Este vídeo demonstra a produção e a aplicação de fatias de fígado cortadas com precisão como um modelo experimental ex vivo de biologia do tecido hepático. As fatias hepáticas cortadas com precisão ocupam um nicho experimental que existe entre estudos in vivo em animais e métodos de cultura celular in vitro. Esta técnica tem vários benefícios fundamentais sobre estudos in vivo em animais, incluindo a capacidade de usar amostras de controle e tratamento do mesmo fígado, o isolamento do tecido hepático para remover efeitos fora do alvo de outros sistemas de órgãos, e a capacidade de usar reagentes que podem ter um efeito negativo se aplicados a um rato vivo inteiro, por exemplo, inibidores tóxicos da via.
A técnica envolve o uso de uma lâmina vibratória lateralmente para cortar fatias ultrafinas e hepáticas de tecido hepático viável seguido pela cultura tecidual de laboratório. As vibrações da lâmina evitam rasgos causados pelo estresse da tesoura. Neste exemplo, mostraremos as técnicas de preparações de fatias viáveis de fígado ex vivo, e demonstraremos a utilidade da cultura da fatia hepática em experimentos de exemplo onde este tecido ex vivo é tratado com ácidos bilialos para estimular a lesão hepática cholestática para avaliar os mecanismos da fibrogênese hepática.
Insira a lâmina no braço de corte. Desinfete a lâmina e o braço de corte com uma solução de 70% de etanol. Tenha sempre cuidado para evitar contato com a lâmina.
Desinfete a bandeja tampão com uma solução de 70% de etanol e limpe com um tecido estéril. Insira a bandeja tampão no vibratome e aperte o parafuso de montagem. Ajuste o braço de corte na altura máxima disponível.
Verifique o ângulo da lâmina. Em nosso vibratome, usamos um ângulo de 10 graus da horizontal, com a lâmina inclinada para baixo em direção à amostra. Certifique-se de que o ângulo da lâmina está bem fixo.
Desinfete o porta-amostras, novamente, com uma solução de 70% de etanol. Conecte a água de resfriamento para o refrigerador termoelétrico Peltier, localizado sob a bandeja de tampão. Alguns modelos de vibratome usam um banho de gelo para resfriamento.
Fixar o tubo de saída de água em um ralo e ligar a água. Coloque o refrigerador em 4 graus Celsius. Adicione o tampão Krebs-Henseleit gelado à bandeja de buffer.
Todos os instrumentos cirúrgicos e materiais devem ser estéreis. Os ratos devem ser profundamente anestesiados ou eutanizados. As superfícies da pele nos camundongos foram desinfetadas por molhar com solução de 70% de etanol.
Faça uma incisão midline na pele desde a base da cavidade abdominal até o diafragma. Usando fórceps limpos e tesouras, abra a cavidade abdominal. Remova o fígado rapidamente, sem danificar os lóbulos.
Empurre o fígado para baixo, e corte o tecido conjuntivo na parte superior do fígado. Empurre o fígado para cima. Segure a área vascular central do fígado com os fórceps e puxe para cima.
Corte os vasos sanguíneos do tecido conjuntivo. Tome cuidado para não danificar os lóbulos do fígado, e também, tome cuidado para não cortar no trato gastrointestinal. Coloque o fígado removido em um prato estéril de tampão Krebs-Henseleit gelado.
Separe o fígado em lóbulos individuais. Selecione um lobo hepático e coloque o lado plano para baixo em um novo prato estéril. Mantenha outros lóbulos no gelo no buffer Krebs-Henseleit.
Corte as bordas dos lóbulos do fígado. O corte é importante, particularmente na borda que entrará em contato com a lâmina de corte primeiro, pois ter uma borda de tecido relativamente perpendicular à lâmina de corte evitará a compressão tecidual que pode ocorrer em ângulos rasos. Cortar o tecido ao redor das outras três bordas remove grande parte das cápsulas fibrosas na borda do tecido, e normalmente permite uma remoção mais fácil das fatias de tecido.
Coloque uma fina camada de cola cianoacrila na borda frontal do suporte do espécime, ligeiramente maior do que os lóbulos do fígado aparados. Remova qualquer resíduo de tampão do tecido usando material absorvente estéril. Coloque o lobo hepático na cola cianoacrilato, com a maior borda voltada para a frente.
Deixe curar no ar por um a dois minutos. Coloque o tecido preso ao suporte da amostra no vibratome. Ajuste a velocidade do vibratome.
Abaixe a lâmina de corte até que esteja localizada logo acima do lobo do fígado. Passar o braço de corte vibrante sobre a amostra. A vibração da lâmina nesta máquina é ativada pelo pedal do pé.
Volte a lâmina para trás e baixe a altura da lâmina em 250 micrômetros. Repita este processo até que a camada superior do tecido seja removida. Descarte a primeira uma ou duas fatias, pois estas conterão a cápsula de Glisson e, portanto, não conterão muito tecido hepático funcional.
Para cortar fatias de fígado, avance lentamente a lâmina vibrante para dentro do tecido girando a alça. Use um pequeno pincel para guiar suavemente o tecido durante o processo de corte. Use o pincel para pegar a seção de tecido cortado e, em seguida, coloque a seção de tecido em um tubo estéril contendo tampão Krebs-Henseleit para armazenamento.
Quando não estiver em uso, mantenha este tubo no gelo. Em parte, o tecido rasga durante o processo de corte, mas para a maioria dos propósitos, o tecido ainda é utilizável. Corte as fatias de tecido até perto da cola do cianoacrilato.
Não corte na cola. Repita com os outros lóbulos do fígado, que estão sentados no gelo, até que o número necessário de fatias de tecido seja obtido. Para limpar o suporte da amostra, use uma lâmina para raspar a mistura de tecido cola, ou a mistura pode ser suavizada usando solventes como acetona ou sulfóxido de dimetil.
Em uma capa de cultura de tecido, pipeta um mL de meio Williams'E contendo soro bovino 10% fetal e antimicrobianos em uma placa de 12 poços. Retire as fatias de tecido girando suavemente a mistura e coloque em um prato estéril. Corte o tecido em um tamanho mais uniforme.
Neste exemplo, apontamos para fatias de tecido com uma área de superfície em torno de 50 milímetros quadrados. Tome cuidado para examinar as fatias de tecido para obter consistência. Fatias mais escuras sugerem que a espessura do tecido é aumentada, e deve ser descartada.
Fatias mais leves sugerem a presença de cola cianoacrilato curada, e devem ser descartadas. Transfira as fatias de tecido para a placa de 12 poços contendo um mililitro de mídia. Incubar as fatias hepáticas em condições normais de cultura tecidual.
Se possível, use métodos para aumentar a disponibilidade de oxigênio para as fatias de tecido. No dia seguinte, troque a mídia usando uma pipeta manual para evitar a perda de tecido por sucção. As fatias de fígado cortadas com precisão estão prontas para uso experimental.
Para nossa aplicação, tratamos as fatias hepáticas com ácidos bilias por dois dias, e homogeneizamos em tampão de lise para extração de RNA mensageiro e análise de qPCR. Para examinar a viabilidade de fatias de fígado cortadas com precisão ao longo do tempo, usamos os níveis de ATP como proxy para viabilidade celular. Os níveis de ATP foram normalizados para proteína, e foram medidos em vários pontos de tempo após o isolamento.
Os níveis de ATP foram reduzidos nas amostras imediatas e de uma hora, porém isso se recuperou em três horas. Na sequência, os níveis de ATP foram mantidos por cinco dias, embora tenham tendência de queda ao longo do tempo. A coloração de H&E foi usada para examinar fatias de fígado cortadas com precisão que foram mantidas na cultura por até cinco dias.
A morfologia tecidual foi sugestiva de alguma necrose ocorrendo no segundo dia, com necrose grave acontecendo no quinto dia. Por causa da necrose acontecendo entre os dias dois e cinco, recomendamos que a utilidade experimental desta técnica seja limitada a cerca de três dias. No entanto, isso poderia ser melhorado usando melhores técnicas de entrega de oxigênio para as fatias de tecido.
As fatias de fígado cortadas com precisão também parecem ter espessamento de fibras de colágeno em relação ao tempo na cultura. Isso sugere que processos fibrogênicos espontâneos ocorram. No experimento de exemplo, as fatias hepáticas cortadas com precisão foram tratadas com três ácidos biliais separados por dois dias, para imitar colestase hepática.
Olhando para a expressão mRNA de três genes específicos do colangiocito, os dois ácidos biliais conjugados, ácidos glicocólicos e tauróclicos, aumentaram significativamente a expressão de cytokeratin-19 e connexin-43. Isso é consistente com o desenvolvimento de cholangiocitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar fatias de fígado cortadas com precisão, e como executar a cultura básica do tecido.
Fatias hepáticas cortadas com precisão podem ser usadas para uma ampla gama de aplicações, incluindo investigações experimentais em expressão de RNA, expressão proteica, epigenética, ligação de DNA, metabolismo, mecanismos de infecção, invasão de câncer, farmacologia, biologia celular e estudos de secreção, apenas para citar alguns.
