We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da lei alemã e estado de Berlim; manuseio do peixe-zebra foi monitorada pela autoridade local para a protecção dos animais (LaGeSo, Berlin-Brandenburg). 1. A obtenção de embriões Zebrafish para Coração Extração <ol><li> Peixe-zebra repórter cardíaca transversal tal como a Tg (myl7: EGFP) twu34 linha transgénica 9, a fim de se obter os embriões com expressão específica do coração GFP. </li><li> Manter os embriões em água ovo a 28,5 ° C, até a fase embrionária pretendida 10,11. Certifique-se de que a população embrião coletado é homogênea tanto geneticamente e por estágio de desenvolvimento para limitar as variações na expressão gênica. </li><li> Dechorionate os embriões manualmente. </li></ol> 2. Dissecando Zebrafish embrionárias Corações NOTA: Mantenha todas as soluções em gelo. Se possível, fazer o trabalho em equipe: uma pessoa disseca os corações do embtabaco de enrolar enquanto outra pessoa classifica os corações sob a lupa de fluorescência. Isto permite que o tratamento de várias centenas de embriões em algumas horas. <ol><li> Transferir cerca de 100 embriões para um tubo de centrifugação de 1,5 ml. Anestesiar os embriões com tricaína (0,16 mg / ml em meio de E3). Continuar uma vez que os embriões são claramente anestesiados (eles não nadar e sedimentos para o fundo do tubo, mas os seus corações são ainda batendo). </li><li> Remover a solução / E3 tricaina e lavar os embriões, uma vez com 1 ml de L-15/10% de FBS e manter em gelo. NOTA: O meio com FBS a L-15/10% é importante para manter os órgãos e células vivos durante todo o procedimento de dissecção até que os corações foram transferidos para RNAlater ou Trizol. </li><li> Adicionar 1 ml L-15/10% de FBS para os embriões e pipeta cima e para baixo 5-8 vezes com uma rodada Gel Carregando Dica até que a gema é completamente interrompido. Pipetar os embriões gota a gota sobre a superfície da solução, de modo que a queda vai rebentar eos embriões são suavemente interrompido. NOTA: Como vigorosamente e quantas vezes os embriões têm de ser pipetados cima e para baixo depende do estágio de desenvolvimento dos embriões, ou seja, mais de pipetagem é necessária em estágios finais (por exemplo, a 56 hpf). </li><li> Para o primeiro lote de embriões dissecados, avaliar a integridade dos embriões e a proporção de corações dissecados sob microscópio estereoscópico, uma vez que alguns corações podem permanecer solidários com os embriões se pipetaram muito gentilmente. Ajuste o modo de pipetagem para as próximas rodadas de dissecção de acordo. NOTA: Use baixos dicas retenção pipetas e tubos de microcentrífuga para minimizar corações degola ao plástico. </li><li> Aplicar a amostra para um filtro de 100 um colocado em um tubo de 50 ml de centrifugação; enxaguar o tubo de 1,5 mL com 1 mL de meio L-15/10% de FBS e, em seguida, aplicar essa para o filtro, a fim de minimizar a perda da amostra (alguns corações pode ser aderente às paredes do tubo). Lavar o filtro duas vezes com 1 ml de L-15 / 10% de FBS. Neste passo os corações passar através do filtro e são recolhidas no tubo de 50 ml. </li><li> Aplicar o fluxo de passagem para um filtro de 30 mm colocada sobre um tubo de centrifugação de 15 mL e lavar o filtro uma vez com 1 ml de L-15/10% de FBS. Neste segundo passo de filtração, os corações são retidas no filtro e pequenos detritos é lavado. </li><li> Ligue o filtro de cabeça para baixo e lavar os corações para fora do filtro para um 1% de agarose revestidos por placa de Petri por aplicação de três lavagens consecutivas com 1 ml de L-15/10% de FBS. </li><li> Separar manualmente corações GFP positivas a partir dos detritos embrionário não fluorescente (por exemplo, lentes oculares) com um par de pinças sob um estereomicroscópio fluorescência e concentrá-las no centro do prato. Recolha-os de acordo com a etapa 3. NOTA: Se os embriões são mais velhos do que 24 hpf, o coração deve ser de bater, o que indica que os tecidos ainda estão fisiologicamente normal. </li></ol> 3. Isolamento de mRNA a partir de dissecçãoted Corações <ol><li> Recolha os corações no menor volume possível (por exemplo, 10 ul) e pipeta em um tubo de 1,5 ml contendo 0,75 ml RNAlater (no gelo). Verifique se não há corações permanecer na ponta da pipeta por vê-lo sob um microscópio estereoscópico fluorescência. </li><li> Como alternativa, se um capuz químico está disponível nas imediações de um microscópio de fluorescência, transferir os corações coletados em Trizol (CUIDADO) sob o capô química. Isto evita a possível perda de corações que furam na ponta da pipeta e também durante a centrifugação dos corações (passos 3.4, 3.5 e 3.7). Reúnem-se os corações de várias rodadas de isolamento no mesmo tubo com Trizol e ir diretamente para a etapa 3.8; o volume final não deve exceder 10% do volume inicial de Trizol. NOTA: Leia a Ficha de Segurança Trizol Produto (FDSP) antes do uso. Pega reagente Trizol sob um capuz e desgaste recomendado Equipamento de Proteção Individual. Evitar o contacto com a pele, olhos e clothing. Remova todas as fontes de ignição. </li><li> Reúnem-se os corações de várias rondas de isolamento no mesmo tubo com RNAlater (em gelo), como a eficiência de isolamento de ARN aumenta com a quantidade de tecido recolhido. Se o volume total da amostra for superior a 10% do volume inicial RNAlater, utilizar um tubo adicional com 0,75 ml RNAlater para armazenamento (em gelo). </li><li> Centrifuga-se as amostras a 15.700 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar os corações. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico de fluorescência, recolher cuidadosamente, tanto sobrenadante quanto possível num revestidos por placa de Petri de agarose 1% contendo 3 ml de L-15/10% de FBS, mas não perturbe os corações sedimentadas no fundo do tubo de centrifugação. Uma vez que até 15% dos corações pode permanecer no sobrenadante devido à elevada viscosidade do RNAlater, recuperá-los, tal como descrito na etapa 3.7. </li><li> Dentro de uma câmara química, adicionar 0,5 ml de Trizol para o tubo contendo os corações sedimentadas e manter em gelo. </li><li> Sob o microsco fluorescentepe, transferir os corações (a partir do passo 3.5) a partir do 1% de agarose revestidas de prato contendo solução de FBS RNAlater / L-15/10% em outro prato revestido de agarose a 1% com 3 ml de L-15/10% de FBS para diluir a RNAlater. Recolher os corações no centro da placa de petri e transferi-las num volume pequeno para o tubo de corações sedimentados em Trizol sob uma coifa química. </li><li> Vortex o tubo de 1,5 ml contendo os corações em Trizol para interromper o coração e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Dentro de uma câmara química, adicione 100 clorofórmio ul (CUIDADO), misturar bem e transferir a solução / clorofórmio Trizol em um 1,5 ml pré-fiado tubo PLG (centrífuga 30 segundos a velocidade máxima antes de usar). Incuba-se durante 3 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Leia as MSDS clorofórmio antes de usar. Pega reagente clorofórmio, sob um capuz e desgaste recomendado Equipamento de Proteção Individual. Evitar o contacto com a pele, olhos e vestuário. Manter longe de incompatíveis, como os metais, álcalis. </li><li> Centrifuge a amostra a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C, e transferir a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 ml. </li><li> Junte 5-10 ug de glicogénio e 250 pi pré-arrefecida (-20 ° C) isopropanol; misturar bem e incubar durante a noite a -20 ° C. </li><li> Centrifuga-se a amostra a 15.700 xg durante 30 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 75%, centrifugar a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. </li><li> Deixe evaporar o etanol por secagem do sedimento à temperatura ambiente até se tornar branco (por exemplo, para 10-15 min). </li><li> Adicionar 20 ul de ARNase isento de ddH2O para o sedimento e incubar durante 10-15 min a 55 ° C para dissolver o ARN; em seguida, manter em gelo. </li><li> Avaliar a concentração de ARN e pureza por medição de absorvância. Avaliar a integridade do RNA por a execução da amostra sobre um gel de agarose a 1%. </li></ol>

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. 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J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry).">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish.">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li><li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins.">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li><li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo permite o rápido enriquecimento do tecido do coração embrionário do peixe-zebra por análises de expressão de genes. A quantidade e qualidade da amostra de RNA específico cardíaca depende muito de alguns passos cruciais: primeiro, a quantidade da amostra é muito melhor se a perda de corações é impedida em cada etapa do protocolo, uma vez que a purificação RNA só funcionará com suficiente material de partida. Em segundo lugar, a pureza da amostra, o que depende inteiramente do experimentador...

Peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente usada na biologia do desenvolvimento para estudar a organogénese in vivo, devido à sua rápida, transparente e extra-uterina do desenvolvimento embrionário, combinada com o tamanho pequeno e a disponibilidade de linhas repórter transgénicos com expressão específica para um tecido de proteínas fluorescentes. Este pequeno vertebrado é particularmente adequado para estudar o desenvolvimento do coração, já que oxigenação do embrião de peixe-zebra cedo não depende de batimento cardíaco e fluxo sanguíneo; esses recursos permitiram a caracterização de um grande número de mutantes cardiovasculares 1,2 e o peixe-zebra é agora um organismo modelo amplamente reconhecido para estudar doenças cardíacas 3. Para estudar a expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário, as transcrições são comumente analisados ​​por todo o monte de hibridização in situ (DESEJO) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, ou sequenciamento de próxima geração (RNA-Seq) 7. EnquantoDESEJO permite uma análise espacial-temporal da expressão gênica dentro de todo o embrião, níveis de transcrição são geralmente avaliada por RT-qPCR, microarrays ou abordagens de RNA-Seq. No entanto, estes métodos requerem enriquecimento tecido específico para perfil de expressão gênica. Uma vez que o coração embrionário do peixe-zebra representa uma pequena fracção da totalidade do embrião, estudos transcriptoma durante o desenvolvimento cardíaco requerem um protocolo de dissecção e enriquecimento de corações. Além disso, para obter dados fisiologicamente relevantes, é importante para manter o tecido cardíaco totalmente funcional até a extracção de ARN. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar rapidamente fisiologicamente normal e corações batendo de centenas de embriões de peixes-zebra para se obter eficiência amostras de RNA de alta qualidade para análises posteriores. O presente método é baseado no protocolo descrito por Burns e MacRae, 2006 8. Para o enriquecimento de tecido cardíaco, ambos os métodos de usar uma linha de miocárdio repórter transgénicoe tirar vantagem das propriedades de adesão diferencial de corações de peixes-zebra embrionários contra outros tecidos. Resumidamente, por pipetagem muitos embriões cima e para baixo através de uma ponteira estreita, corações são simultaneamente lançado a partir de corpos embrionárias e, posteriormente, separados dos restos embrionários em duas etapas de filtração rápida; corações marcados com fluorescência são então classificadas manualmente a partir de detritos remanescentes e recolhidos para posterior processamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment for raising fish and collecting eggs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see the Zebrafish Book11 for details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid electrophoresis chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dishes 4cm &#216;, coated with 1% agarose in E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,5ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15ml and 50ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pair of Dumont #5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ExactaCruz&#8482; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&#956;l&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-201732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 &#956;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 &#956;m filter (Pre-Separation Filters-30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes&#160;</td>
			<td>Prime</td>
			<td>2302810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Egg water medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60&#956;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E3 medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose (in E3 medium)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose gel (in TBE buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#180;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAlater</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>1559606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td>20 &#181;g/&#181;L in RNase-free water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

O coração embrionário do peixe-zebra é composta de apenas algumas centenas de células, o que representa apenas uma pequena fracção de todo o embrião. Portanto, para evitar o transcriptoma cardíaca de ser mascarado pelo transcriptoma embrionário global, é necessário recolher um número suficiente de corações para análises posteriores. Além disso, como o desenvolvimento do peixe-zebra cardíaca processe rapidamente, a recolha do coração e métodos de extracção de ARN precisa de ser rápido, a fim de assegurar homogeneidade das amostras. Aqui, apresentamos um protocolo de dissecção Manual rápido para a coleta / corações batendo funcionais a partir de embriões de peixes-zebra. Este é um pré-requisito essencial para a extração de RNA cardíaca específica posterior para determinar os níveis de expressão de genes específicos cardíaca por análises de transcriptoma, como em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR). O método baseia-se nas propriedades adesivas diferenciais do coração embrionário do peixe-zebra em comparação com outros tecidos; esta permite a rápida physeparação de Sical cardíaca a partir de tecido extracardiac por uma combinação de fluídico rompimento força de cisalhamento, filtração por etapas e coleta manual de transgênicos corações marcados com fluorescência.

Aqui, descrevemos uma experiência representativa dissecção do coração utilizando o peixe-zebra Tg (myl7: GFP) twu34 linhagem transgênica 9, que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) exclusivamente dentro do miocárdio (Fig. 1). Foram coletadas ambos os corações dissecados e dos embriões a partir da qual eles foram derivados a avaliar a pureza da amostra coração. Resumidamente, homozigoto Tg (myl7: GFP) twu34 peixe-zebra 9 foram outcrossed c...

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Para analisar os perfis de expressão de genes cardíacos durante o desenvolvimento do coração de peixe-zebra, o RNA total foi de ser extraído do coração isolado. Aqui, apresentamos um protocolo para a coleta / corações batendo funcionais por um rápido esvaziamento manual a partir de embriões de peixes-zebra para obter mRNA específico cardíaca.

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.2K visualizações.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  Para analisar os perfis de expressão de genes cardíacos durante o desenvolvimento do coração de peixe-zebra, o RNA total foi de ser extraído do coração isolado. Aqui, apresentamos um protocolo para a coleta / corações batendo funcionais por um rápido esvaziamento manual a partir de embriões de peixes-zebra para obter mRNA específico cardíaca. 

Vídeo: Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Biologia do Desenvolvimento

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously applied large scale EM to human skin pancreatic islets, tissue culture and whole zebrafish larvae1-7. Here we describe a universally applicable method for tissue-scale scanning EM for unbiased detection of sub-cellular and molecular features. Nanotomy was applied to investigate the healthy and a neurodegenerative zebrafish brain. Our method is based on standardized EM sample preparation protocols: Fixation with glutaraldehyde and osmium, followed by epoxy-resin embedding, ultrathin sectioning and mounting of ultrathin-sections on one-hole grids, followed by post staining with uranyl and lead. Large-scale 2D EM mosaic images are acquired using a scanning EM connected to an external large area scan generator using scanning transmission EM (STEM). Large scale EM images are typically ~ 5 - 50 G pixels in size, and best viewed using zoomable HTML files, which can be opened in any web browser, similar to online geographical HTML maps. This method can be applied to (human) tissue, cross sections of whole animals as well as tissue culture1-5. Here, zebrafish brains were analyzed in a non-invasive neuronal ablation model. We visualize within a single dataset tissue, cellular and subcellular changes which can be quantified in various cell types including neurons and microglia, the brain&#39;s macrophages. In addition, nanotomy facilitates the correlation of EM with light microscopy (CLEM)8 on the same tissue, as large surface areas previously imaged using fluorescent microscopy, can subsequently be subjected to large area EM, resulting in the nano-anatomy (nanotomy) of tissues. In all, nanotomy allows unbiased detection of features at EM level in a tissue-wide quantifiable manner.

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

Transmissão de digitalização em grande escala Electron Microscopy (Nanotomy) de saudável e Ofendidos Zebrafish Cérebro

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

Redução cirúrgica do tamanho do zebrafish para o estudo da escala padrão embrionária

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.