We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

1. Identificação Computacional de Moléculas Pequenas Potencial Capping Grupos Nota: Em princípio, uma variedade de acoplamento ou farmacofóricos métodos de pesquisa podem ser utilizados para prever potenciais grupos de protecção. O principal objectivo dos estudos de substituição é computacionais para identificar pequenas moléculas que retêm as características e as interacções dos aminoácidos que são substituídos. <ol><li> Validação do protocolo LigandFit encaixe 14 </li></ol> Nota: Em estudos anteriores, o método de acoplamento (LigandFit 15, um módulo do pacote de programas de modelagem molecular, descoberta Estúdio 3.0) foi validado para garantir que este algoritmo é suficiente para reproduzir modos de ligação de conhecida Ncaps e para demonstrar que os resultados obtidos para compostos desconhecidos são preditivos 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilizando os seguintes passos (1,2 - 1,5), identificar os parâmetros óptimos para LigandFit como se segue: PLP1 PTgrade ergy para a geração de pose, minimização de poses gerados ea função de pontuação PLP1 para a análise das poses. </li><li> A fim de limitar as conformações obtidas e para posicionar de forma adequada ligandos para a formação da ligação covalente no péptido tampado, definir as azoto e átomos de azoto amida indole de Trp217 e Gln254, respectivamente, como filtros para interacção de ligação de hidrogénio. </li><li> Concepção e encaixar uma biblioteca de fragmentos de alternativas para a CDK2 / ciclina A receptor (2UUE). Priorizar grupos capeadores potenciais para a síntese e de abastecimento comercial baseado em PLP1 de pontuação, as interações com filtros de interação e complementaridade com a CBG. As várias etapas necessárias para LigandFit de ancoragem são as seguintes. </li></ol><ol start="2"><li> Preparação de receptor de local de ligação 14 <ol><li> Importar a CDK2 / ciclina A estrutura cristalina (PDB ID: 2UUE) para uma janela de visualização no software. Esta estrutura contém o FLIP previamente identificada 5-metil-1-fenil-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF ligado ao sulco de ciclina (Figura 3). </li><li> Excluir ou manter no lugar os resíduos RLIF (C-terminal). Quando a sequência do péptido é retido, utilizar o grupo amino N-terminal do péptido, tal como um filtro de interacção para o ligando. Dos &quot;as interacções receptor-ligando&quot; ferramentas, criar uma esfera em torno do N-cap 3,5-DCPT de Show esfera / Hide site. A esfera é criado para definir a região activa no local de ligação, onde as interacções ligando-receptor são permitidos para ocorrer durante a ligação. </li><li> Definir o local de ligação mais longe da &quot;local encontrar o volume de ligando seleccionado&quot; e excluir o ligante 3,5-DCPT da proteína. Realizar esta etapa para definir o volume de ligação dentro da esfera criado. </li><li> Defina as de nitrogênio e nitrogênio amida átomos de indole dos resíduos Trp217 e Gln254 como filtros de interacção para ligações de hidrogênio. Defina os filtros de interação para que apenas os poses que inteRact com os átomos de resíduos jogo será filtrado durante o processo de ancoragem, portanto, preservar as interações importantes nas poses que atracam. </li></ol></li><li> Preparação de ligandos 14 <ol><li> Design uma biblioteca de 100 grupos de protecção potenciais com base em critérios incluindo o peso molecular inferior a 500, a presença de um grupo carboxilato para ligação com o péptido truncado e a inclusão de grupos hidrofóbicos adequados (grupo fenilo substituído) para a interacção de van der Waals no bolso secundário como mostrado na Tabela 1. </li><li> Selecione anéis heterocíclicos para imitando interações de ligação de hidrogênio com peptídeo Trp217 e substituintes incluído para substituir interações de emparelhamento de iões de cadeias laterais básicas do HAKRRLIF. Encaixe os ligandos como as respectivas moléculas de aldeído, de modo que o oxigénio do carbonilo pode interagir com o átomo de azoto da amida de Gln254 semelhante a espinha dorsal do péptido progenitor péptido (Tabela 1). </li><li> Antes de docrei, minimizar ligantes destinados a um baixo conformação de energia e se preparar em um estado de ionização adequado por meio do &quot;Prepare ligantes&quot; protocolo. Desenhar e exportar estes tampões potenciais N no formato de arquivo .sdf em ChemDraw para uma folha de cálculo antes de serem importados para o software. Nota: Preparar protocolo ligandos é usado para minimizar a todos os ligandos para ser acoplado aos seus estados de energia mais baixos e as taxas de ionização foram aplicados aos átomos aplicáveis. Os parâmetros padrão são usados ​​para esta etapa. </li></ol></li><li> Ancoragem dos ligandos para a Ciclina A Ranhura 14 <ol><li> Selecione a rotina de LigandFit conjunto protocolo interacções ligando-receptor do software. Use o receptor e os ligantes preparados como entrada para este protocolo. </li><li> Para estas corridas selecione PLP1 como rede de energia, especificar que posa ser minimizado de energia e que o número de poses gerados como 10. Deixe todos os outros parâmetros nos valores padrão. Nota: é LigandFitum método de acoplamento que pode identificar e gerar posturas de alta afinidade e potencial complementaridade com o local activo de uma proteína usando um filtro de comparação forma base que é combinado com um algoritmo de busca conformacional de Monte Carlo. A rede de energia utilizada pelo programa de acoplamento é o campo de força para a geração de interacções ligando-receptor e coloca potenciais. PLP1 é potencial linear por partes que prioriza especificamente interações de ligação de hidrogênio e onde o tipo de átomo PLP é atribuído para cada átomo ligando não átomo de hidrogénio ou receptor não-hidrogénio. </li></ol></li><li> Análise dos resultados <ol><li> Em primeira instância, a exposição apresenta no programa visualizador e, em seguida, classificar por descendente valores da pontuação PLP1. Utilizar as funções de pontuação, tais como PLP1 para estimar a afinidade de ligação de um ligando acoplado com base em um ligando candidato representar geometria e interacção não covalente com a estrutura de receptor alvo. Nota: Aqui, a função PLP1 pontuação foi encontrado para give os melhores resultados, uma vez que inclui uma estimativa da ligação de hidrogénio. </li><li> Analisar visualmente o top 25% das poses marcou para 1) superimposability com o grupo de tampar conhecido (com um (RMSD relativa desvio quadrado médio) valor inferior a 2 a), 2) cumpriu filtros de interação e 3) a complementaridade visual com o sulco ciclina . Aceita-se que uma corretamente encaixado representar (em comparação com uma estrutura experimental) tem um valor de RMSD &lt;2 Å. </li><li> Examinar posturas de complementaridade visual, que é definido como tendo enchimento eficiente da bolsa de ligação de uma maneira que seja consistente com relações estrutura-actividade conhecidas. Filtros de interacção são definidas para incluir restrições átomo que requerem contactos intermoleculares conhecidas como sendo críticos para a ligação e / ou são necessários para colocar o grupo de capeamento potencial na geometria correcta para a formação da ligação amida. Três exemplos de poses que atracam dos grupos de nivelamento N potenciais que fazem ligações de hidrogênio com interaction filtros são mostradas na Figura 4. </li></ol></li></ol> 2. Síntese e Caracterização de Grupos N -capping Potenciais <ol start="1"><li> Síntese de grupos N-capsulação. </li><li> Para a síntese, todos os comerciais usar materiais de partida, solventes e reagentes, como obtido. Sintetizar potenciais grupos N-capsulação por química orgânica sintética convencional (Figura 5 12,13 para um exemplo). </li><li> Realizar a cromatografia em camada fina (TLC) sobre gel de sílica para monitorizar reacções. <ol><li> Dissolve-se o material de partida e a mistura de reacção (1 mg) na fase móvel e identificá-los na placa de TLC utilizando tubos capilares. </li><li> Colocar a placa de TLC em que a câmara que contém a fase móvel (acetato de etilo e hexano numa razão de 35:65). Uma vez que a fase móvel atinge 90% da placa de TLC, remover e secar a placa. </li><li> Use luz UV para detectar as misturas de reacção e o material de partida como manchas visíveis. Calcular a R f de todos os pontos (relação entre distância percorrida pelo local e a fase móvel). Nota: A reacção está completa quando não há mancha visto no Rf do material de partida. </li></ol></li><li> Após a conclusão da reacção trabalhar-se a mistura de reacção por colocação em um funil de separação e lavagem com ácido aquoso ou solução de base, conforme apropriado. Recolhe-se o solvente orgânico, evapora-se que em evaporador rotativo e seca-se o produto bruto obtido sob vácuo. </li><li> Dissolve-se 500 mg de produto em bruto em 3-5 ml de solvente adequado e adicionar a um 1 g de sílica ou RP18 para amostras e seco ao ar. Colocar a t para amostras contendo o produto em bruto em cartuchos Flash / RP SNAP sílica e purifica-se o material bruto utilizando cromatografia automatizado flash de alto desempenho (de acordo com o protocolo do fabricante) empregando um g coluna SNAP 100 com um funcionamento de gradiente a partir de 6% de acetato de etilo: 94 % de hexanos a 50% de acetato de etilo e hexano a 50% sobre15 volumes de coluna. </li><li> Seca-se o produto purificado recolhido em solvente de cromatografia flash utilizando um evaporador rotativo por evaporação de todo o solvente até à secura e secar ainda mais o produto sob vácuo para remover todos os solventes residuais. Realizar uma caracterização do produto purificado por RMN, MS e HPLC analítica. <ol><li> Por 1 H RMN e 13 C RMN, pesa cerca de 10 mg da amostra purificada, dissolvê-lo num solvente deuterado adequado, e transferir o conteúdo para um tubo de RMN seco para gravar os espectros de RMN 2,14. </li><li> Grave o 1 H NMR e espectros de 13 C NMR de alto campo com um espectrómetro de RMN (300 MHz mínimo). Adquirir espectros de massa usando um QTOF (Tandem quadruple-1 hora do espectrômetro de massa de voo), ionização electrospray (ESI) ou um VG 70S (duas vezes focando espectrômetro de massa de sector magnético, EI) 2,14. </li><li> Analisar a pureza dos produtos por HPLC com um detector de foto-díodos e equipado comA C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5? m para análise. Utilize uma corrida gradiente a partir de 100% de água (0,1% ácido trif luoroacético) a 60% de acetonitrilo (0,1% ácido trifluoroacético) durante 30 minutos e mantenha o gradiente durante 4 min. Extraia os cromatogramas em 226 e 254 nm 2,14. Nota: purezas analíticos dos compostos avaliados foram&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. síntese em fase sólida para a Geração de flips 2 <ol start="1"><li> Síntese de flips cobertas de N <ol><li> Montar compostos peptídicos N-tampado por meio de métodos de síntese de fase sólida padrão utilizando os seguintes passos. <ol><li> Activar a 5 equivalentes do ácido aminado C-terminal de (Fmoc-Phe) em 4,4 equivalentes de O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; -tetrametil-urónio-hexafluoro-fosfato (HBTU, 221,93 mg) em 2 ml de DMF durante 5 min. Carregar a mistura de HBTU Fmoc-Phe na resina Rink utilizando 6 equivalentes de diisopropiletilamina (DIPEA, 103.13mg) durante 1 h à TA. </li><li> Remover o grupo protector Fmoc a partir do resíduo do terminal C utilizando 20% de piperidina em 3 ml de DMF durante 10 min. Pares aminoácidos subsequentes (por exemplo, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) passo a passo. Em cada passo, 5 equiv par do aminoácido seguinte utilizando 6 equivalentes de DIPEA (103,13 mg) e 4,4 equivalentes de HBTU (221,93 mg) em 2 ml de DMF durante 1 h à TA. </li><li> Aplicar ciclos de lavagem (5 x 10 ml de DMF + 5 x 10 mL de DCM), após os passos de acoplamento de aminoácidos e de desprotecção de Fmoc descritos acima. Depois da montagem de péptidos, utilizando grupos de 6 equivalentes de DIPEA (103,13 mg) e 4,4 equivalentes de HBTU (221,93 mg) par de N-capsulação em 2 ml de DMF durante 1 h à TA. </li><li> Após a conclusão da montagem péptido, tratar a mistura reaccional com 2 ml da mistura de clivagem (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N para remover grupos protectores da cadeia lateral, e vira clivam a partir da resina. Tritura-se o produto resultante com éter dietílico frio para precipitar e iconcentrado de f necessário em um evaporador rotativo. </li></ol></li></ol></li><li> Síntese de flips N-tampado-C-tampado <ol><li> Pesar e dissolve-se o péptido Leu-Arg no terminal-N protegido e tampado (16,1 mg, 0,02 mmol) em diclorometano, e adicionar [4- (3-clorofenoxi) piridin-2-il] metanamina (C-tampão) juntamente com S - benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; tetrametilurónio (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) e N, N-di-isopropiletilamina (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Agita-se e controlar a reacção à temperatura ambiente até que a TLC / HPLC indica o consumo completo do material de partida. Após a conclusão da reacção, concentra-se a mistura de reacção em bruto utilizando um evaporador rotativo e, em seguida, distribui-se entre acetato de etilo e água. </li><li> Separa-se a camada orgânica e aquosa; lava-se a camada orgânica com NaOH 1 N, HCl 1 N, e salmoura. Seca-se a camada orgânica com cerca de 1 g de sulfato de sódio e concentra-se o produto no evaporador rotativo. Finally tratar o produto S / N com a mistura de clivagem (95: 2,5: 2,5 de ácido trif luoroacético / H 2 O / TIPS) para desprotecção. </li><li> Tritura-se o produto resultante com éter dietílico frio e, se necessário, concentrado em evaporador rotativo até à secura completa, a fim de remover todo o solvente. Além disso secar o produto sob vácuo para remover todos os solventes residuais. </li></ol></li><li> Purificação e caracterização de flips <ol><li> Purificar vira bruto usando métodos preparativos semi HPLC de fase inversa. Liofilizar os flips purificadas e caracterizar a sua massa molecular utilizando espectrometria de massa 2,14. </li><li> Determinar a pureza analítica dos flips-se por HPLC com um detector de foto-díodos e está equipado com um (2) C18 100 A, 250 x 4,6 mm, 5? M. Usar um método de gradiente a partir de 95% de H 2 O (0,1% de ácido trifluoroacético) / 5% de acetonitrilo (0,1% de ácido trif luoroacético) e 35% H 2 O (0,1% de ido trifluoroacico) / acetonitrilo a 65% (0,1% trifluoroaceácido tic) ao longo de 30 min e segure o gradiente de 4 min. Extrato cromatogramas em 226 e 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. Polarização de Fluorescência Encadernação ensaio para a determinação do competidor Encadernação 2,14 <ol start="1"><li> Realizar o ensaio em placas utilizando o seguinte procedimento de negro de 384 poços (138 ul). </li><li> Diluir as amostras, péptidos marcador (4 nM), e os complexos de cinase (CDK2 / ciclina A - 18 ug / ml, CDK4 / ciclina D - 37 ug / ml) para se necessárias concentrações em tampão de ensaio (HEPES 25 mM, pH 7, 10 mM de NaCl, 0,01% de Nonidet P-40, 1 mM de ditiotreitol (DTT). </li><li> Para cada uma das cavidades da placa de 384 poços, adicionar: 5 ul de CDK4D1 ou CDK2CA (0,3 ug / poço purificada complexo recombinante humano da quinase), solução de composto de 5 ul, 5 ul de 30 nM de péptido marcador (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly ou fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly péptido marcador). Use 5 ul de cada DMSO (6%), da-manhãR, traçador e 5 ul de DMSO (6%), complexo de quinase, como poços de controlo traçador </li><li> Após a adição de todos os componentes, centrifugar a placa a 500 rpm durante 1 minuto (41,16 x g) à TA e depois incubar a placa com agitação durante 45 min à TA. Utilizando um leitor de placa multimodo e equipado com detector de 485 nm / 535 nm de excitação / emissão e uma filtros espelho dicróico leitura da intensidade de fluoresceina de cada poço na placa. </li><li> Calcula-se a polarização média relativa (MP) para todas as amostras de ensaio, utilizando a equação que mostra abaixo. Determine os valores de IC50 por regressão logarítmica, correlacionando mps relativos e testando concentrações. </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

Neste artigo, um estudo de caso de aplicação do REPLACE (substituição por alternativas ligando parciais utilizando computacional enriquecimento) estratégia para converter inibidores peptídicos de interações proteína-proteína em mais moléculas farmacologicamente relevantes é descrito 1-3. Enquanto IBP representam uma fonte rica, mas ainda não devidamente explorado de alvos potenciais da droga, metodologias existentes são largamente insuficientes para fazer estes amplamente acessível. As estratégias atuais, incluindo fragmento baseado projeto 4, de alto throughput screening 5 e 6 peptídeos grampeados ter fornecido avanços, porém estes são, em muitos casos ineficaz. Como resultado, mais progresso e abordagens mais eficazes são necessárias. SUBSTITUIR foi completamente validado no desenvolvimento de inibidores de cinase que têm propriedades semelhantes a fármacos melhoradas e têm potencial para o desenvolvimento como agentes terapêuticos anti-tumorais. Esta estratégia é exemplificada para o desenvolvimento de inibidores não-ATP das célulasCDKs ciclo e envolve os seguintes: 1) a obtenção de informações estruturais 3D sobre as interações de HAKRRLIF / RRLIF com sulco de ligação da ciclina; 2) determinar os determinantes de ligação importantes para a interacção péptido; 3) truncamento do péptido N-terminal contendo um ou mais determinantes de ligação; 4) identificação computacional de alternativas potenciais de pequenas moléculas (ligandos alternativas parciais, Plas) para a parte truncada do péptido e que retêm as interacções chave do peptideo de origem; 5) síntese ou de fonte comercial de Plas previsto para se ligar avidamente com o sub local previamente ocupado pelo resíduo (s) péptido suprimido; 6) síntese de lança através de ligadura dos melhores PLAs ao péptido truncado utilizando síntese de fase sólida; 7) Os testes de flips em uma ligação in vitro ou ensaios funcionais (polarização de fluorescência no contexto / ciclina CDK) seguido por posterior caracterização de um ensaio de viabilidade celular. Uma representação esquemática de REPLACE strategY é mostrado na Figura 1. Neste artigo, iterações da estratégia de substituição são discutidos e a aplicação de CDK2 / ciclina A descrito em detalhe. CDKs são acreditados para ser directa ou indirectamente desreguladas na maioria dos tumores e, portanto, são consideradas alvos de drogas cancerosas apropriado 7. CDKs requerem associação com cyclins para ativação completa e posteriormente fosforilam proteínas-chave envolvidas na regulação do ciclo celular 8. Os dois grandes grupos de CDKs são os isotipos que controlam os pontos de verificação do ciclo celular [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D e CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) e G2 / M (CDK1 / ciclina B)] e os reguladores de RNA polimerase através de fosforilação (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Um passo fundamental na progressão da fase S ocorre quando o factor de transcrição E2F1 forma um complexo com a proteína DP, que, em seguida, liga-se ao ADN e inicia a transcrição do gene. CDK2 / ciclina A é necessária para neutralizar E2F1 transcricionalactividade através da fosforilação conduzindo assim à libertação do complexo de E2F1-DP e sua subsequente degradação. A inibição de CDK2 / ciclina A é acreditado para manter E2F1 no seu estado ligado ADN conduzindo à activação persistente. O nível resultante de E2F-1 atividade irá superar o limiar necessário para induzir a apoptose independente de p53, portanto, sugerindo uma estratégia terapêutica. Devido à p53 desregulado e vias pRb, níveis elevados de E2F-1 que ocorrem frequentemente em células de cancro e inibição de CDK2 / ciclina A deve conduzir à apoptose selectiva em tumores e pode ser considerada como um alvo cancro validado 7. Clinicamente inibidores de CDK investigados alvo o sítio de ligação ATP altamente conservada levando a atravessar reatividade entre os mais de 500 proteínas cinases na kinome humano e potencialmente dar origem a efeitos colaterais e toxicidade 9. Uma abordagem alternativa é-ATP não inibição competitiva, visando o recrutamento de substrato através da CBGpresente na subunidade reguladora positiva ciclina e que é, portanto, distinta e distante da ATP site de 10,11 vinculativo. O CBG é principalmente uma ranhura hidrófobo presente na ciclina A, ciclina D e ciclina E e foi mostrado para reconhecer uma sequência de consenso encontradas em substratos e supressores tumorais. Como um péptido isolado, a ligação da ciclina motivo (CBM) se liga ao CBG e tem sido demonstrado que inibem a actividade da cinase das CDKs do ciclo celular. O CBM foi optimizado para um octapéptido (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 de 0,07 ± 0,02 ^ M, CDK4 / ciclina D, IC50 0,88 ± 0,34 uM) e, além disso, truncada para um pentapéptido que representa um bom compromisso entre o peso molecular para a droga semelhança e a potência (RRLIF, CDK2 / ciclina A IC 50 1,01 ± 0,17 ^ M, CDK4 / ciclina D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Os CBGS consistem em um grande primária e secundária bolsa hidrofóbica menores que são colmatadas por um ACIDIc região (inclui Glu220, Glu224 e Asp283). Os principais determinantes de ligação de HAKRRLIF incluem a interacção de Ala2 com bolsa hidrofóbica secundário, de emparelhamento de iões de hidrogénio e ligações de Lys3, Arg Arg5 4 e com a região acídica e um elevado grau de complementaridade das Leu6 e Phe8 com o local primário lipofílico. Além disso, numerosas ligações de hidrogénio são contribuídos a partir do esqueleto do péptido enquanto Ile7 actua como um resíduo espaçador que permite um contacto óptimo com o bolso primário. O modo de ligação e interacções de HAKRRLIF com CBG é mostrado na Figura 2. A segmentação da interacção proteína-proteína CBM / CBG irá inibir a actividade da quinase de CDK2 / ciclina A, a CDK2 / ciclina E e CDK4 / ciclina D e esta deve desencadear apoptose mediada E2F1 de células cancerosas enquanto as células normais que não afectam 7. Embora CBM péptidos derivados são inibidores eficazes de CDKs do ciclo celular, é improvável que sejam úteis como fármacos, devido à sua metabólicainstabilidade e falta geral de permeabilidade celular. Para este fim, temos aplicado a estratégia REPLACE, a fim de converter esses inibidores peptídicos potentes em mais compostos droga-como para a prossecução do desenvolvimento de terapias anti-tumorais que exploram E2F1 desregulamentado por meio de CDK2 / ciclina A inibição. O protocolo a seguir resume o trabalho que foi concluído na aplicação do REPLACE para a ranhura de ciclina. No primeiro exemplo, foram identificados grupo terminal substituições semelhantes a fármacos para o tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF. Além disso melhorias nestes grupos foram investigados em um estudo de validação adicional para REPLACE. Também são apresentados os resultados obtidos nestes estudos representativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computational Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Optiplex Workstations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Organic Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5&#956;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Polarization Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 micro well plates, ,&#160; Micro pipets,&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-one</td>
			<td>110256602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td>
			<td>BPS Bio Sciences</td>
			<td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 nM HEPES</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>375368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector&#160; fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, &#160;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,&#160; MTT reagent,</td>
			<td colspan="2">Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heamocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo electron corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4-8C</td>
			<td>Isotemp Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

SUBSTITUIR é uma estratégia única desenvolvidos para atingir mais eficazmente interacções proteína-proteína (IBP). Ele tem como objetivo ampliar o espaço disponível alvo da droga, proporcionando uma melhor metodologia para a identificação de inibidores de tais sítios de ligação e que representam a maioria dos alvos potenciais da droga. O principal objetivo deste artigo é fornecer uma visão metodológica do uso e aplicação da estratégia REPLACE que envolve abordagens de química computacional e sintéticas. Substituição é exemplificado através da sua aplicação para o desenvolvimento de quinases dependentes de ciclina competitivo não-ATP (CDK) inibidores como agentes terapêuticos anti-tumorais. CDKs são frequentemente desregulado no câncer e, portanto, são considerados como alvos importantes para o desenvolvimento de drogas. A inibição de CDK2 / ciclina A em fase S foi reportado para promover a apoptose selectiva de células cancerosas de uma maneira independente de p53 por meio da via E2F1. A segmentação da interacção proteína-proteína no bindin ciclinag ranhura (CBG) é uma abordagem que permita que a inibição específica do ciclo celular CDK através de transcrição. O CBG é reconhecido por uma sequência de consenso derivada a partir de substratos de CDK e proteínas supressoras de tumor denominado o motivo de ligação (CBM) ciclina. O CBM foi previamente optimizado para um octapéptido de p21WAF (HAKRRIF) e, em seguida, ainda mais truncada para um pentapéptido reter actividade suficiente (RRLIF). Peptídeos em geral não são célula permeável, são metabolicamente instável e, portanto, o REPLACE (substituição parcial com Ligand Alternativas através Computacional Enriquecimento) estratégia tem sido aplicada de forma a gerar mais inibidores de drogas-like. A estratégia começa com o desenho do fragmento ligado péptidos inibitórios (vira) que inibem selectivamente a ciclo celular complexos de CDK / ciclina. Inverte foram gerados por substituição de resíduos de iterativamente HAKRRLIF / RRLIF com fragmento como moléculas pequenas (capping), grupos a partir da extremidade N-terminal (Ncaps), seguido por substituição como C-terminal. Estes compostos são pontos de partida para a geração de inibidores de CDK não-competitivos do ATP como agentes terapêuticos anti-tumorais.

As interacções de HAKRRLIF com a ranhura de ciclina são mostrados na Figura 2. Os resíduos peptídicos, que representam os principais determinantes de ligação incluem Ala2, Arg4, Leu6 e Phe8 com outros resíduos proporcionando menores contribuições 12,13,18. Neste caso, o estudo SUBSTITUIR estratégia tem sido utilizado a fim de encontrar alternativas de fragmentos para os resíduos do tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF, mimetizando principalmente as interacções d...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Desenvolvimento de inibidores de interacções proteína-proteína através REPLACE: Aplicação para a concepção e desenvolvimento não-ATP inibidores de CDK Competitiva

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K visualizações.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Vídeo: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Biologia

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Remoção de materiais exógenos da parte exterior dos núcleos congelados para investigar a antiga comunidades biológicas abrigava Dentro

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat accumulation (steatosis) and inflammation leading to fibrosis. Preclinical models closely recapitulating human NASH/NAFLD are essential in drug development. While liver biopsy is currently the gold standard for measuring NAFLD/NASH progression and diagnosis in the clinic, in the preclinical space, either collection of whole liver samples at multiple timepoints during a study or biopsy of liver is needed for histological analysis to assess the disease stage.
Conducting a liver biopsy mid-study is an invasive and labor-intensive procedure, and collecting liver samples to assess disease level increases the number of research animals needed for a study. Thus, there is a need for a reliable, translatable, non-invasive imaging biomarker to detect NASH/NAFLD in these preclinical models. Non-invasive ultrasound-based B-mode images and Shear Wave Elastography (SWE) can be used to measure steatosis as well as liver fibrosis. To assess the utility of SWE in preclinical rodent models of NASH, animals were placed on a pro-NASH diet&#160;and underwent non-invasive ultrasound B-mode and shear wave elastography imaging to measure hepatorenal (HR) index and liver elasticity, measuring progression of both liver fat accumulation and tissue stiffness, respectively, at multiple time points over the course of a given NAFLD/NASH study.
The HR index and elasticity numbers were compared to histological markers of steatosis and fibrosis. The results showed strong correlation between the HR index and percentage of Oil Red O (ORO) staining, as well as between elasticity and Picro-Sirius Red (PSR) staining of livers. The strong correlation between classic ex vivo methods and in vivo imaging results provides evidence that shear wave elastography/ultrasound-based imaging can be used to assess disease phenotype and progression in a preclinical model of NAFLD/NASH.

This protocol describes the use of an enhanced ultrasound technique to non-invasively observe and quantify liver tissue changes in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease.

Aplicação de Ultrassom e Elastografia de Ondas de Cisalhamento em um modelo de rato de NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...