Os autores gostariam de agradecer a Ph.D. estudante Marta Bisio para cultivar e manutenção de redes neuronais mais de microeléctrodos Arrays e Dr. Marina Nanni e Dr. Claudia Chiabrera de NBT-IIT para a assistência técnica para os procedimentos de dissecação e de dissociação. A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Jovem Explorers esquema) ao abrigo do contrato de concessão n ° 284772 BRAIN BOW ( <a href="http://www.brainbowproject.eu">www.brainbowproject.eu</a> ). Os autores também gostaria de agradecer a Silvia Chiappalone por sua ajuda na produção dos gráficos utilizados na introdução.

1. Preparação de Cultura neuronal ao longo de um MEA <ol><li> Placa culturas neuronais em chips da MEA, conforme descrito 29. A descrição de um procedimento semelhante também é fornecida 9 e na secção Discussão. </li><li> Ligar o sistema de aquecimento MEA em 5-10 min antes de começar a gravação para minimizar o stress térmico de células: alvo definido temperatura do controlador de temperatura para 37 ° C e ligar a placa de aquecimento inferior ao próprio (fornecido no mais comercial MEA sistemas de MEA) e, se disponível, uma tampa aquecida de modo a reduzir significativamente a evaporação. </li><li> Esterilizar cápsulas permeáveis ​​ao gás antes de cada utilização num autoclave com calor húmido-(30 min, 130 ° C). Para evitar a evaporação e evitar alterações na osmolaridade, manter as culturas cobertas com tampas durante a gravação. </li><li> Coloque a cultura neuronal no amplificador 30 min antes de começar a gravação. NOTA: Basta mover as culturas do incubator para o amplificador irá perturbar significativamente a atividade espontânea por cerca de meia hora. Durante este tempo, a cultura temperatura média vai se estabilizar. </li><li> Se um circuito carbair está disponível, dar início à circulação de carbair (uma mistura de 5% de CO 2 e 95% de O 2 + N 2) para experiências mais longos do que um par de horas: culturas exigirá que, a fim de manter ambos os níveis de oxigénio e de pH estável. </li></ol> 2. Seleção de parâmetros de gravação para MEA Acquisition <ol><li> Selecione a largura de banda do filtro de software para detectar picos (ou seja, a atividade Multi-Unit - MUA) 30: na forma RawDataDisplay marcar a caixa de seleção &quot;300 Hz-3 kHz &#39;. </li><li> Comece a aquisição de dados: pressione o botão &quot;Iniciar&quot; na forma RawDataDisplay. </li><li> Ganho de ajuste Threshold para a detecção de pico no RawDataDisplay a 7. NOTA: Dependendo da especificidade / seletividade tradeoff desejado e no adotada detectaralgoritmo de iões, este limite pode ser ajustado entre 6 e 10 vezes o desvio padrão calculado. </li><li> Jogo de Memória Threshold para 2 seg e pressione o botão &quot;Lock&quot; quando nenhuma atividade spiking é visível no display (ambos os comandos estão na forma RawDataDisplay). Marcar o &#39;SD Estimativa da mediana&#39; para o cálculo do desvio padrão do ruído a partir da mediana do valor absoluto do sinal observado 31,32, se é difícil fornecer mesmo janelas de tempo curtos sem actividade cravação. Remova a marca de esta opção após pressionar o botão &quot;Lock&quot;, como o algoritmo subjacente é computacionalmente intensivo e pode fazer com que o PC a ficar. </li><li> Ligue rotina de detecção de pico (checkbox &#39;Detecção Spike&#39; na forma RawDataDisplay). Se a detecção de pico já está em execução (ou seja, a caixa de seleção já está marcado), descarte picos detectados até o momento, clicando no botão &quot;Reset&quot; na forma de gravação de dados. </li></ol> 3. Seleção de MEA eletrodos para estimular a computação neuronal Cultura e Response Mapa <ol><li> Grave atividade espontânea das células neuronais cultivadas através da MEA para 30 min: salvar dados em um arquivo clicando no botão &#39;Record&#39;, na caixa &#39;Spikes »do formulário DataRecording, após a quantidade desejada de tempo decorrido (30 min, neste caso). </li><li> Identificar os 10 canais mais ativos (ou seja, 10 canais com maior contagem de pico), em seguida, selecionar os canais em qualquer um dos layouts MEA (tanto na codificação, decodificação ou Connection Mapa formas), arrastando o cursor do mouse sobre as áreas desejadas. Uma vez que os canais são selecionados, clique direito em qualquer lugar no layout MEA e selecione &quot;Adicionar à esquerda área sensorial &#39;no menu pop-up: esses eletrodos serão utilizados para entregar a estimulação elétrica na etapa 3.5. </li><li> Verifique se estimulador e amplificador MEA estão conectados corretamente: todas as configurações require dois fios por canal estimulação desejado, enquanto um cabo coaxial extra serão necessários para transportar o sinal de sincronia (por favor, consulte os manuais dos instrumentos especificas para diagramas de conexão). Prossiga então para transformar o estimulador por diante. </li><li> Definir parâmetros de estímulo na forma Connection Mapa. Todos os estímulos entregues à cultura são ondas de tensão praça bifásicos. Definir meia de duração para 300 ms e amplitude de 1,5 V pp 33. NOTA: Os estímulos grande o suficiente para evocar respostas neurais de forma confiável, muito provavelmente, o compromisso registro da atividade a partir dos mesmos sites. No resto do papel, eletrodos utilizados para entrega estimulação não deve ser selecionada para a gravação de qualquer informação relevante. </li><li> Gravar para a estimulação de resposta: pressione o botão Iniciar na forma ConnectionMap. Uma série de 30 estímulos, com um intervalo de 5 segundos é, por sua vez, entregues automaticamente a partir de cada um dos eléctrodos escolhidos, enquanto que as respostas são fichaed dos restantes 59 eléctrodos. </li><li> Calcular um mapa de ligação (ou seja, a probabilidade de observar uma resposta de um eléctrodo dentro de um intervalo de tempo após a entrega do estímulo de um eléctrodo diferente) para cada canal de estimulação através de qualquer software ou SpyCode matemática, uma aplicação desenvolvida no passado (e livremente disponíveis mediante solicitação) para realizar cálculos em dados neurais 28. </li><li> A partir dos mapas de conexão, selecione melhores eletrodos: descartar todos os eletrodos estimulantes que não evocam respostas (ou seja, na janela de tempo após a estimulação, disparando as taxas não são significativamente mais elevados do que durante a queima espontânea). <ol><li> Escolha, entre os eletrodos restantes, a par com o mínimo de transpor nas respostas. Especificamente para cada eletrodo estimulante, calcular a média de contagem de pico em cada eletrodo de registro, em seguida, calcular a diferença entre os eletrodos correspondentes para todos os eléctrodos de estimulação pares. Selecione o casal para which a soma dos valores absolutos das diferenças de resposta ao longo de todos os canais de gravação é maior. </li></ol></li><li> Escolha um desses eletrodos para codificar informações sensoriais do lado esquerdo do robô e outro para codificar leituras a partir do lado direito: a fim de fazer isso, arraste o cursor do mouse sobre um eletrodo, clique com o botão direito sobre o layout MEA em seguida, selecione &quot;Adicionar à esquerda área sensorial&quot; (ou &quot;Adicionar a área sensorial direito&quot;). </li></ol> 4. A interface da Cultura Neuronal com o Robot: Seleção de Codificação e esquemas de decodificação <ol><li> Definir &#39;Tipo de Codificação &quot;sob a forma de codificação para Linear. </li><li> Definir as taxas mínimas e máximas de estimulação na forma de codificação. Use o intervalo padrão de 0,5-2 Hz. </li><li> Defina o parâmetro &quot;Jitter&quot; sob a forma de codificação para 0. </li><li> Defina os parâmetros do algoritmo de decodificação no Formulário de Decoding (peso e coeficiente de extinção) para 1, para uma cultura moderadamente ativos (~ 1 spike / s por channel). Definir um novo par parâmetro se as taxas de queima fortemente e constantemente desviar-se este valor. Veja a discussão para a função exata de parâmetros de descodificação. </li><li> Defina o algoritmo de decodificação parâmetros de rajada no Formulário de decodificação. Peso estabelecido para 0 (tempo de decaimento é então irrelevante), a menos que distinção entre picos e explosões é o objecto de estudo. NOTA: Os valores sugeridos na etapa 4.4 irá produzir movimentos do robô lisas e velocidades compatíveis com os tempos de reação do robô para culturas primárias de rato moderadamente ativos. Os parâmetros de rajada têm exactamente a mesma função que as descritas na etapa 4.4, mas o evento de disparo é a detecção de uma rajada, em vez de um pico: a velocidade real de cada roda é simplesmente a soma das contribuições de picos detectados e rajadas. </li></ol> 5. Projeto de Navegação Arena para a Robot <ol><li> Na forma Designer Virtual Arena, escolher entre delimitada (os limites da arena são visíveis para o robô e impassable) ou infinita (se as saídas do robô de um lado da arena, ele será imediatamente re-entra a partir da frente um) arena e definir o tamanho da arena em pixels. <ol><li> Não utilizar espaços delimitados menores do que 100 x 100 pixels, a fim de permitir o movimento significativo. Não use os obstáculos com um raio menor que 5 pixels como eles podem simplesmente cair entre as linhas de visão do robô. </li><li> Tenha em mente que muito grandes tamanhos de arena pode causar o desempenho do computador para se degradar: se uma grande arena é necessária, o desempenho do software de teste com a arena desejada antes de iniciar difícil de repetir os experimentos. </li></ol></li><li> Definir robô posição inicial manualmente (clique no botão &quot;Seleção manual&quot; na forma Arena Designer Virtual, em seguida, o local desejado) ou especificando as coordenadas do robô no experimento começar no &#39;Robot Iniciando posição campos. </li><li> Adicione qualquer número de obstáculos intransponíveis na arena. Ou colocá-los homemually na arena após clicar no botão &quot;Adicionar Obstacle manualmente&quot; ou definir o número e tamanho do intervalo. </li><li> Clique no botão &quot;Gerar Arena &#39;para gerar a arena com os recursos selecionados. Nenhuma mudança ocorrerá até que este botão é pressionado. </li><li> Salve a arena projetada e carregar o arquivo relativo, antes do uso em um experimento, com os botões de comando na parte inferior do formulário Designer Virtual Arena. </li></ol> 6. Selecção de eletrodos MEA a ficha Neuronal Atividade da Cultura <ol><li> Escolha eletrodos de registro temporários daqueles em que diferentes respostas, na etapa 3.8, foram observados: eletrodos que apresentaram respostas maiores após a estimulação da &#39;esquerda&#39; (ou &#39;direito&#39;) eletrodo constituirá a &quot;esquerda&quot; (ou &quot;direita&quot;) eletrodos de registro. Não use eletrodos que não apresentaram respostas significativas para qualquer eletrodo estimulante para controlar o robô. From do menu pop-up de layout MEA, selecione &quot;Adicionar à área motora esquerda&quot; (ou &quot;Adicionar a área motora direito &#39;) para definir eletrodos de registro. </li><li> Selecione os recursos para gravar na forma Experiment Manager. Nesta fase, spikes e estimulação carimbos de tempo são a única informação relevante. </li><li> Realizar um teste drive 10 min: ligar o robô executar clicando no botão Iniciar Experiment na forma Gerente Experiment, clique novamente depois de 10 min de terem decorrido. NOTA: Uma vez que todos os parâmetros foram definidos (codificação e decodificação, arena robô, estimulando e eletrodos de gravação, características para registro), uma seleção de nome de arquivo irá pedir nome de arquivos gravados e destino, em seguida, o robô vai começar a se mover em sua arena, seguindo as regras definidas. Todos os recursos selecionados são salvos automaticamente em tempo real. </li><li> Repita os passos 3.6 e 6.1 em dados obtidos na etapa 6.3, a fim de selecionar eletrodos de registro de dados recolhidos durante uma corrida real robot (ver Discussion para a lógica desta abordagem em duas fases). </li></ol> 7. Realizar um Experiment Neuro-robótica <ol><li> Selecione no Gerenciador de Experiment formar os dados a serem gravados: marcar o Spike, Robot e caixas de dados estímulos. </li><li> Lançamento de um robô prazo de pré-aprendizagem: clique no botão &#39;Iniciar Experiment &quot;sob a forma Experiment Manager. Selecione novos nomes de arquivo para arquivos de dados quando solicitado. Quando 30 minutos se passaram, clique no botão &#39;Iniciar Experiment&#39; novamente para parar o robô prazo. </li><li> Ligue o protocolo de aprendizagem (marque a caixa de seleção &quot;Entregar Tetânica Estimulação Após Hit&quot; na forma Gerente Experiment) e realizar o robô funcionamento do treinamento, do mesmo comprimento que a fase de pré-formação (ou seja, 30 min). Lembre-se de nomes de arquivos de entrada diferente quando solicitado para evitar a substituição de dados a partir do passo 7.2. </li><li> Desligue o protocolo de aprendizagem novamente (desmarque a caixa de seleção &quot;Entregar Tetânica Estimulação Após Hit &#39;) E realizar o pós-learning robô prazo. Mais uma vez, lembre-se de mudar os nomes de arquivos para evitar a substituição. </li></ol> 8. Segundo Mapa Response Computação <ol><li> Repita os passos de 3,1-3,6. Use dados de essas gravações para testar se as alterações foram induzidos ou nos padrões de atividade espontânea ou evocada pelo protocolo de aprendizagem. </li></ol>

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F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+spike+timing+in+neocortical+neurons.">Reliability of spike timing in neocortical neurons.</a> Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of neuroscience methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li><li>DeMarse, T. B., Wagenaar, D. A., Blau, A. W., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurally+controlled+animat:+biological+brains+acting+with+simulated+bodies.">The neurally controlled animat: biological brains acting with simulated bodies.</a> Autonomous Robots. 11 (3), 305-310 (1023).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task.">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> Journal of Neural Engineering. 5 (3), 310-323 (2008).</li><li>Truccolo, W., Hochberg, L. R., Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+in+huma+and+monkey+sensorimotor+cortex:+predicting+single+neuron+spikes.">Collective dynamics in huma and monkey sensorimotor cortex: predicting single neuron spikes.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 105-111 (2010).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Neste documento uma arquitetura neuro-robótico baseado em um controlador neuronal (ou seja, uma rede de neurónios provenientes do córtex ou do hipocampo de ratos embrionários), bi-direccionalmente ligado a um robô virtual, é apresentada. O robô, que tem sensores e rodas, é forçado a mover-se em uma arena estático com obstáculos e sua tarefa consiste em evitar colisões. O primeiro e possivelmente o mais crítico aspecto do processo descrito é a preparação das próprias culturas, como a taxa de falhas tenderá a ser significativa mesmo nas melhores condições técnicas. Uma descrição detalhada das técnicas de cultura é, no entanto, fora do âmbito do presente trabalho. Como orientação geral, as gravações deve ocorrer quando a taxa de disparo da rede atinge um nível estável, geralmente após 3 semanas in vitro. A indicação aproximada de culturas saudáveis ​​é a presença de atividade eletrofisiológica espontânea em vários chann gravaçãoels (pelo menos 20 canais de mais de 60 disponíveis). Tais culturas são caracterizados por um elevado grau de inter-ligação neuronal. Sob tais condições, a atividade neural geralmente torna-se fortemente sincronizada e, às vezes, mostra eventos epileptiformes, com spiking intenso seguido por minutos de duração períodos de silêncio 37. Ambas estas características apresentam um problema: a sincronização excessivo irá tornar impossível distinguir as respostas a estímulos de diferentes eléctrodos, enquanto que as culturas que exibem a actividade epileptiforme irá responder ao primeiro estímulo apresentado com um tempo de explosão actividade, seguido por um período de silêncio, independentemente qualquer estímulo sucessivo entregue. Ambos os problemas podem ser fortemente melhorada pelo emprego de culturas estampados 35, em que a população neural é dividida em duas ou mais fracamente sub-grupos interligados. Outra questão é que as respostas neurais dependem fortemente da distribuição de stimul entradai 38,39. Numa experiência de malha fechada, a estimulação é entregue em função das leituras de sensores, que, por sua vez, são uma consequência do movimento do robô e, portanto, dos próprios respostas neurais. Isto implica que não há nenhuma maneira fácil de estabelecer de antemão o que as respostas serão observadas durante o experimento real. Como resultado, a selecção de eléctrodos de entrada e saída devem confiar em aproximações sucessivas. No protocolo descrito, um processo de duas etapas (ou seja, os passos 5.5 e 6.4) é implementado para tentar determinar um mapa de ligação. No primeiro passo, uma sequência regular de estímulos é entregue e as respostas a tais estímulos são utilizadas para derivar um primeiro mapa de ligação e um conjunto de canais de gravação temporária. Esta configuração é, então, utilizado para executar a unidade de teste descrito no passo 6.4 e seleccionar os canais de gravação que serão monitorados durante a experiência real. Na seção Resultados, uma res de navegação representativasult e as melhorias imediatas trazidas pela introdução de um paradigma de aprendizagem são apresentados. Ao longo da descrição protocolo, várias outras variantes possíveis experimentais são mencionados. Por exemplo, os dois principais sistemas de codificação implementadas em HyBrainWare2 (lineares e estocásticos) onde desenvolvidos para investigar o papel exato da entrada variabilidade temporal o código neural 38. No caso linear, a taxa de estimulação instantânea é uma função dos parâmetros definidos pelo usuário e sensores do robô gravações. No caso estocástico, cada instante de tempo tem uma dada probabilidade de ser escolhido para proporcionar um estímulo. Tal probabilidade é calculado automaticamente pelo HyBrainWare2 de modo que as taxas de estimulação esperados corresponder ao do primeiro caso. A possibilidade de adicionar jitter para codificação linear proporciona uma transição suave entre os dois casos descritos acima. Da mesma forma, explorando diferentes combinações de parâmetros na seção de decodificação pode ajudar a lançar luz sobre o precise papel de estourar in vitro em redes neurais. A velocidade de cada roda do robô aumenta proporcionalmente com o parâmetro peso cada vez que um evento for detectado na área de saída correspondente, enquanto que o coeficiente de extinção indica a quantidade de tempo, em segundos, uma das contribuições preciso para perder 50% do seu valor . A decadência é um simples exponencial. Essas variantes já foram tidas em conta na concepção atual de HyBrainWare2, mas muitas mais possibilidades de pesquisa estão abertos se modificações adicionais no software ou configuração experimental pode ser introduzido. Uma limitação bastante significativo para o protocolo aqui descrito é a exigência do software desenvolvido sob encomenda, HyBrainWare2 (disponível gratuitamente, mediante pedido a todos os interessados). Este software foi projetado para um conjunto de dispositivos (estimulador, placa de aquisição, amplificador MEA) de um modelo e fabricante específico. Embora seja possível adaptá-lo para trabalhar em disetups fferent, a conversão irá tomar alguma habilidade de programação. Da mesma forma, as opções existentes cobrem apenas um conjunto limitado de todas as questões experimentais que poderiam ser investigados através de uma tal configuração. Por exemplo, o algoritmo de detecção de pico aplicado na arquitectura apresentada (tempo preciso detecção espiga 40) está completamente definida por vários parâmetros codificados que precisam de ser alterados, se o objecto de registo é muito diferente das redes neuronais dissociadas (por exemplo, células cardíacas ou fatias). Finalmente, o protocolo de aprendizagem consiste no fornecimento de uma curta, de alta frequência (2 segundos de estimulação de 20 Hz, cada impulso de estímulo é o mesmo que os utilizados para codificar informação sensorial) estimulação após cada batida obstáculo. Se o robô atinge um obstáculo com o seu lado direito, a estimulação tetânica é entregue ao eletrodo que geralmente códigos de informação lado direito eo mesmo vale para sucessos do lado esquerdo. Este protocolo é codificado e não pode be alterado pelo usuário, sem modificar software de sair. Embora a configuração apresentada aqui não é o primeiro sistema encarnada para experimentos híbrido, em circuito fechado 20,23,27,41,42, os projetados no passado se concentraram em uma única tese apoiada por dados de um número limitado de preparações análogas . Por outro lado, a configuração descrita tem sido usado por um grande número de experiências (mais de 100 culturas foram registados desde 2012) com diferentes preparações de modularidade e de origem, enquanto as próprias experiências abordadas questões diferentes (por exemplo, impacto de estimulação tetânica e relevância de explosão, conforme apresentado nos resultados). Em um futuro próximo, novas sessões experimentais estão previstos para verificar os efeitos duradouros de ambos estimulação tetânica e de circuito fechado e a relação entre a estimulação regularidade e observaram respostas. Outra questão a ser abordada é a ligação entre a atividade espontânea e observado, coma idéia de acrescentar um novo algoritmo de decodificação que leva em conta a história da atividade passada e estimulação 43.

Muitas características da função cerebral Atualmente impossível de replicar em um sistema artificial. A capacidade do cérebro para processar rapidamente a informação sensorial complexa e de gerar, em resposta, os comandos precisos do motor é por si só, já para além do state-of-the-art atual. Mas sua capacidade de se adaptar a diferentes condições de aprender com experiências passadas torna tão vastamente superior a sistemas de controle humanos desenvolvida. Até agora, as tentativas de replicar ou explorar essa plasticidade se encontraram pouco sucesso, e a compreensão do funcionamento interno do cérebro tem escapado das garras dos investigadores. Um dos principais problemas ao investigar a relação entre cérebro e comportamento é a incapacidade de acessar corretamente todas as variáveis ​​no sistema: idealmente, uma instalação experimental ideal seria permitir a gravação e estimulação simultânea de um grande número de neurônios, estabilidade a longo prazo , monitoramento de sinapses posições e pesos, e controlável bi-directional interacção com o ambiente. A dificuldade na localização de todas essas variáveis ​​simultaneamente levou ao estudo da relação cérebro-comportamento em duas escalas muito diferentes: ou com comportando animais, sem um bom controle sobre condições experimentais 1-7 ou com, peças pequenas e isoladas, tais como porções de tecido neuronal, sem visão de conjunto do sistema de 8. Neste último caso, enquanto nenhuma configuração experimental concebido permite o monitoramento completo de todos os parâmetros envolvidos no funcionamento do mesmo uma rede neural simples, um bom trade-off é fornecida pelos neurônios dissociados cultivadas sobre Micro-Eletrodo Arrays (AMA) 9. Esses dispositivos, nascidos no final dos anos 70, 10 têm várias vantagens sobre as técnicas de eletrofisiologia tradicionais: em primeiro lugar, a possibilidade de gravação e estimulando uma rede neural em muitos locais diferentes ao mesmo tempo (geralmente 60 eletrodos). Além disso, o acoplamento de AAM com células é quase não-invasivaPermitindo a observação da mesma rede por longos períodos de tempo, até vários meses 11. Os efeitos fisiológicos de estimulação eléctrica em culturas dissociadas foram estudados extensivamente graças a esses dispositivos, revelando que muitas propriedades observadas em escalas maiores (tais como, por exemplo, plasticidade e memória simples processa 12-14) estão conservados, apesar da perda da arquitectura. Durante o crescimento da cultura, essas redes começar a mostrar atividade espontânea em cerca de 7 dias in vitro (DIV) 15,16. A atividade da rede tende a mudar radicalmente com maior crescimento; primeiro como picos individuais reunir em rajadas (no final da segunda semana) 17, mais tarde, à medida que muda para um padrão de sincronização altamente complexa, de rede não periódica explode 18, que representa o estado de maturidade de uma rede. Tem sido sugerido que este comportamento 19 síncrono, um pouco semelhante ao observado in vivo fichaSeres em animais para dormir, é causada pela falta de estímulos sensoriais. Uma abordagem diferente tentativa de obter uma melhor compreensão da codificação da informação tem sido feita por meio de experimentos de circuito fechado, em que foram utilizados diferentes tipos de sinais para controlar a estimulação do próprio 11,20-23 rede neuronal. Nestas experiências, um agente externo capaz de interagir com o ambiente tem sido utilizado para gerar a informação sensorial alimentado para a rede neural, a qual, por sua vez, produzido comandos do motor para um mecanismo efector. Isto permitiu a observação de como as propriedades dinâmicas e adaptativas dos sistemas neurais evoluiu em resposta a alterações induzidas no ambiente. Uma instalação para executar &#39;incorporada neurofisiologia&#39; experiências foi desenvolvido, em que um sensor de plataforma com rodas (um robô física ou o seu modelo virtual) se move sobre numa arena e os seus perfis de velocidade são determinadas pela actividade de uma neuronalsistema (isto é, uma população de neurónios de rato cultivadas ao longo de um MEA). O robô é caracterizado por os perfis de velocidade das suas duas rodas controlados de forma independente e por as leituras actuais dos sensores de distância. A natureza exacta dos sensores de distância não é relevante; eles podem ser ativa ou passiva sensores ópticos ou sensores de ultra-som. Claramente, esta questão não se aplica no caso de robôs virtuais, em que os sensores podem ser projetados com qualquer recurso desejado. Nas experiências aqui descritas, o robô é sempre utilizada a aplicação virtual, com seis sensores de distância que apontam no 30 °, 60 ° e 90 ° a partir da posição em ambas as direcções do robô. A atividade dos três sensores de esquerda e direita é calculada a média ea atividade da cultura biológica é impulsionada pela informação recolhida por tais &quot;super-sensores&quot; (que só vai ser referidos como sensores de &quot;certas&quot; no resto &quot;esquerda&quot; e deste trabalho). O protocol descrito pode ser efectivamente aplicado ao robô físico com ajustes relativamente menores. A informação recolhida pelo robô (físicos ou virtuais) é codificado em uma série de estímulos que são usadas para manipular a actividade da rede neural biológica, que está fisicamente separado pelo robô. Os próprios estímulos são todos idênticos e, portanto, não codificam quaisquer informações. O que é relevante é a sua frequência: aumentos da taxa de estimulação quando o robô se aproxima de um obstáculo, com diferentes locais de entrega de codificação de informações sensoriais dos &quot;olhos&quot; esquerda e direita do robô. A rede neural vai apresentar diferentes respostas para o trem de entrada de estímulos: a tarefa de o algoritmo de descodificação é traduzir a actividade da rede resultante em comandos utilizados para controlar as rodas de um robô. Dado um comportamento de rede &#39;perfeito&#39; (isto é, com confiança e respostas a estímulos de diferentes eletrodos totalmente separados), este seria Result em que o robô a condução em sua arena sem bater em qualquer obstáculo. A maioria das redes apresentam um comportamento muito diferente da idealidade, portanto, um protocolo de aprendizagem simples é introduzida: quando ativado, estimulação tetânica (breves períodos de estimulação de alta freqüência, de 20 Hz de estimulação por 2 segundos, inspirado por protocolos descritos em 24,25) na sequência de um colisão com um obstáculo é entregue. Se os resultados de estimulação tetânica em um fortalecimento local da conectividade de rede, isso irá resultar em um aumento progressivo das capacidades de navegação do robô. HyBrainWare2, uma versão melhorada do software personalizado publicado em 26, é a arquitectura núcleo desenvolvidos para lidar com o controlo dos diferentes dispositivos do sistema (estimulador, a aquisição de dados, processamento e visualização, a comunicação robô ou simulação). Este software foi desenvolvido em nosso laboratório e está disponível gratuitamente, mediante pedido. Este software fornece a interface coma placa de aquisição de dados: uma vez que o usuário começa a aquisição de dados a partir da GUI, o software controla a placa de aquisição de começar a amostragem e conversão A / D de dados provenientes dos eletrodos de registro. Estes dados podem ser gravadas, exibida a tela ou analisados ​​em tempo real para detectar picos, de acordo com as opções definidas pelo utilizador (ver secção Procedimento para detalhes). Além disso, dentro do software, a definição de codificação (tradução de informação sensorial em uma estimulação elétrica) e decodificação (tradução de actividade registada em comandos motores para o robô) algoritmos deve ser especificado. Em particular, a nossa configuração é relativamente fácil de usar em comparação com sistemas semelhantes projetados no passado 27, uma vez que quase todas as variáveis ​​podem ser acessados ​​pelo usuário à direita antes do início do experimento real, enquanto toda a informação gravada é automaticamente salva em um formato compatível com uma caixa de ferramentas de análise de dados neural 28. A secção seguinte procedimento descreve uma experiência de aprendizagem em culturas de hipocampo de ratazana dissociado: toda a cultura e parâmetros experimentais são fornecidos para esta preparação particular e pode necessitar de ser modificada, se um substrato biológico diferente é para ser utilizado. Da mesma forma, a experiência descrita toma vantagem da arquitectura de circuito fechado para investigar o efeito de aprendizagem de estimulação tetânica, mas a própria arquitectura é flexível o suficiente para ser usada no estudo de diferentes características das redes neurais dissociados. As principais variantes do experimento proposto são explicadas na seção Discussão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="476">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Stimulus Generator 4002</td>
			<td style="width:229px;">Multi Channel Systems</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">MEA1060-Inv-BC</td>
			<td style="width:229px;">Multi Channel Systems</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">TC02</td>
			<td style="width:229px;">Multi Channel Systems</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">NI 6255 Acquisition Card</td>
			<td style="width:229px;">National Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Microsoft Visual Studio 2008</td>
			<td style="width:229px;">Microsoft</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">2078P Multichannel System-National Instruments adapter board</td>
			<td style="width:229px;">Developed at University of Genova (Italy)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Matlab 2010</td>
			<td style="width:229px;">Mathworks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

closed-loop neuro-robotic experiments to test computational properties of neuronal networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

O modelo experimental desenvolvido permitiu o teste de se a uma troca de informações entre uma cultura de neurónios e a realização virtual de um robô físico é possível 34. A Figura 1 mostra várias amostras de caminhos percorridos obtidos por um robô virtual no mínimo de 20 experiências em condições diferentes : da esquerda para a direita, uma experiência adequada em circuito fechado, um &quot;vazio MEA&quot; experimento robô (sem células são banhados no MEA para este experimento de controle) e um robô experiência em circuito aberto (taxa de estimulação é constante, em vez de codificação de informações do sensor) estão representados. Os traços representativos confirmar que uma interacção bidireccional entre os elementos neuronais artificiais e é necessário, a fim de obter bons desempenhos de navegação do robô. No entanto, o robô sofre vários golpes contra os obstáculos. Na Figura 2, o desempenho de navegação do robô, expressed como pixels percorridos entre visitas subsequentes, é mostrada em diferentes condições. As duas primeiras colunas mostram a distribuição de distâncias percorridas nas experiências de controlo acima mencionados (&quot;MEA vazio» e configurações de circuito aberto), enquanto que as terceira e quarta colunas exibir o desempenho sem e com, respectivamente, a entrega de estimulação tetânica seguinte cada bateu contra um obstáculo. A introdução da estimulação tetânica (Cf. Processo, ponto 7.2) melhora significativamente a distância percorrida entre duas batidas consecutivas, melhorando assim o desempenho de navegação do robô 35. Na Figura 3, o desempenho de navegação de um robô com diferentes condições de descodificação é apresentado. Para este fim, uma configuração diferente da arena foi aprovada. Isto ajudou a quantificar o bem-sucedida de navegação do robô dentro da arena 36: tal como descrito no passo 4.1 do processo, o robô éapresentou uma série de pistas curtas. A taxa de sucesso é simplesmente a relação entre o número de pistas cruzadas com sucesso sobre o número de faixas apresentadas. Em particular, durante as experiências foi realizada uma identificação em tempo real dos picos de ruptura e isoladas. Os paradigmas de decodificação diferem uns dos outros por causa dos pesos relativos de rajadas e picos isolados (Cf. Processo, aponta 3,5-3,6 e Discussão). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52341/52341fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1: Uma rede neuronal e um robô tem um intercâmbio bidirecional de informações Esta figura mostra três caminhos representativos percorrida pelo robô mais de 20 minutos de experimento.. Em particular, as áreas verdes de luz são livres para o robô se mover em, enquanto escuros pixels verdes representam obstáculos intransponíveis que o robô pode perceber através de seus sensores de distância. Em cada ensaio, o robô começa in seção superior esquerdo da arena e viaja para a sua posição final, retratado como um grande ponto-de-rosa. Os pontos pretos pequenos representam batidas contra um obstáculo, enquanto o percurso codificados por cor fornece uma indicação da evolução no tempo de movimento do robô. A barra de cores à direita exprime tempo decorrido desde o início do experimento em questão de minutos. (A) caminho seguido durante um experimento de circuito fechado. (B) Caminho seguido durante um &#39;vazio&#39; experimento MEA (sem células são cultivadas no MEA superfície) Path. (C), seguido durante um experimento de malha aberta (taxa de estimulação é constante durante todo o experimento). <a href="/files/ftp_upload/52341/52341fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52341/52341fig2.jpg" /> Figura 2: Resultados de desempenho são afectados por fechado-loop e estimulação tetânica. Este gráfico relata as distribuições das distâncias percorridas pelo robô entre hits subseqüentes em diferentes condições. Em particular, as duas primeiras distribuições representam experiências de controle (&quot;vazio&quot; para as gravações sem neurônios banhados no MEA, &quot;circuito aberto&quot; (OL) para experimento com um robô &quot;cega&quot;). As duas últimas colunas representam a condição de &quot;circuito fechado&quot;, sem (CL) e com (CL + TS) o protocolo de aprendizagem implementados através Tetânica Stimulation (TS), que foi entregue para a cultura seguinte choca contra um obstáculo. Em cada caixa, o segmento horizontal central representa a mediana da distribuição, o quadrado vazio o valor médio, o bar central estende-se ao primeiro e terceiro quartil e os bigodes estender aos 5 e 95 percentis. Outliers são representados como diamantes. As estatísticas foram realizadas utilizando a análise de uma maneira Kruskall-Wallis de variânciaem fileiras: a comparação aos pares de Student-Newman-Keuls revela que todos os valores das medianas são significativamente diferentes, com p &lt;0,05. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52341/52341fig3.jpg" /> Figura 3: Decoding influencia o desempenho robótico O gráfico acima representa a probabilidade, para um determinado algoritmo de decodificação, do robô para navegar com sucesso através de uma pista curta em uma quantidade limitada de tempo.. Identificação das rajadas e picos isolados é executada em tempo real durante a própria experiência. No primeiro caso (&quot;picos&quot;) todos os picos detectados com o mesmo peso relativo, para a segunda e terceira distribuições de peso foi de 0 fixados para, respectivamente, pontos e picos isolados pertencentes a uma explosão. As últimas duas colunas representam os resultados obtidos no caso em que todos os picos são responsáveis ​​por, mas com um peso relativo diferente de acordo com a sua posição.Em particular na coluna isolado quarta spikes foram dadas peso relativo mais elevado do que os eventos de ruptura, enquanto a ponderação é invertido para a decodificação em relação ao quinto dados da coluna. Em cada gráfico, a linha central representa a mediana da distribuição, o quadrado vazio o valor da média, enquanto que o bar central estende-se ao primeiro e terceiro quartil e os bigodes estender aos 5 e 95 percentis. As estatísticas foram realizadas utilizando a análise de uma maneira Kruskall-Wallis de variância em fileiras. A comparação entre (método de Student-Newman-Keuls,) revela que as diferenças significativas (p &lt;0,05) pode ser observada entre as colunas 1 e 4, 2 e 4, 2 e 5, 2 e 3.

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Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

De circuito fechado experiências neuro-robótico para testar as propriedades computacionais da Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

closed-loop-neuro-robotic-experiments-to-test-computational

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K visualizações.  Istituto Italiano di Tecnologia. In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Vídeo: Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

Uma Plataforma Experimental para Estudo de Desempenho de circuito fechado de interfaces cérebro-máquina

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

Neurociência

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Um Procedimento para Implantação de Arrays organizado de microfios para gravações a única unidade em Awake, comportando-se Animais

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Estimulação elétrica transcraniana crônica e gravação Intracortical em ratos

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems are already found in clinical applications, and are important tools for basic brain research. A particularly interesting recent development is the integration of closed-loop approaches with optogenetics, such that specific patterns of neuronal activity can trigger optical stimulation of selected neuronal groups. However, setting up an electrophysiological system for closed-loop experiments can be difficult. Here, a ready-to-apply Matlab code is provided for triggering stimuli based on the activity of single or multiple neurons. This sample code can be easily modified based on individual needs. For instance, it shows how to trigger sound stimuli and how to change it to trigger an external device connected to a PC serial port. The presented protocol is designed to work with a popular neuronal recording system for animal studies (Neuralynx). The implementation of closed-loop stimulation is demonstrated in an awake rat.

This protocol demonstrates how to use an electrophysiological system for closed-loop stimulation triggered by neuronal activity patterns. Sample Matlab code that can be easily modified for different stimulation devices is also provided.

Usando a atividade de spiking do neurônio para provocar estímulos do Closed-Loop em experiências neurophysiological

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Open-Source Real-Time Closed-Loop Electrical Threshold Tracking for Translational Pain Research

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in acute and chronic pain conditions. This produces abnormal ongoing activity or reduced activation thresholds to noxious stimuli. Identifying the cause of this increased excitability is required for the development and validation of mechanism-based treatments. Single-neuron electrical threshold tracking can quantify nociceptor excitability. Therefore, we have developed an application to allow such measurements and demonstrate its use in humans and rodents. APTrack provides real-time data visualization and action potential identification using a temporal raster plot. Algorithms detect action potentials by threshold crossing and monitor their latency after electrical stimulation. The plugin then modulates the electrical stimulation amplitude using an up-down method to estimate the electrical threshold of the nociceptors. The software was built upon the Open Ephys system (V0.54) and coded in C++ using the JUCE framework. It runs on Windows, Linux, and Mac operating systems. The open-source code is available (<a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/Microneurography/APTrack&amp;source=gmail&amp;ust=1680789829274000&amp;usg=AOvVaw0nMk9J_EI2jUn8SlmC5JJm" href="https://github.com/Microneurography/APTrack" target="_blank">https://github.com/Microneurography/APTrack</a>). The electrophysiological recordings were taken from nociceptors in both a mouse skin-nerve preparation using the teased fiber method in the saphenous nerve and in healthy human volunteers using microneurography in the superficial peroneal nerve. Nociceptors were classified by their response to thermal and mechanical stimuli, as well as by monitoring the activity-dependent slowing of the conduction velocity. The software facilitated the experiment by simplifying the action potential identification through the temporal raster plot. We demonstrate real-time closed-loop electrical threshold tracking of single-neuron action potentials during&#160;in vivo&#160;human microneurography, for the first time, and during&#160;ex vivo&#160;mouse electrophysiological recordings of C-fibers and A&#948;-fibers. We establish proof of principle by showing that the electrical threshold of a human heat-sensitive C-fiber nociceptor is reduced by heating the receptive field. This plugin enables the electrical threshold tracking of single-neuron action potentials and allows the quantification of changes in nociceptor excitability.

APTrack is a software plugin developed for the Open Ephys platform that enables real-time data visualization and the closed-loop electrical threshold tracking of neuronal action potentials. We have successfully used this in microneurography for human C-fiber nociceptors and mouse C-fiber and A&#948;-fiber nociceptors.

Rastreamento de limiar elétrico de circuito fechado em tempo fechado de código aberto para pesquisa translacional da dor

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in ...