F., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF+signaling+between+blastema+and+wound+epidermis+is+required+for+fin+regeneration.">IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration.</a> Development. 137, 871-879 (2010).</li><li>Baust, J. G., Gage, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+cryosurgery.">The molecular basis of cryosurgery.</a> BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).</li><li>Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+the+pathogenesis+of+heart+disease:+mechanisms+and+significance.">Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance.</a> Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).</li></ol>

A pesquisa experimental em animais foi aprovado pelo gabinete veterinário cantonal de Friburgo.

Cryoinjury é definido como o dano de tecido controlada pela aplicação precisa de 14 frio extremo. Choque térmico directo destrói as células por destruição de proteínas e por intracelular formação de cristais de gelo de fluido que rompe a membrana plasmática. Por conseguinte, as células lesadas morrer nos processos de apoptose e necrose 14. Ambos estes mecanismos de morte celular têm sido mostrados para contribuir para a perda de tecido após enfarte do miocárdio 15. Assim, cryoinjury representa um modelo adequado de induzir um enfarte cardíaco. Vários estudos têm relatado este método bem provado em vários mamíferos, incluindo camundongos, ratos, coelhos e suínos 6,7. A adaptação do protocolo cryoinjury em peixes-zebra permite uma discussão mais comparativa sobre a resposta do enfarte entre diferentes espécies. Dois outros grupos independentemente desenvolveu o procedimento cryoinjury para o coração do peixe-zebra adulto. As principais diferenças são o surmétodos Gery, o tipo de ferramentas e aplicado tempo de congelamento. No estudo de González et al-Rosa., O pericárdio foi aberto rasgando o tecido em vez de cortar. Usaram 0,3 filamento de cobre milímetros ligada a um tubo de poliamida pré-arrefecidos em azoto líquido para congelar o coração durante alguns segundos até descongelamento pode ser observado 10. No estudo de Schnabel et ai., Um pedaço de gelo seco cónico de 20 mm de comprimento com uma extremidade pontiaguda de 2 mm no seu diâmetro foi usado para tocar o coração durante 10 segundos 8. Os dois grupos obtiveram dano ventricular através da morte do miocárdio. A vantagem do nosso método é uma deposição mais reprodutível de colagénio-rico cicatriz, o que melhor imita as respostas precoces infarto de cura observados em sistemas de mamíferos. O passo crítico durante o procedimento de cryoinjury em peixes-zebra está a fazer uma incisão através da pele e do saco pericárdico sem puncionar o coração subjacente. Uma corretamente performed cirurgia provoca pouco sangramento. Sangramento profuso indica uma punção não-intencional do ventrículo com a tesoura. Em tais casos, os animais devem ser retraído a partir da experiência. A fim de evitar a perfuração do coração, do ponto de tesoura deve ser dirigida a um ângulo raso para a pele. Outro aspecto importante para a criação de uma lesão reprodutível é o posicionamento exacto da cryoprobe frio no ventrículo para a duração óptima preciso. Demasiado curto tempo de congelamento vai resultar em inflamação com a morte de células pouco. O congelamento prolongado, por outro lado, pode causar danos extensos do coração, o que pode levar à mortalidade melhorada dos animais. Nós determinamos que o tempo óptimo para segurar o ventrículo nas gamas estado congelado entre 23-26 segundos para um 2 centímetros peixe-zebra longo do adulto, que pode ser diferente dependente do tamanho dos animais. Porque o nosso protocolo é muito simples e rápida, não há nenhum limite experimentalções em sujeitando número suficiente de animais para obter adequados repetições biológicas. O tratamento criocirúrgico é muito bem tolerada pelos animais. Colecção dos corações em momentos diferentes após cryoinjury permite a caracterização detalhada das fases subseqüentes durante o processo regenerativo. A análise experimental dos corações cryoinjured pode incluir 1) visualização da transcrição de genes por hibridização in situ, 2) detecção de distribuição de proteína por coloração imunofluorescente, 3) imagiologia histológica de estruturas diferentes. Compreender os processos de cura chave após infarto do miocárdio em zebrafish terá impacto no campo da biologia regenerativa. Além disso, pode ser benéfico para a concepção de novas abordagens terapêuticas em medicina regenerativa.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Micro dissecando tesoura mola </td><td> Roboz Surgical Instrument Co., Inc. </td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Formaldeído ~ 36% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 47630 </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84100 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek composto outubro </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Lâminas SuperFrost Plus </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Descasque-A-Way descartáveis ​​Moldes - Moldes Embedding truncadas T8 </td><td> Polyscience, Inc. </td><td> 18985 </td></tr></tbody></table>

induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury

O coração de mamífero é incapaz de regeneração significativa na sequência de uma lesão aguda, tais como enfarte do miocárdio 1. Em contraste, urodele anfíbios e peixes teleósteos reter uma notável capacidade para a regeneração cardíaca com pouca ou nenhuma cicatriz ao longo da vida 2,3. Não se sabe porque apenas alguns vertebrados não-mamíferos pode recriar um órgão completo a partir de tecidos remanescentes 4,5. Para entender as diferenças moleculares e celulares entre as respostas regenerativas em espécies diferentes, é preciso usar abordagens semelhantes para induzir lesões agudas. Nos mamíferos, o modelo mais utilizado para estudar reparação cardíaca tem sido isquemia aguda após a ligadura da artéria coronária ou destruição do tecido após cryoinjury 6,7. A regeneração cardíaca em salamandras e peixes-zebra tem sido predominantemente estudada após uma ressecção parcial do ventrículo ápice 2,3. Recentemente, vários grupos têm establtada a técnica cryoinjury em 8-10 peixe-zebra adultos. Este método tem um grande potencial porque permite uma discussão comparativo dos resultados obtidos a partir das espécies de mamíferos e não mamíferos. Aqui, nós apresentamos um método para induzir um enfarte em forma de disco reprodutível do ventrículo peixe-zebra por cryoinjury. Este modelo de lesão é baseada sobre o tecido de congelamento-descongelamento rápido, o que resulta na morte da célula maciça de cerca de 20% de cardiomiócitos da parede ventricular. Primeiro, uma pequena incisão foi feita através do peito com uma tesoura iridectomia para acessar o coração. A parede ventricular foi congelado diretamente através da aplicação de 23-25 ​​segundos, uma criossonda aço inoxidável pré-arrefecido em azoto líquido. Para parar o congelamento da água de peixe coração, à temperatura ambiente foi lançada sobre a ponta do criossonda. O procedimento é bem tolerado pelos animais, com uma taxa de sobrevivência de 95%. Para caracterizar o processo regenerativo, os corações foramcoletados e fixados em diferentes dias após cryoinjury. Posteriormente, a amostra foram incorporadas para cryosectioning. As lâminas com secções foram processadas para análise histológica, hibridação in situ e imunofluorescência. Esta empresa aumenta a nossa compreensão dos fatores que são necessários para a plasticidade regenerativa no peixe-zebra, e fornecer novos insights sobre os mecanismos de regeneração cardíaca. Um entendimento conceitual e molecular da regeneração cardíaca em zebrafish afetará tanto a biologia do desenvolvimento e da medicina regenerativa.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury at JoVE.com

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Zebrafish representa um modelo útil para estudar os mecanismos de regeneração do coração nos vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para a indução de um infarto do coração em adultos usando cryoinjury zebrafish. Este método resulta em morte celular maciça dentro de 20% da parede ventricular, semelhantes às observadas em infartos de mamíferos.

Indução de Infarto do Miocárdio em Zebrafish adultos usando Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

induction-of-myocardial-infarction-in-adult-zebrafish-using-cryoinjury

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K visualizações.  University of Fribourg, Fribourg, Switzerland. Zebrafish representa um modelo útil para estudar os mecanismos de regeneração do coração nos vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para a indução de um infarto do coração em adultos usando cryoinjury zebrafish. Este método resulta em morte celular maciça dentro de 20% da parede ventricular, semelhantes às observadas em infartos de mamíferos.

Vídeo: Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Medicina

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Ressonância magnética e PET no rato modelos de Infarto do Miocárdio

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Infarto do Miocárdio e Avaliação de Resultados Funcional em porcos

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal procedimento cirúrgico invasivo de induzir Infarto do Miocárdio em Ratos

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

Avaliação do resultado principal em um modelo suíno de Infarto Agudo do Miocárdio

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Infarto do miocárdio em ratos neonatais, um modelo de regeneração cardíaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any potential therapeutic approach directed against acute left ventricular (LV) dysfunction. Current imaging modalities (e.g., echocardiography and magnetic resonance imaging) have several limitations since data on LV pressure cannot directly be measured. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion could serve as a novel method for a real-time evaluation of LV function.
At the beginning of the procedure, mice were anesthetized followed by endotracheal intubation. For LV catheterization, the right carotid artery was exposed via middle-neck incision. The catheter was introduced and placed into the LV cavity. Left thoracotomy was conducted and the left main coronary artery (LCA) was ligated. To induce reperfusion, the suture was released after 45 min. Pressure-volume data was recorded at all times.
Ligation of the LCA caused a decrease in LV systolic function as evidenced by a 30% reduction in stroke volume, LV ejection fraction (EF), and cardiac output. Maximum dP/dt as a parameter for LV contractility was also significantly reduced and diastolic function was severely impaired (minimum dP/dt -40%). Reperfusion over a period of 20 min did not lead to a complete recovery of LV function.
Real-time pressure-volume analysis served as a valid procedure for monitoring cardiac function during acute myocardial infarction in mice. Maintaining stable anesthesia and a standardized surgical approach was crucial to ensure valid results. As the early phase of acute myocardial infarction is critical for morbidity and mortality, the delineated method could be beneficial for preclinical evaluation of new strategies for cardioprotection.

Acute myocardial infarction in mice induces acute but incompletely characterized changes in left ventricular (LV) function. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion serves as a novel method for a real-time evaluation of LV function.

Análise em tempo real de pressão-volume de infarto agudo do miocárdio em ratos

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Um modelo Crioferimento para estudar infarto do miocárdio no mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...