Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro da Fundação Alemã de Pesquisa (SFB / TRR57, Q3 e Q2). Os autores agradecem Mareike Schulz, Pascal Paschenda e Klaudia Warzecha por sua ajuda na preparação das fotografias.

NOTA: Todos os experimentos foram aprovados pelo cuidado com os animais Estado e uso comitê oficial (LANUV, Recklinghausen, Alemanha). Os ratos são alojados sob condições específicas de isentos de agentes patogénicos de acordo com as diretrizes da Federação para Laboratory Animal Ciência Associations (FELASA). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com a lei federal alemã sobre a protecção dos animais e &quot;Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório&quot; (Institutos Nacionais de Saúde publicação 8ª Edição, 2011). 1. Preparação pré-cirúrgica NOTA: Realizar todos os procedimentos em condições limpas, mas não estéreis. Todos os instrumentos e outros equipamentos reutilizáveis, como pinças cirúrgicas, tesouras e Colibri afastador que são usados ​​para realizar a cirurgia devem ser esterilizados antes de serem utilizados de acordo com protocolos que estão em estrita conformidade com as diretrizes institucionais para a realização de cirurgias em animais.; Para uma lista detalhada de reagentes necessários, materiais e equipamentos, por favor, consulte a lista de Specific materiais / equipamentos. <ol><li> Durante a experimentação completa, manter o animal sobre uma placa de aquecimento a uma temperatura de 37 ° C, permanentemente ligado a um sistema de anestesia, e a cobertura da área operacional global, com cortinas auto-adesiva de líquido impermeável. Devidamente organizar todas as instrumentações e soluções que são usados ​​durante a experimentação antes da cirurgia (Figura 1). </li><li> Anestesiar o rato com a inalação de 4 vol% de isoflurano em 100% de oxigénio a uma velocidade de fluxo de 4 L / min durante a indução da anestesia. A profundidade da anestesia é suficiente quando os seguintes critérios vitais são alcançados: a respiração regular espontânea, sem reflexo após a definição de estímulos de dor entre os dedos, e não há resposta à dor. </li><li> Raspar a pele abdominal do mouse com um barbeador elétrico pele e proteger os olhos de secar por uso de olho e nose pomada. </li><li> Posicione o mouse sobre um prato quente aquecida a 37 ° C, insira o focinho do mouse na máscara Fluovac do sistema de anestesia Fluovac, e fixar as pernas do animal com listras de fita de seda. </li><li> Manter a anestesia do ratinho por inalação de 1,5-3% em volume de isoflurano em 100% de oxigénio a um caudal de 1 L / min e induzir a analgesia peri-operatória, por injecção intraperitoneal de solução de buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal dissolvido em solução de NaCl a 0,9%) . </li><li> Esterilizar a pele abdominal raspada com uma compressa de gaze que é umedecido com uma norma anti-séptico, pronto para usar solução alcoólica para o tratamento pré-operatório da pele. Nota: Nos nossos protocolos nós usamos uma pele antisepticum poli-álcool. Isto está em total conformidade com a lei federal alemã sobre a protecção dos animais e as diretrizes da Federação para Laboratory Animal Ciência Associações. Este anti-séptico contém 70% (v / v) de 2-propanol, e butan-1,3.diol vestígios de quinolina amarela, e perfumee. </li></ol> 2. Procedimentos Cirúrgicos <ol><li> Abra o abdómen com uma laparotomia mediana de um comprimento de aproximadamente 2 cm, cortando o cútis mais fáscia ao mesmo tempo com uma tesoura cirúrgica 11,5 centímetros. </li><li> Dissecar o tecido conjuntivo no topo do peritoneu utilizando a tesoura como um espalhador. </li><li> Corte o peritônio ao longo da linha alba para abrir a cavidade peritoneal. </li><li> Aumentar a cavidade através da inserção de um fio de sutura exploração no esterno, o aumento do filamento de fio de sutura, e fixando-a no topo da máscara Fluovac. </li><li> Espalhar a zona de funcionamento por inserção de um afastador Colibri na cavidade peritoneal (Figura 2). </li><li> Levante o fígado com uma hidratada (0,9% NaCl) cotonete para que o lado ventral de ele adere ao diafragma e hilo é claramente visível. </li><li> Expor o canal biliar por movimento caudal do intestino (Figura 3). </li><li> Separe cuidadosamente o ducto biliar doflanqueamento da veia porta e da artéria hepática utilizando um micro-fórceps serrilhas (Figura 4A). </li><li> Coloque o 5-0 ao redor do ducto biliar e prenda com dois nós cirúrgicos. Quando atar os nós aumentar a força de tracção contínua para assegurar obstrução eficaz sem cortar o canal biliar (Figura 4B). </li><li> Adicionar uma segunda ligadura craniana da mesma maneira mas não dissecar o ducto biliar entre (Figura 4C). Caso contrário, há um risco considerável de que vazamentos biliares se um nó não é seguro, e os animais experimentam sem colestase, mas desenvolver peritonite grave. </li><li> Corte as extremidades das suturas (Figura 4D), abaixe o esterno, e remover o afastador. </li><li> Lavar a cavidade peritoneal com solução de NaCl a 0,9% e substituir os órgãos abdominais para as posições fisiológicas. </li><li> Fechar camadas tanto abdominal (peritônio e cutis mais tablier) com suturas de funcionamento separadas com 6-0 Mersilk. </li><li> Corte o ends das suturas e esterilizar a área de operação com um cotonete de gaze umedecida com solução anti-séptica. NOTA: Ao realizar a cirurgia pela primeira vez, execute todos os procedimentos sob um microscópio cirúrgico com uma ampliação de 16X-20X. Isto permite um melhor reconhecimento do ducto biliar e claramente distingue da veia porta e artéria hepática (Figuras 5 e 6). Alguns laboratórios recomendar a dissecação do ducto biliar, entre as duas ligaduras. Deixar o ducto biliar intacta porque os potenciais fugas em um dos nós irá resultar em peritonite aguda grave, ascite, e endotoxemia sistémica quando o ducto biliar é dissecado. </li></ol> 3. O tratamento pós-operatório e acompanhamento <ol><li> Permitir que o mouse para se recuperar em uma gaiola aquecido por uma lâmpada infravermelha até que o mouse é totalmente acordado e ativo. </li><li> Em seguida, mova o mouse para uma gaiola normal e fornecer acesso ad libitum à água e comida. </li><li> Aepois da cirurgia, monitorar os animais em intervalos regulares e realizar follow-up tratamento pós-operatório com analgesia adequada (por exemplo, a solução de buprenorfina), seguindo a recomendação local do cuidado com os animais interna e usar comitês. NOTA: Faça terapia analgésica durante 3 dias. Qualquer comportamento anormal pode indicar complicações raras, tais como peritonite, sepse ou hemorragia interna e deve ser tratado como endpoint humana para encerrar o experimento. </li><li> Os animais são mantidos com acesso livre a alimento e água ad libitum até ao final da experiência. Não há necessidade de retirada de sangue desde fibrogenesis curso é indicado por icterícia. </li><li> Quando os animais são sacrificados, o sangue é coletado para a medição dos parâmetros clínicos de química (AST, ALT, bilirrubina etc.) e do fígado são recuperados para análise histoquímica e bioquímica. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Lesão hepática colestática é um dos principais fatores causais para o desenvolvimento da fibrose hepática e cirrose em pacientes com doença hepática crônica. Baseado no fato de que essas doenças produzir os custos de saúde imponderáveis, é compreensível que muitos pesquisadores estão tentando entender os mecanismos patogênicos da fibrose hepática em curso. Por conseguinte, os modelos experimentais foram gerados que imitam diferentes aspectos dos complexos mecanismos que conduzem à inflamação hepática, fibrose e cirrose 1. BDL cirúrgico é um dos modelos experimentais mais comuns que são usados ​​para induzir a lesão obstrutiva cholestatic em camundongos e ratos 4,23,24. Na maior parte dos protocolos, os animais são anestesiados e uma laparotomia meio é realizada. Subsequentemente, o ducto biliar é descoberto a partir da cavidade abdominal e ligado duas vezes usando fio cirúrgico. Como consequência, os murganhos e os ratos que receberam a cirurgia dsenvolvi uma reação fibrótica forte que a princípio são originários de áreas peri 25. Durante os anos têm sido descritas várias técnicas e modificações cirúrgicas diferentes. Procedimentos especiais até permitir reconexão ou reanastomosis após BDL 23. Outras técnicas são baseadas em BDL parcial, reduzindo significativamente menor formação de necrose e, consequentemente, a proliferação de hepatócitos 24. BDL parcial em combinação com a subsequente remoção da vesícula biliar (colecistectomia) que evita a formação de colecistite também representa um excelente modelo experimental para a colestase aguda. Propôs-se a ser um modelo que está mais próximo da situação humana 24. E, de fato, durante a criação deste modelo, que foi já demonstrado que reproducibly causa colestase com apenas ferimentos mínimos tecido histológico e não procede a uma colestase crônica 25. Por isso, sugeriu-se que este modelo é ideal para estudar late efeitos da colestase invertida 24. Mesmo métodos mais sofisticados são baseados em microcirurgia e permitir uma forma rápida e reproduzível para infligir dano hepático cholestatic apenas em partes selecionadas do fígado 26. Embora estas modificações sofisticadas do protocolo BDL original foram mostrado muito útil na investigação de questões de investigação específicas, muitos laboratórios em todo o mundo, basicamente, visam empregando o modelo de LDB como um modelo altamente reprodutível e confiável para a fibrose hepática colestática. No entanto, muitos podem ocorrer complicações que poderia alterar substancialmente a reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados obtidos por este modelo, se imprecisões técnicas não são evitados. Por exemplo, complicações hemorrágicas que envolvem a lesão dos vasos sanguíneos que acompanham o ducto biliar (ver Figuras 3-4) pode ocorrer durante ou após a cirurgia rapidamente. A overdose de anestesia com cardiodepression ou r subsequentefalha espiratory também são complicações evitáveis ​​do procedimento. As infecções graves, que vão desde a peritonite a sépsis, pode ocorrer durante todo o período da experiência, se as suturas não são executadas com precisão e fugas biliares na cavidade peritoneal. Lesões acidentais no intestino durante a cirurgia também pode levar à peritonite. Portanto, é óbvio que os protocolos normalizados que estejam em conformidade com as directrizes de manipulação rígidos são fortemente exigida. Esta estipulação também foi recentemente exigiu dentro dos países da União Europeia, que implementou novas regras de bem-estar animal, em 2013 1. Os respectivos requisitos que estão associados a este regulamento não são novos e já foram propostas em 1959, quando Russell e Burch sugeriu uma ética estrutura para a realização de experiências científicas com animais que se baseia principalmente em uma substituição, aperfeiçoamento e redução (3R) princípio 27. Ao seguir o outlinprotocolo ed há apenas algumas complicações que podem surgir a partir de imprecisões técnicas. Três questões específicas podem ocorrem em baixa frequência. Tal como acontece com todos os procedimentos cirúrgicos, a sobredose de anestésico é uma fonte potencial de perigo para os animais, especialmente em combinação com hipotermia. Se durante a cirurgia ocorrer complicações cardiovasculares, o fornecimento de anestésicos deve ser interrompido imediatamente e o operador deve tentar fornecer tanto quanto possível de oxigênio para o mouse. Isto pode ser feito por meio de uma pequena seringa de plástico que é preenchido com ar e bombeado para dentro da boca do animal prejudicada. Alternativamente, a utilização de uma pequena Peleusball para ventilação do animal afectado, é muitas vezes útil para o processo de revitalização. Problemas na cicatrização de feridas Após a cirurgia BDL, os ratos podem morder as próprias emendas doloridos ou os de outros animais. Se isto ocorrer, respectivos ratinhos devem ser separadamenteenjaulado. Os animais com feridas abertas devem ser anestesiados, a região em torno da ferida levemente esterilizado com um anti-séptico padrão, e a ferida deve ser costurado para cima novamente. Durante os próximos três dias, a ferida desses animais devem ser inspeccionados regularmente (duas a três vezes por dia). Distensões do abdómen ou a formação de ascite são indicativos de infecções bacterianas. Estas podem ocorrer devido ao trabalho não-estéril durante a cirurgia. Todo o tipo de infecções devem ser manuseados sem exceção como um endpoint humano e os animais afetados devem ser sacrificados. Nós fornecemos um fácil de seguir o protocolo que permite que o desempenho do BDL em ratinhos que é simples de implementar e evoca apenas baixa mortalidade dos animais combinada com uma alta reprodutibilidade. Todos os protocolos cirúrgicos podem ser rapidamente apreendido por cientistas experientes. Durante a experimentação completa, os animais são mantidos numa placa de aquecimento a 37 ° C e ligado permanentementea um sistema de anestesia minimizar a dor e angústia. Para a cirurgia, o abdômen é aberto com uma laparotomia mediana e do ducto biliar duplo ligado sem dissecá-lo. Os resultados representativos, que foram descritos aqui demonstram que as modificações fenotípicas em conta a morfologia do fígado (inflamação, fibrose, cirrose) são altamente reprodutíveis e permitem estudar diferentes aspectos da fibrogénese (por ex., Iniciação, inflamação, progressão da doença em estádio terminal) em pontos de tempo definidos. Esperamos que o resumo do nosso protocolo vai ajudar a reduzir a curva de aprendizagem que é necessário estabelecer com sucesso este modelo fibrose em outros laboratórios e garantir resultados confiáveis ​​e reprodutíveis em diferentes locais. Desse modo, pensamos que o protocolo apresentado apoia o princípio 3R que deveria por Russell e Burch em 1959 e representa a base de novas regras de protecção dos animais que são actualmente implementados em muitos países wifino do Quadro Europeu.

A fibrose do fígado é definida como a produção excessiva e a acumulação de matriz extracelular (ECM) que se origina a partir de uma rede complexa de interacções de células estreladas hepáticas produtoras de matriz e uma ampla variedade de células sanguíneas de células hepáticas que se infiltram-residente e 1,2. Embora a fibrose hepática pode ser causada por uma multiplicidade de diferentes estímulos os mecanismos moleculares subjacentes fibrose são, geralmente, muito semelhantes. Após lesão hepática, um programa altamente orquestrada de alterações moleculares e celulares é iniciada. Neste programa uma estreita interacção entre inflamatórios sinais, monócitos / macrófagos e células estreladas hepáticas ocorre que os resultados finais na ativação de células estreladas e transdiferenciação para myofibroblasts, deposição de ECM e alterações anatômicas e funcionais consecutivos de integridade do tecido do fígado 3. A ativação das células estreladas hepáticas é particularmente impulsionado por sinais inflamatórios e interações com fígadoresidental macrófagos (isto é, as células de Kupffer). Padrões moleculares associados patogénico são reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrões especializados, tais como os receptores de tipo Toll, que quando activado sinal através de uma rede complexa de diferentes percursos que provocam a expressão e secreção de uma variedade de citocinas inflamatórias e quimiocinas que dirigem o processo inflamatório 3. A resposta inflamatória a lesão hepática e formado é apenas temporário, quando o factor de produção de doença é removido. Em contraste, se a lesão persistir, inflamação crónica evolui no fígado e a expressão e acumulação de ECM multidões no primeiro plano resultando na substituição progressiva do parênquima hepático normal pela formação de tecido de cicatriz. Uma vez que a fibrogénese hepática em seres humanos é um problema clínico em todo o mundo, vários modelos de roedores experimentais de insuficiência hepática aguda e crónica foram estabelecidas durante as últimas décadas. Nos musistema rine por exemplo, modelos comuns são a administração de uma variedade de diferentes hepatotoxinas, a ligadura do ducto biliar comum, a indução de imuno-mediada lesões hepáticas, e a introdução de defeitos do gene alvo ou vice-versa, a sobre-expressão de transgenes que afectam crítica vias de sinalização envolvidas na patogênese da fibrose hepática 4. Ligadura de ducto biliar comum em roedores foi realizado como um procedimento experimental em pesquisa por muitos anos 08/05. Um primeiro protocolo altamente reprodutível para bile prolongado ligadura dos ductos (LDB) em roedores já foi apresentado agora mais de três décadas atrás 9. Neste protocolo tanto canulação / obstrução e ligação induzida de um elevado rendimento de cirrose em ratos com alterações morfológicas que eram comparáveis ​​aos observados em cirrose biliar humana 9. O respectivo protocolo é simples, o procedimento cirúrgico é relativamente rapidamente aplicável, E as taxas de sobrevivência dos animais são elevados com mais de 95%. No protocolo de rato cannulation / obstrução clássica, a uma curta incisão de 2 cm é feita logo abaixo do apêndice xifóide. Em seguida, uma cânula é inserida na porção proximal do ducto biliar e fixa na sua posição com suturas de seda. Numa etapa seguinte, a porção distai da cânula 3 está obstruído com nós, colocado através da extremidade inferior da incisão na linha média e enterrada subcutaneamente no quadrante inferior direito 9. No final, o abdómen é fechado e os animais são deixados a recuperar. No protocolo de ligação, os ratos são submetidos a dupla ligação do ducto biliar comum, quer com ou sem a dissecção do ducto biliar entre as ligaduras 9. Este modelo experimental é bem aceito e utilizado em todo o mundo em centenas de laboratórios para induzir colestase hepática e fibrose. Ele induz a proliferação de células epiteliais das vias biliares intra-hepática, differentiatio myofibroblasticn portal de fibroblastos em torno proliferação de células epiteliais biliares, resultando em uma expressão maciça altamente reprodutível e deposição de ECM 10,11. Portanto, a aplicação deste modelo em ratos e camundongos é ser popular entre os cientistas que buscam entender a patogênese da inflamação hepática e fibrose. Em nosso laboratório, temos usado extensivamente este protocolo, no passado, em ratos em vários estudos experimentais com o objetivo de investigar aspectos moleculares e celulares especiais de fibrogênese hepática e para testar novos conceitos antifibróticas e drogas 12-15. Recentemente, adaptou-se esta metodologia para o sistema murino e descobriu que a cirurgia de ligação do canal biliar é também um meio atractivo para estabelecer fibrose dependente do tempo com baixa variação e mortalidade em ratinhos 16-18. Devido ao tamanho mais pequeno do que os animais, no entanto, algumas modificações importantes no que se refere à anestesia, interv cirúrgicoenção e observação pós-tratamento são necessários para se obter resultados confiáveis ​​e reprodutíveis neste modelo. A adaptação completa está resumido no protocolo que se segue e na documentação de vídeo acompanhante.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Shaver Favorita II</td><td>Aeskulap</td><td>GT104</td><td></td></tr><tr><td>Cutter head</td><td>Aeskulap</td><td>GT730</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen eye and nose ointment</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Warming plate and controller</td><td>Labotect</td><td>HP 062</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac anesthesia system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>commercially available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue paper</td><td>commercially available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durapore silk tape</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Gauze swabs</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Alcohol Haut&amp;hellip;farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Raucodrape OR adhesive drapes</td><td>Lohmann &amp;amp; Rauscher GmbH</td><td>33013</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps straight</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Mersilk suture</td><td>Ethicon</td><td>K889H</td><td>Silk, non-absorbable/Abdominal closure</td></tr><tr><td>Needle holder Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Colibri retractor</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>Noba Verbandmittel</td><td>974202</td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1032238</td><td></td></tr><tr><td>25mL beaker</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>Isotonic (0.9%) NaCl solution</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Micro-serrations forceps Moria MC31</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11370-31</td><td>Bile duct separation</td></tr><tr><td>5-0 Mersilene suture</td><td>Ethicon</td><td>EH6731H</td><td>Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation</td></tr><tr><td>5mL syringe</td><td>BD Discardit II</td><td>300296</td><td></td></tr><tr><td>1mL syringe</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Sterican needle 26 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>Infrared lamp</td><td>Petra Electric</td><td>IR 11</td><td></td></tr></tbody></table>

bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis

Na maioria dos vertebrados, o fígado produz a bílis, que é necessário para emulsificar gorduras absorvidas e permitir a digestão de lípidos no intestino delgado, bem como para excretar a bilirrubina e outros produtos metabólicos. No fígado, a obstrução experimental do sistema biliar extra-hepática inicia uma cascata complexa de eventos patológicos que leva a colestase e a inflamação resultante de uma reacção fibrótica forte proveniente dos campos periportais. Portanto, a ligadura cirúrgica do ducto biliar comum tornou-se o modelo mais comumente utilizado para induzir a lesão obstrutiva cholestatic em roedores e para estudar os eventos moleculares e celulares que estão por trás desses mecanismos fisiopatológicos induzidos pelo mau bile fluxo. Nos últimos anos, diferentes técnicas cirúrgicas têm sido descrito que o permitem reconexão ou reanastomosis após a ligadura de ducto biliar (LDB), por exemplo, BDL parcial, ou de outros métodos de microcirurgia para questões de pesquisa específicas. No entanto, o modelo mais utilizado é a obstrução completa do ducto biliar comum que induz uma resposta fibrótica forte depois de 21 a 28 dias. A taxa de mortalidade pode ser alta devido a complicações infecciosas ou imprecisões técnicas. Aqui nós fornecemos um procedimento cirúrgico detalhado para o modelo de LDB em camundongos que induzem uma resposta fibrótica altamente reprodutível, de acordo com a regra 3R para bem-estar animal postulada por Russel e Burch em 1959.

Em uma experimentação típica BDL foi realizada em 40 machos C57BL / 6 camundongos selvagens, pesando cerca de 18-20 gramas. Esta experiência foi realizada para investigar a fibrogénese hepática na fase de iniciação (3 e 7 dias), durante a progressão (10, 14, e 20 dias), e durante o longo prazo (30 e 60 dias) 16. Neste modelo, a fibrose persinusoidal já desenvolvidos ao 10 ° dia após a cirurgia, enquanto que o aumento da fibrose periportal permanentemente até ao final da experiência foi completamente desenvolvida após 20 dias. No experimento mencionado, todos os animais que receberam uma farsa-operação simples sobreviveu, e apenas dois dos 40 camundongos (5%) que receberam BDL desenvolvido uma condição geral pobres e foram, portanto, prematuramente sacrificado antes do ponto final planeado da experiência. A actividade dos animais operados de forma simulada estava sem excepção já um dia normal após laparotomia, enquanto a maioria dos animais submetidos à LDB apresentaram actividade reduzida durante os primeiros três dias. Jpele aundiced já tinha sido evidente em todos os animais BDL um ou dois dias após a definição do BDL 16. Os valores, tanto de alanina aminotransferase (ALT) e de aspartato transaminase (AST) que representam marcadores séricos bem estabelecidos de lesão hepática aumentou rapidamente e atingiu um pico durante 7 dias e 20 dias depois de BDL (Tabela 1). Depois disso, ALT e AST diminuiu de forma constante até o dia 30 e manteve-se estável até 60 dias após a cirurgia. Em linha com a lesão colestática, as concentrações séricas de bilirrubina total foram progressivamente elevada e atingiu um patamar após 7 dias 16. Tempo de curso semelhante de atividades de ALT e AST também foram relatados em ratos submetidos BDL. Em um estudo recente, foi demonstrar que os níveis de soro de AST e ALT aumentada em até 5 ou 10 vezes do normal na primeira semana após a cirurgia BDL e diminuiu depois de duas semanas 19. Normalmente, os fígados de animais sham-operados ainda olhar smooth no final da experiência, enquanto que nos fígados dos animais que receberam BDL mostram alterações de arquitectura que se caracterizam principalmente pela formação de edema e nódulos fibróticos na superfície de fígados e hidropsia da vesícula biliar, que é preenchido com grandes quantidades de correspondentes biliar (Figura 7). As alterações morfológicas características do fígado que são induzidas pela cirurgia BDL também são demonstráveis ​​em análise histológica convencional (Figura 8). No mesmo conjunto de experiências, o desenvolvimento da fibrose do fígado foi semi-quantitativamente avaliado com base na histologia do fígado avaliada por um patologista cego utilizando um sistema de pontuação em que a fibrose periportal foi testado de 0-4 e fibrose perissinusoidal de 0-2, dando um máximo valor que era equivalente a cirrose 6. Como esperado, a pontuação da fibrose significativo no grupo de animais com operação simulada foi de 0,00 ± 0,00. Em contraste, no grupo de animais tchapéu recebeu BDL, a pontuação aumentou de forma constante até o dia 60 para um valor de 4,83 ± 0,17. O máximo de 3 para fibrose periportal foi alcançado no dia 20. Em todos os animais analisados, fibrose perisinusoidal estava ausente durante os primeiros 10 dias do experimento e foi em primeiro lugar visível após duas semanas. Depois disso, aumentou continuamente até o final da experiência para valores de 1,8 ± 0,17 (quadro 1). Também em muitas outras experiências com animais independentes que foram realizados, observou-se que a formação de fibrose foi dependente do tempo, que mostra o aumento altamente reprodutível de expressão de colagénio do intra-hepática e como consequência a deposição de fibrogénese contínua (Figura 9). Do mesmo modo, o processo em curso de fibrogénese é perceptível na expressão elevada de liso-α actina de músculo (α-SMA) que representa um marcador de células fibroblásticas, ou seja, as células estreladas hepáticas activado e miofibroblastos portal,hepática e hidroxiprolina, um aminoácido encontrado em abundância de colagénio matrizes 18 (Figura 9). Além disso, a expressão de vimentina que indica um aumento da quantidade de miofibroblastos ou fibroblastos é aumentada após o ajuste da cirurgia BDL 20. A concomitância de inflamação no fígado feridos são também reflectida pelo aumento da expressão de Lipocalin 2 (LCN2) que é fortemente induzido durante a lesão hepática aguda e crônica e evolui efeitos hepatoprotetoras durante lesão hepática aguda 21,22. As células inflamatórias que se infiltram nos fígados dos animais que receberam LDB pode ser detectado por coloração específica com um anticorpo que é específico para CD45 (Figura 10). Este marcador de superfície celular que é também conhecido como PTPRC (proteína tirosina fosfatase, do receptor de tipo) é especificamente expresso em todas as células hematopoiéticas diferenciadas, excepto eritrócitos e células plasmáticas. <table fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot; border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo após a ligadura de ducto biliar (dias) </td><td> Bilirrubina total </td><td rowspan="2"> AST (U / L) </td><td rowspan="2"> ALT (U / L) </td><td rowspan="2"> Portal fibrose </td><td rowspan="2"> Fibrose perissinusoidal </td><td rowspan="2"> Pontuação total </td></tr><tr><td> (Mg / dl) </td></tr><tr><td> 0 (n = 3) </td><td> 0,17 ± 0,06 </td><td> 192,67 ± 30,50 </td><td> 50,33 ± 6,03 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 3 (n = 5) </td><td> 6,85 ± 2,21 </td><td> 1.159,25 ± 319,27 </td><td> 566,50 ± 335,25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 7 (n = 5) </td> &lt;td&gt; 14,38 ± 2,14 ± </td><td> 976,60 ± 477,16 </td><td> 448,20 ± 259,47 </td><td> 0,60 ± 0,25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,60 ± 0,25 </td></tr><tr><td> 10 (n = 5) </td><td> 15,92 ± 2,60 </td><td> 1.916,60 ± 868,25 </td><td> 560,40 ± 80,88 </td><td> 1,40 ± 0,25 </td><td> 0,25 ± 0,25 </td><td> 1,67 ± 0,25 </td></tr><tr><td> 14 (n = 5) </td><td> 17,90 ± 3,84 </td><td> 1.088,60 ± 276,32 </td><td> 505,00 ± 96,15 ± </td><td> 2,4 ± 0,25 </td><td> 1,0 ± 0,0 </td><td> 3,40 ± 0,24 </td></tr><tr><td> 20 (n = 4) </td><td> 18,00 ± 2,12 </td><td> 1.072,67 ± 364,27 </td><td> 404,00 ± 195,48 </td><td> 3.0 ± 0.0 </td><td> 1,0 ± 0,0 </td><td> 4.0 ± 0.0 </td></tr><tr><td> 30 (n = 5) </td><td> 16,04 ± 4,79 </td><td> 446,40 ± 169,75 </td><td> 260,20 ± 126,97 </td><td> 2,8 ±; 0,2 </td><td> 1,4 ± 0,25 </td><td> 4,20 ± 0,20 </td></tr><tr><td> 60 (n = 6) </td><td> 16,02 ± 1,19 </td><td> 484,67 ± 117,79 </td><td> 257,17 ± 50,97 </td><td> 3.0 ± 0.0 </td><td> 1,8 ± 0,17 </td><td> 4,83 ± 0,17 </td></tr></tbody></table> As abreviaturas utilizadas são: ALT, alanina aminotransferase; AST, aspartato aminotransferase. Tabela 1: A fibrose em conseguir uma experiência representativa Os dados desta tabela é reproduzida a partir de um estudo em que a fibrose do fígado foi induzida por ligadura do ducto biliar em ratos C57BL / 6 16.. Neste estudo, a taxa de mortalidade após a cirurgia BDL foi de 5% (2 de 40 animais foram sacrificados prematuramente devido às condições de polícia pobres desenvolvido). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig1highres.jpg" /> Figura 1: Configuração experimental para a realização de um bileconduta de ligação. O animal é mantido sobre uma placa de aquecimento a uma temperatura de 37 ° C e a área operacional é coberto com geral, cortinas auto-adesiva de líquido impermeável. Durante a cirurgia completa, o animal é permanentemente ligado a um sistema de anestesia. Todos os Instrumentos e soluções (analgésicos, anestésicos, solução anti-séptica, 0,9% NaCl) estão dispostas de forma clara. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Preparação da área de cirurgia abertura Antes da cavidade peritoneal, a pele abdominal deve ser raspado com um barbeador elétrico pele e desinfectados com uma compressa com gaze anti-séptico. A área da cirurgia é então coberto com cortinas, auto-adesiva de líquido impermeável. O abdômen é aberto com uma laparotomia mediana (~ 2 cm de comprimento). A cavidade é ampliada através da inserção de uma sutura segurando no esterno e na área de operação, distribuídos porinserção de um afastador Colibri permitindo a experimentação sem impedimentos durante a cirurgia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig3highres.jpg" /> Figura 3: Exposição do ducto biliar. (A) Para a condução da ligadura do ducto biliar, o lado ventral do fígado é levantado de modo que ele pode manter o diafragma e o hilo hepático se torna claramente visível. (B) Para melhor expor o canal biliar, o intestino é movido com caudalmente um cotonete de algodão umedecido. O ducto biliar é marcado com uma seta. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig4highres.jpg" /> Figura 4: ligadura do ducto biliar. (A) Em um primeiro passo, o ducto biliar é separada cuidadosamente da veia porta e flanqueando artéria hepática utilizando um micro-serrilha fórceps. (B) Subsequentemente, um fio de sutura é colocado em tornoo ducto biliar e protegidas com um nó cirúrgico. (C) Depois disso, um segundo fio de sutura é colocado em estreita proximidade com o primeiro fio de sutura e atado em torno do ducto biliar. (D) A sutura é encurtado, a cavidade enxaguada com solução de NaCl a 0,9% , e todos os órgãos substituído a sua posição fisiológica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig5highres.jpg" /> Figura 5:.. Representação precisa de atar Para documentar a colocação das suturas e a configuração dos dois nós que impedem o fluxo biliar, o mesmo procedimento descrito na Figura 4 foi documentado sob um binóculo (A) Confinamento do ducto biliar com a primeira sutura. (B) de atar o fio de sutura em primeiro lugar. (C) Confinamento do ducto biliar com o segundo fio de sutura. (D) atar do segundo fio de sutura. (E) duas vezes ligado biliar dUCT após o encurtamento de suturas em excesso. (E &#39;) Este painel descreve um esboço de (E). As posições de a mediana (mL) lobos direito (rl), esquerda (II) e do fígado, bem como a do ducto biliar, estômago, duodeno e são designados por letras. No esboço do ducto biliar é duplo ligado por duas suturas. <img alt="Figura 6" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig6highres.jpg" width="400" /> Figura 6:. Anatomia do ducto biliar, veia porta e artéria hepática em ratos Para melhor localização anatômica do ducto biliar comum, veia porta e artéria hepática são retratados como um esquema. Marcados também são as posições da direita (rl), esquerda (ll) mediana (mL) e as caudado (cl) lóbulos do fígado. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig7highres.jpg" /> Figura 7: aparecidos representativasnce de fígados 2 semanas após a operação simulada e LDB. Ratinhos C57BL / 6 foram sujeitos a operação simulada ou a cirurgia de LDB. Depois de duas semanas a cavidade abdominal foi aberta. Enquanto os fígados dos animais operados de forma simulada apresentaram nenhum sinal de fibrose, os fígados dos animais que receberam a ligadura de ducto biliar tinha uma estrutura de superfície irregular, com formação de edema e nódulos fibróticos na superfície de fígados correspondentes. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig8highres.jpg" /> Figura 8:. Secções do fígado hematoxilina e eosina foram preparados a partir de ratinhos C57BL / 6 animais de tipo selvagem que estavam operação simulada (A) ou receberam BDL durante três semanas (B). Os cortes foram corados com HE seguintes procedimentos padrão. Por favor, note as alterações típicas no fígado BDL que incluem sinais de inflamação (células infiltrantes), do parênquima (hepatocyte) necrose, e proliferação de ductos biliares. A barra de escala em cada painel número representa 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig9highres.jpg" /> Figura 9: leituras histológicos e bioquímicos para fibrogênese hepática. Secções do fígado (A) foram preparadas a partir de animais que receberam a cirurgia simulada ou LDB por 2 semanas e coradas com Sirius Red (painel superior, as fibras de colagénio em vermelho) ou analisadas para a expressão de α-actina de músculo liso (α-SMA) (painel inferior , células positivas para α-SMA na cor marrom) por imunohistoquímica. A barra de escala no painel de cada figura representa 100 fim. (B) Os extractos de proteína a partir de fígados foram submetidas a transferência de Western e analisado para expression de colágeno tipo I, α-SMA, e Vimentin que são bem marcadores de fibrogênese hepática estabelecida. A expressão de Lipocalina-2 (LCN2) indica a resposta inflamatória que se associa com a fibrogénese contínua. Nesta análise, o carregamento igual proteína foi demonstrada pela sondagem dos borrões com um anticorpo específico para β-actina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig9large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig10highres.jpg" /> Figura 10:. Coloração imunológica de células inflamatórias infiltrantes secções de fígado em série foram preparadas a partir de um fígado de um animal que recebeu ligadura do ducto biliar durante 3 semanas. Os cortes foram corados com HE (A) ou com um anticorpo que é específico para CD45 (B). Observe,o elevado número de células positivas para CD45 que rodeiam os canais biliares. Estes infiltrados massivos que indicam inflamação não são visíveis em secções de fígado provenientes de animais operados de forma simulada (não mostrado). A barra de escala em cada painel número representa 500 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig10large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Ligadura do ducto biliar em ratos: Indução de Inflammatory Lesão hepática e fibrose por colestase obstrutiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

52.0K visualizações.  RWTH Aachen University. Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Vídeo: Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Creation of Reversible Cholestatic Rat Model

Cholestasis is a clinical condition commonly encountered by both surgeons and gastroenterologists. Cholestasis can cause various physiological changes and affect the nutritional status and surgical outcomes. Study of the pathophysiological changes occurring in the liver and other organs is of importance. Various studies have been done in cholestatic rat models.
We used a reversible cholestatic rat model in our recent study looking at the role of methylprednisolone in the ischemia reperfusion injury. Various techniques for creation of a reversible cholestatic model have been described. Creation of a reversible cholestatic rat model can be challenging in view of the smaller size and unique hepatopancreatobiliary anatomy in rats. This video article demonstrates the creation of a reversible cholestatic model.
This model can be used in various studies, such as looking at the changes in nutritional, physiological, pathological, histological and immunological changes in the gastrointestinal tract. This model can also be used to see the effects of cholestasis and various therapeutic interventions on major hepatic surgeries.

Cholestasis is a clinical condition commonly encountered by both surgeons and gastroenterologists. Creation of a reversible cholestatic rat model can be challenging in view of the smaller size and unique hepatopancreatobiliary anatomy in rats. This video article demonstrates the creation of a reversible cholestatic model.

Criação de modelo Rat reversível colestática

Cholestasis is a clinical condition commonly encountered by both surgeons and gastroenterologists. Cholestasis can cause various physiological changes and ...

Medicina

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques are used, including serum chemistry, histological analysis, and immunostaining for specific markers. Although these techniques can provide important information about the biliary system, they often do not present a full picture of bile duct (BD) developmental defects across the whole liver. This is in part due to the robust ability of the mouse liver to drain the bile even in animals with significant impairment in biliary development. Here we present a simple method to calculate the average number of BDs associated with each portal vein (PV) in sections covering all lobes of mutant/transgenic mice. In this method, livers are mounted and sectioned in a stereotypic manner to facilitate comparison among various genotypes and experimental conditions. BDs are identified via light microscopy of cytokeratin-stained cholangiocytes, and then counted and divided by the total number of PVs present in liver section. As an example, we show how this method can clearly distinguish between wild-type mice and a mouse model of Alagille syndrome. The method presented here cannot substitute for techniques that visualize the three-dimensional structure of the biliary tree. However, it offers an easy and direct way to quantitatively assess BD development and the degree of ductular reaction formation in mice.

We present a rather simple and sensitive method for accurate quantification of bile duct density in the mouse liver. This method can aid in determining the effects of genetic and environmental modifiers and the effectiveness of potential therapies in mouse models of biliary diseases.

Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Biologia do Desenvolvimento

The Influence of Liver Resection on Intrahepatic Tumor Growth

The high incidence of tumor recurrence after resection of metastatic liver lesions remains an unsolved problem. Small tumor cell deposits, which are not detectable by routine clinical imaging, may be stimulated by hepatic regeneration factors after liver resection. It is not entirely clear, however, which factors are crucial for tumor recurrence.
The presented mouse model may be useful to explore the mechanisms that play a role in the development of recurrent malignant lesions after liver resection. The model combines the easy-to-perform and reproducible techniques of defined amounts of liver tissue removal and tumor induction (by injection) in mice. The animals were treated with either a single laparotomy, a 30% liver resection, or a 70% liver resection. All animals subsequently received a tumor cell injection into the remaining liver tissue. After two weeks of observation, the livers and tumors were evaluated for size and weight and examined by immunohistochemistry.
After a 70% liver resection, the tumor volume and weight were significantly increased compared to a laparotomy alone (p &#60;0.05). In addition, immunohistochemistry (Ki67) showed an increased tumor proliferation rate in the resection group (p &#60;0.05).
These findings demonstrate the influence of hepatic regeneration mechanisms on intrahepatic tumor growth. Combined with methods like histological workup or RNA analysis, the described mouse model could serve as foundation for a close examination of different factors involved in tumor growth and metastatic disease recurrence within the liver. A considerable number of variables like the length of postoperative observation, the cell line used for injection or the timing of injection and liver resection offer multiple angles when exploring a specific question in the context of post-hepatectomy metastases. The limitations of this procedure are the authorization to perform the procedure on animals, access to an appropriate animal testing facility and acquisition of certain equipment.

A high incidence of tumor recurrence after resection of liver metastases remains an unsolved problem. The illustrated mouse model may be useful to investigate the reasons for such recurrences. It combines a liver resection model with intrahepatic tumor cell injection for the first time.

A Influência do fígado ressecção no crescimento do tumor intra-hepática

The high incidence of tumor recurrence after resection of metastatic liver lesions remains an unsolved problem. Small tumor cell deposits, which are not ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections may be one possible cause. The typical animal model used for studying BA is established by inoculating a neonatal mouse with a rhesus rotavirus. Silver nanoparticles have been shown to exert antibacterial and antiviral effects; their function in the BA mouse model is evaluated in this study. Currently, in BA animal experiments, the methods used to improve the symptoms of BA mice are generally symptomatic treatments given via food or other drugs. The aim of this study is to demonstrate a new method for ameliorating BA syndrome in mice by the intraperitoneal injection of silver nanoparticles and to provide detailed methods for preparing the silver nanoparticle gel formulation. This method is simple and widely applicable and can be used to research the mechanism of BA, as well as in clinical treatments. Based on the BA mouse model, when the mice exhibit jaundice, the prepared silver nanoparticle gel is injected intraperitoneally to the surface of the lower liver. The survival status is observed, and biochemical indicators and liver histopathology are examined. This method allows a more intuitive understanding of both the establishment of the BA model and novel BA treatments.

This article describes in detail a method based on silver nanoparticles for ameliorating biliary atresia syndrome in an experimental biliary atresia mouse model. A solid understanding of the reagent preparation process and the neonatal mouse injection technique will help familiarize researchers with the method used in neonatal mouse model studies.

Um método de nanopartículas prata para atenuar a síndrome de Atresia biliar em ratos

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...

Imunologia e Infecção

Ileectomy-induced Bile Overaccumulation in Mouse Intestine

Intestinal resection is a common therapeutic approach for human diseases such as obesity, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, and colon cancer that often results in severe short bowel syndrome-like adverse effects including bile acid diarrhea, dehydration, electrolyte disturbances, and nutrient malabsorption. Here we introduce a murine ileal resection model, termed ileectomy, to evaluate tissue communication and the maintenance of systemic homeostasis. After ileal resection, circulating blood is permanently devoid of the ileum-specific endocrine hormone fibroblast growth factor 15 (FGF15), which releases its endocrinal inhibition of bile acid synthesis in the liver. In combination with the increased production and abolished reabsorption of bile acids after removing the ileum, mice that underwent surgery suffer from bile salt overaccumulation in the intestine and associated diarrhea, morbidity, and mortality. Novel usage of the surgery model introduced in this study may provide mechanistic and functional insights into ileal control of systemic metabolic regulation in physiology and disease.

Small intestine-dependent bile acid reabsorption and feedback inhibition of hepatic bile acid synthesis is important for systemic homeostasis and health. In this study, we describe a mouse model for ileal resection to evaluate ileectomy-induced bile malabsorption, overaccumulation, and toxicity in mouse intestine.

Overaccumulation induzida por Ileectomy biliares no intestino de rato

Intestinal resection is a common therapeutic approach for human diseases such as obesity, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, and colon cancer ...

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to the complex etiology and unknown pathogenesis, there are still no effective drug treatments. At present, the classic BA mouse model induced by rhesus rotavirus (RRV) is the most commonly used model for studying the pathogenesis of BA. This model is characterized by growth retardation, jaundice of the skin and mucosa, clay stools, and dark yellow urine. The histopathology shows severe liver inflammation and obstruction of the intrahepatic and extrahepatic bile ducts, which are similar to the symptoms of human BA. However, the livers of end-stage mice in this model lack fibrosis and cannot fully simulate the characteristics of liver fibrosis in clinical BA. The presented study developed a novel BA mouse model of chronic liver fibrosis by injecting 5-10 &#181;g of anti-Ly6G antibody four times, with gaps of 2 days after each injection. The results showed that some of the mice successfully formed chronic BA with typical fibrosis after the time lapse, meaning these mice represent a suitable animal model for the virus-induced liver fibrosis mechanistic study of BA and a platform for developing future BA treatments.

We established a mouse model of chronic liver fibrosis, which provides a suitable animal model for the virus-induced liver fibrosis mechanistic study of biliary atresia (BA) and a platform for future BA treatments.

Um Modelo Murino de Fibrose Hepática Crônica para o Estudo da Atresia Biliar

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Precision-Cut Liver Slices como um modelo ex vivo de biologia hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Um modelo de rato para pancreatite crônica através da infusão TNBS do ducto biliar

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

O murino colina deficiente, Ethionine-completada (CDE) dieta modelo de lesão hepática crônica

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Biologia

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile duct proliferation. However, long-term experiments can lead to increased morbidity and mortality. In select mouse strains with underlying liver disease, meaningful comparisons can be made even with ligation of a single lobe of the liver, which can reduce animal losses and expenses. Here, we describe partial bile duct ligation (pBDL) in the mouse, in which only the left hepatic bile duct is ligated, causing biliary obstruction in the left lobe but not the remaining lobes. With careful microsurgical technique, pBDL experiments can be cost-effective, since the unligated lobe serves as an internal control to the ligated lobes, when subjected to the same conditions in the same animal. Unlike cBDL, a separate sham-operated control group is not necessary. pBDL is highly useful to directly compare localized versus systemic effects of cholestasis and other retained bile components. pBDL can also be repurposed as a novel method to investigate mechanisms related to medications and cell migration.

Here, we present partial bile duct ligation as a surgical model of liver injury and regeneration in rodents.

Ligadura do colédoco parcial no Mouse: um modelo controlado da colestase obstrutiva localizada

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...