We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

1. Cultura Tradicional de linhas celulares de cancro do ovário (Condições aderentes) NOTA: Toda a manipulação de células e meios de comunicação deve ocorrer em uma cultura capa de tecido estéril <ol><li> Preparar meios de cultura celular tradicional. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + HEPES 15 mM) e suplementar com soro bovino fetal inactivado pelo calor 10% e 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar a solução através de 0,45 um filtro de vácuo. </li><li> Prepare um poliestireno 75 centímetros balão tradicional cultura 2 tecido etiquetada com o nome, data e número de passagem da linha de células de interest.Remove o frasco de células de ultra baixa congelador ou nitrogênio líquido. Descongelar colocando em 37 ° C num banho de água durante 5 minutos. </li><li> Transferência da suspensão frasco para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 3 ml de meio de cultura celular tradicional (preparado acima). Centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 5 minutos a 400 x g. Enquanto isso, adicione 16 ml de mídia tradicionais de cultura de células, no balão. </li><li>Aspirar o sobrenadante. Usando 2 ml de cultura de células células pipet mídia tradicional cima e para baixo para soltar pellet e suspensão de transferência, no balão. Suavemente balão de rocha para distribuir uniformemente balão cells.Place incubadora humidificada em cultura de células definido para 37 ° C e 5% de CO 2. Monitorar células diariamente até 80% de confluência é atingido. </li><li> Uma vez que as células estão 80% confluentes dividir a cultura 1: 2 no capuz de cultura de células. Aspirar o sobrenadante e lava-se com solução salina tamponada com fosfato quente (sem cálcio e magnésio) (PBS). Adicionar 1,5 ml de tripsina a 0,25% -EDTA e incubar 3-5 min a RT. </li><li> Prepare duas novas poliestireno 75 centímetros 2 frascos e adicione 16 ml meio de cultura celular tradicional a cada balão. Ressuspender as células tripsinizadas em 4 ml de meio de cultura celular tradicional e aliquotas de volumes iguais de cada um dos novos frascos. </li><li> Colocar em frascos de cultura de células incubadora humidificada ajustado para 37 ° C e 5% de CO 2. Monitorar células diariamente até 80% de confluência é atingido. Continue a dividir células ecultura ou congelar e armazenar a -80 ou em nitrogênio líquido. </li></ol> 2. Geração de multicelular Spheroids de linhas celulares do cancro do ovário, utilizando células flutuantes ou aderentes NOTA: Toda a manipulação de células e meios de comunicação devem ter lugar num estéril capa de cultura de tecidos. Após cultura linhas celulares sob métodos de cultura tradicionais para 2-3 passagens (seção 1) prosseguir com as seguintes etapas. <ol><li> Prepare a mídia de células-tronco. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + HEPES 15 mM) e completar com 1% de penicilina / estreptomicina (para uma concentração final de 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina), 1% de substituição de soro nocaute , 0,4% de albumina de soro bovino e 0,1% de insulina-transferrina-selénio. Filtrar a solução através de 0,45 um filtro de vácuo. </li><li> Meios de células estaminais suplemento com o factor humano recombinante de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico humano recombinante (FGF) para uma concentração final de 20 ng / ml e 10 ng / ml, respectivamente. NOTA: Os fatores de crescimento deve ser adicionado fresco para os meios de comunicação de células-tronco para a direita antes de usar. </li><li> Criar cultura floater TIC. Remover balão de 80% de células confluentes cultivadas em condições de cultura tradicionais aderentes. Recolha mídia e todas as células flutuantes (individuais e agregados), deixando a população aderente para trás, e transferir para 50 ml de polipropileno tubo de centrífuga. Centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 5 minutos a 400 x g. NOTA: as células flutuantes e agregados são aparentes 24-72 horas após as células aderentes são ligados ao balão sob cultura tradicional. A partir de uma recuperação de 80% da placa confluente de cerca de 1.0 - 5.0 x 10 5 células viáveis ​​flutuantes pode ser esperado, dependendo da linha celular. Neste estudo, o número médio de células flutuantes recolhidas a partir de uma cultura confluente em aderente 80% foi de: 5,0 x 10 5 por ACI-23, 4,8 x 10 5 para OVCAR5, 3,5 x 10 5 para CAOV3, e 1,0 x 10 5 para TGS- 3. Com a transferência, multicellformação esferóide ular em cultura tradicional e TIC floater ocorre em poucos dias embora isto seja um pouco dependente da linha celular. Por exemplo, ACI-23 células formam agregados mais facilmente do que as células CAOV3. </li><li> Enquanto isso, prepare um baixo apego superfície de poliestireno 75 centímetros 2 frasco de ultra cultura de tecidos etiquetada com o nome, data e número de passagens de linha celular. Adicionar 10 ml de meio de células estaminais suplementado com factores de crescimento para o balão. </li><li> Depois de centrifugação for concluída, a mídia aspirado e transferência de pellet para balão de baixo apego pela adição de 6 ml tronco media celulares e pipetando para cima e para baixo para soltar pellet. Colocar em frascos de cultura de células incubadora humidificada ajustado para 37 ° C e 5% de CO 2. Monitorar as células a cada 2-3 dias para observar a formação esferóide. </li><li> Criar cultura TIC tradicional. Remover balão de 80% de células confluentes cultivadas em condições de cultura tradicionais aderentes. Media Aspirar e lavar com água morna PBS. Adicionar 1,5 ml de tripsina a 0,25% de EDTA e incubar 3-5min à temperatura ambiente. </li><li> Prepare um baixo apego superfície de poliestireno 75 centímetros 2 frasco de ultra cultura de tecidos etiquetada com o nome, data e número de passagens de linha celular. Adicionar 10 ml de meio de células estaminais, suplementado com EGF e FGF, como descrito, para o frasco. </li><li> Adiciona-se 6 ml de células estaminais meios para o balão com a tripsina. Solução de células Pipet cima e para baixo e tentar soltar as células da superfície do frasco. Transferir volume inteiro de células de ultra baixa balão anexo contendo os 10 ml tronco media celular. Colocar o balão em humidificada incubadora de cultura de células definido para 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Suplemento culturas TIC cada 48-72 horas, com um adicional de 2 ml de meio de células estaminais e de EGF e FGF fresco para uma concentração final de 20 ng / ml e 10 ng / ml, respectivamente. </li><li> Monitorizar as células até 60-80% de confluência é atingido. Culturas divididas por colocar volumes iguais em dois novos frascos de ultra baixo de fixação e adição de mídia de células-tronco frescos para atingir um volume final de 18 ml. Alternativaly, centrífuga toda a suspensão a 4 ° C durante 5 minutos a 400 x g. Suspenda as células em meios de células-tronco suplementado com EGF e FGF e distribuir igualmente em novos frascos ultra-baixo de fixação. Células não tem que ser dissociados em suspensões de células individuais para passagem em. NOTA: Neste ponto, as culturas podem continuar a ser dividida e culta, congelados, ou experimentalmente manipulado para análise. A 60 - 80% de confluência as seguintes concentrações de células foram recuperadas por ACI-23: 8,0 x 10 6 para tradicional aderente, 4,0 x 10 6 para tradicional TIC, e 5,0 x 10 6 para culturas Flutuador TIC. Embora possa ser a linha celular dependente, verificou-se que de 5 - 10 dias em cultura é óptima para TIC enriquecimento como a percentagem de CD133 + ALDH + células é baixo durante os primeiros 3 dias, picos em 5-10 dias e diminui novamente em 14 dias. </li></ol> 3. Geração de primária do cancro do ovário epitelial linhas celulares e multicelulares Spheroidsa partir de ascite do paciente resistente à quimioterapia NOTA: aprovação Institutional Review Board foi obtido para esse protocolo. Toda a manipulação de células e meios de comunicação devem ter lugar num estéril capa de cultura de tecidos. <ol><li> Placa de fluido de ascite 1: 1 com meio de cultura celular tradicional. Prepare mídia, como descrito na seção 1 e adicione 10 ml de vários frascos de poliestireno 75 cm 2 de cultura de tecidos tradicionais. </li><li> Fluido ascite é normalmente fornecido em 1 L garrafas de vácuo estéril; retire a tampa de vácuo. Adicionar cuidadosamente 10 ml ascite fluido ao balão contendo 10 ml de mídia tradicional e colocar em umidificado incubadora de cultura de células definidas para 37 ° C e 5% de CO 2. Deixe em repouso por 72-96 horas, antes de fazer uma mudança de mídia completo. Mudança de mídia a cada 2-3 dias até que as células atingem 60-80% de confluência </li><li> Uma vez que as células atingem 60-80% de confluência, divididas 1: 2, conforme descrito na Seção 1. culturas Iniciar TIC como descrito na seção 2. NOTA: Os eritrócitos presentes no ascites será removido após a primeira mudança de mídia como eles são não-aderente. Quaisquer fibroblastos presentes será em grande parte removido após o tratamento com tripsina como eles são mais sensíveis e vai levantar com exposição mínima a tripsina. Pureza de células de cancro do ovário foi determinada por análise de citometria de fluxo utilizando o anticorpo para o CA-125 (MUC16). </li></ol> 4. coloração de células para a confirmação de Citometria de Fluxo de TIC Markers <ol><li> Recolha culturas TIC. Transferir o conteúdo do frasco em polipropileno de 50 ml tubo de centrífuga. As suspensões de centrifugação durante 5 minutos a 400 x g. Media Aspirar e lavar com água morna PBS. Adicionar 2 ml de solução de dissociação de células não enzimática, incubar 3-5 min a 37 ° C, e pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados e dissociar-se em células individuais. Adicionar 4 ml de meio de células estaminais. </li><li> Recolha culturas aderentes. Media Aspirar e lavar com água morna PBS. Adicionar 3 ml de solução de dissociação de células não enzimática e incubar 3-5 min a 37 ° C. Adicione 3 ml de células tradicionalmeios de cultura e pipetar cima e para baixo várias vezes para retirar células da garrafa e recolher em tubo de centrífuga. </li><li> Centrifugar tanto TIC e suspensões aderentes durante 5 minutos a 400 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cada 1 ml de PBS contendo 3% de soro fetal bovino. Incubar à temperatura ambiente 30 min. Enquanto isso, contar o número de células viáveis ​​utilizando azul de tripan. Observar as células ao microscópio para confirmar esferóides são dissociados em células individuais. </li><li> Etiqueta 5 x 1,5 ml Eppendorf tubos para cada uma das seguintes condições de cultura: 1) Unstained (controle unstained de indemnização), 2) ALDH (controle única mancha positivo para compensação), 3) CD133 (controle positivo única mancha de indemnização), 4 ) ALDH + CD133 (amostra de teste experimental), e 5) DEAB ALDH + (controlos negativos para a fluorescência de fundo em FL-1 e FL-4 canais, respectivamente). </li><li> Distribuir aproximadamente 5 x 10 5 células cada, para tubos # 1 - 4. Centrifugue as suspensões durante 5 min a 400 x g. Aspirar supernatant e ressuspender pelotas em 500 ul ALDEFLUOR Tampão de Ensaio. Adicionar 10 DEAB ul (inibidor de ALDH) para tubo # 5 para controle experimental negativo. </li><li> Adicionar 5 mL ativados reagente ALDEFLUOR para tubo # 2 para controle positivo compensação e pressione levemente para misturar. Adicionar 5 mL ativados reagente ALDEFLUOR para tubo # 4 para análise experimental. Flick tubo para misturar e transferir imediatamente a metade do volume de células a partir de tubo no tubo # 4 # 5 (250 ul), que contém o DEAB. </li><li> Tubos Flick para misturar bem. Incubar todos os tubos para 30 - 45 min a 37 ° C protegido da luz. Tubos Flick meio período de incubação como células vão se depositar no fundo. Centrifugar todos os tubos durante 5 min a 400 x g. Células sobrenadante e ressuspender Aspirar em 500 ul ALDEFLUOR Tampão de Ensaio. </li><li> Para tubos com coloração CD133 (# 3 e # 4), adicione-CD133 APC 01:11 diretamente em tampão de ensaio ALDEFLUOR. Incubar 15 minutos em gelo ao abrigo da luz. Tubos de centrífuga de CD133 para 5 min a 400 x g. Lavar uma vez com500 ul de tampão de ensaio ALDEFLUOR. Ressuspender as células em tampão de ensaio ALDEFLUOR 500 ul, respectivamente. </li><li> Filtro de suspensões em poliestireno indivíduo rodada tubos de fundo com tampa de filtro de células. Assegure-se que todo o volume é filtrada através da tampa. </li><li> Utilizar um citómetro de fluxo para analisar a população de células. Use tubos # 1-3 para a configuração dos controles de compensação. Usando a frente e parâmetros lado de dispersão, porta das células, tendo a certeza de excluir detritos celulares. Estabelecer células duplas usando FL-1 e FL-4 canais, respectivamente ALDH + e CD133 +. </li><li> Usando um programa de análise de citometria de, confirmar as condições de cultura aumentou a percentagem de células TIC como as culturas ricas em TIC deve ter coloração mais elevada para estes dois marcadores. NOTA: Para além CD133 e de ALDH, outros TIC markersof cancro do ovário pode ser analisada com o número de marcadores utilizados em qualquer amostra dependem das capacidades de citómetro de fluxo. </li></ol> 5. in vivo </em&gt; subcutâneas Injeções para Confirmar Tumorigenicidade de populações de células NOTA: aprovação Institutional Review Board foi obtido para esse protocolo. Distribuir atímicos ratinhos nus fêmea 6 - 8 semanas de idade em grupos experimentais em gaiolas de 3 e permitir a aclimatar durante alguns dias antes das injecções. Siga os ratos sob diretrizes experimentais humanas como por NIH Animal Care e do Comitê Use; monitorar o peso do corpo, a aparência física, incluindo a perda de peso ou ganho superior a 20%, a aparência emaciada, diarreia ou dermatite e eutanásia camundongos enquadrem nestes critérios por CO 2 asfixia. <ol><li> Recolha culturas como descrito na seção 2. Ressuspender cada população de células em 1 ml de PBS. Contagem de células viáveis ​​utilizando trypan ensaio azul. </li><li> Prepare 15 ml tubos de centrífuga. Para triplicado medidas adicionar 1,5 x 10 6 células viáveis ​​diluído em 2 ml de PBS em cada tubo (5 x 10 5 células em um volume de 0,5 ml por via subcutânea será injectado no direito fescorridos de cada mouse). Preparar 0,5 ml de PBS apenas para os ratinhos de controlo. </li><li> Utilizando agulhas 27 G, subcutaneouslyinject 0,5 ml de suspensão de células a partir de culturas aderentes, as culturas tradicionais TIC tradicionais, floater culturas TIC, ou PBS no flanco direito de cada um dos três ratinhos por grupo. Retorno ratos para o gaiolas originais após a injecção. </li><li> Pesar ratos e medir eventuais tumores palpáveis ​​em duas dimensões duas vezes weeklyby Vernier caliper, estabelecendo comprimento e largura. NOTA: tempo de latência do tumor é geralmente 20 - 50 dias, dependendo da linha celular. </li><li> Calcular o volume do tumor molhada através de métodos padrão (V = (largura) 2 x comprimento / 2). NOTA: Embora este estudo comparou tumorigenicity de TICs contra células aderentes para a primeira geração apenas, in vivo passagens em série de TICs cultivados em condições semelhantes foi completado por outros 11,20. </li></ol>

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M., Lim, B., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+to+Nanog,+Oct4+and+Sox2+coding+regions+modulate+embryonic+stem+cell+differentiation.">MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation.</a> Nature. 455, 1124-1128 (2008).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+impact+of+the+cancer+stem+cell-related+marker+NANOG+in+ovarian+serous+carcinoma.">Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma.</a> Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O protocolo aqui descrito apresenta um método eficiente e consistente para enriquecer culturas de células com características de células estaminais a partir de linhas celulares de cancro do ovário estabelecidos e é aplicável a amostras primários do paciente. Este método enriquece com sucesso para TIC através de uma variedade de linhas celulares. Ele permite a identificação atempada de condições que enriquecem de TIC e / ou fenótipo tumorigenic, sem ter tempo para classificar fisicamente as TICs de não-TICs dentro da população. Deste modo, os níveis relativos de diferentes vias de sinalização pode ser avaliada para a sua contribuição para o fenótipo TIC comparando culturas aderentes tradicionais para Tic culturas, utilizando uma variedade de ensaios funcionais. Se uma população pura TIC for desejado, o isolamento pode ser facilmente conseguida por incorporação de um passo assistida por fluorescência ou magnético triagem de citometria de fluxo no protocolo. É importante ter em mente, contudo, que a expressão do marcador TICs, tais como CD133, CD44, ou de ALDH, pode variar entre linhas celulares ou amostras mesmo do mesmo tipo do tumor do paciente. Por exemplo, descobrimos que os OVCAR-5 células têm maior expressão de CD44 em relação ao CD133, ao passo que o inverso é verdadeiro para ACI-23. É, por conseguinte, pertinente para invocar iniciação do tumor em ratinhos e análise de citometria de fluxo como definitivo presença de TIC. Seguindo este protocolo, elevada actividade de ALDH foi consistentemente observada quando as células de cancro do ovário foram cultivadas em condições de células estaminais. Curiosamente, a expressão de CD133 é consistentemente maior na ACI-23 células cultivadas em condições tradicionais de cultura de TIC, enquanto ALDH é maior em floater condições TIC. Em contrapartida, os TGS-3 células ascite primárias exibir um pequeno aumento no CD133 positividade sob floater condições de TIC, mas um notável aumento na atividade de ALDH em condições TIC tradicionais. Estes resultados destacam a heterogeneidade das células de câncer de ovário e a plasticidade comumente associado com TICs. Para apoiar ainda mais o claim que estes métodos aprimorar TICs, também foi observado o enriquecimento de TRA-1-60 células positivas. TRA-1-60 é um marcador de pluripotência e tem sido usada para identificar os carcinomas embrionários do testículo e ovário, bem como cancro da próstata TIQUES 30-32. Embora os métodos têm sido bem sucedidas com numerosas linhas celulares, é possível que as condições normais de TIC pode ser mais adequada para algumas células de cancro do ovário, enquanto que os flutuadores condições modificadas melhor enriquecimento em tiques em outras populações de células de cancro do ovário. Esta novamente ressalta a heterogeneidade esperado em ambas as linhas de células de cancro do ovário paciente derivados e estabelecidos. Além de marcadores de superfície celular, existem vários fatores de transcrição que foram mostrados para caracterizar TICs câncer de ovário, incluindo Nanog, Sox2, Oct-4 11, embora estes marcadores não são específicos para TICs câncer de ovário e, em vez representam fatores importantes para a pluripotência das células-tronco embrionárias e difdife- 33,34. Foram examinadas as mudanças nos níveis de proteína desses fatores e descobriu que os níveis de Nanog aumentar em TIC condições de cultura, de acordo com os outros 13,35, bem como CD133, TRA-1-60, e CD117. Um marcador de células-tronco cDNA matriz humana revelou ainda um aumento na genes CD133, NANOG, Melk, e PODXL nas condições de TIC em relação às condições de aderentes tradicionais. Importante, deve-se notar que, tal como com marcadores de superfície celular, factores de transcrição associadas com tiques do ovário pode variar entre linhas celulares e amostras de pacientes. Observou-se que as células podem ser mais tumorigénico e expressar níveis mais elevados de marcadores de células estaminais se eles são inerentemente não aderentes in vitro (isto é, células que não são facilmente anexados a uma placa aderente flutuante). Em cultura, as linhas celulares tais como ACI-23 tipicamente tem muitas células viáveis ​​flutuantes e / ou células que crescem verticalmente de uma forma tradicional sob empilhamento Condit culturaíons. Apesar de enriquecimento de sucesso de TICs a partir de células flutuantes e agregados podem ser linhas celulares aplicáveis ​​aos relativamente poucos incluindo os do presente estudo e OVCAR-3 12, os nossos resultados sugerem que isso pode representar uma população mais tumorigenic. Por isso, a colheita da população &quot;flutuante&quot; de células cultivadas em placas de cultura de tecidos e meios de comunicação podem servir como um método alternativo de TIC de enriquecimento, para as células que se adaptam mal aos meios de comunicação de células estaminais comercial. A utilização dos diferentes métodos de cultura apresentados neste manuscrito permitirão o enriquecimento de populações TIC rápido e uma melhor compreensão dos factores que suporta este fenótipo de células diferentes. As aplicações atuais deste método incluem caracterização que vias de sinalização são vitais para apoiar a propagação dessa população única de células. Os resultados destes estudos vão ajudar a esclarecer os mecanismos de progressão tumoral e recaída.

O câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal nos Estados Unidos com a maior causa de morbidade e mortalidade, sendo os recursos quimiorresistentes altamente recorrentes da doença. O tratamento primário geralmente compreende cirurgia cytoreductive máxima e terapia baseada em platina subseqüente, embora haja alguns indícios que sugerem terapia neoadjuvante pode ser benéfico em alguns casos um. A maioria dos pacientes respondem favoravelmente ao tratamento primário, mas, infelizmente, metade vai recaída no prazo de 18 meses 2. A maioria dos tumores malignos de ovário são carcinomas epiteliais e pode ter origem no epitélio da superfície do tubo de 3,4 ovário ou de Falópio. Vários estudos suportam a existência de células-tronco somáticas no sistema reprodutivo feminino que, presumivelmente, ajudar na reparação de tecidos que é necessário após a ovulação 5,6. A atividade proliferativa alta tanto no ovário e trompa de Falópio durante ovulção pode ser um fator importante no desenvolvimento do câncer de ovário (Gharwan, et al. manuscrito submetido). A derivação de células formadoras de tumor não é clara, mas pode surgir a partir de células estaminais normais, células progenitoras, células diferenciadas, ou através de mutações que os tornam incapazes de regular a divisão ou o destino. Estas células também têm sido chamadas de &quot;células-tronco cancerosas&quot;, ou &quot;células iniciadoras de câncer&quot;, e pode crescer em tumorigênicos, esferóides multicelulares em condições de pouca fixação. Embora o modelo hierárquico de desenvolvimento TIC pode ser dinâmico, TICs não compartilham muitos dos mesmos recursos que as células-tronco normais, incluindo quietude, a resistência à quimioterapia, a longo prazo de auto-renovação e capacidade de se diferenciar em várias linhagens de células 7,8. Vários estudos sustentam a existência de TICs no câncer de ovário e os esforços atuais estão em andamento para esclarecer o mecanismo (s) pelo qual essas células apoiar tumorigenesis 9-11. Vários marcadores têm sido propostos para identificar TIC ovarianos com tumorigenicidade aumentada incluindo CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, e MyD88, embora a contribuição exacta de cada marcador é clara e pode ser do tipo celular específico de 11-16. Enquanto um marcador universal ou conjunto de marcadores não tenha sido inequivocamente estabelecida para TIC ovarianos, diferentes grupos isolaram TIC ovarianos mais vulgarmente por selecção de CD44 +, CD133 + e / ou células com alta aldeído desidrogenase (ALDH) actividade 13,17-21. CD44 é uma glicoproteína transmembranar que actua como um receptor de ácido hialurónico e regula vários processos importantes para a progressão tumoral, incluindo adesão, proliferação, migração, angiogénese e diferenciação 22. CD133 é uma glicoproteína transmembranar cuja função ainda não está claro, mas estudos sugerem que organiza topologia membrana plasmática 23. ALDH, uma enzima intracelular que catalisa a oxidação de aldeídos, pode ser a mais Universai marcador de tiques como elevada actividade tem sido identificada em células estaminais isolado a partir de uma variedade de tecidos e várias funções têm sido atribuídas a ALDH no apoio células estaminais normais e tiques 24. A partir de agora, CD133 e ALDH1 parecem ser os marcadores mais reproduzíveis de TICs ovário 13,21. Para além de compreender as características dos tiques, há também um grande esforço para identificar drogas que visam especificamente esta subpopulação. A alta taxa de recaída associada com o cancro do ovário pode ser devido a uma falha de quimioterapias actuais para erradicar com sucesso TIC. Embora a massa do tumor é susceptível às terapias existentes, tiques são pensados ​​para ser resistente e com uma densidade indetectáveis ​​através de métodos padrão. Elucidar mecanismos de resistência a terapia e recidiva tumoral são vitais para melhorar a resposta e taxa de sobrevida de pacientes com câncer de ovário. Aqui, as técnicas de cultura são descritas thno enriquecimento em TICs de linhas celulares de cancro do ovário estabelecidos e primários. As condições de cultura aqui descritos têm sido utilizados por vários grupos para induzir a propagação de células de tiques ou esferóides com qualidades de células estaminais 11,12,14,16,20. Embora existam vários meios de cultura de células-tronco e suplementos comumente utilizados para o enriquecimento de TIC / esferóides foi utilizada uma fórmula de meio isento de soro com EGF e FGF, mas sem a adição de B27 ou N-2 suplementos. Estes suplementos, vulgarmente utilizados para a cultura de células neuronais e de enriquecimento para células estaminais, têm sido mostrados para promover um fenótipo mesenquimal 25,26 e continua a haver alguma incerteza no campo quanto ao facto de TIC com um mesenquimatosas ou epiteliais fenótipo tumorigénico 27-29 são mais . Para minimizar incertezas e variáveis, optamos por usar a fórmula mais comum, uma vez que estamos lidando com células câncer epitelial de ovário. A manutenção de células em meio isento de soro num balão de fixação baixofacilita a formação esferóide e apoia a propagação de células com expressão de CD133 e alta atividade ALDH. Nosso trabalho ainda mostrou que as células flutuantes em condições normais aderentes também pode representar uma população TIC mais tumorigenic. A injecção de células cultivadas nestas condições em ratinhos nus atímicos leva a um maior potencial tumorigénico em comparação com células cultivadas em condições associadas na presença de soro. Muita informação sobre o papel de TICs na iniciação do câncer de ovário, progressão, resposta terapêutica, e recidiva da doença pode ser adquirida através do uso destas técnicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:308px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:104px;">83.1813.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Aldefluor Kit</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:104px;">1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">CD133-APC</td>
			<td style="width:191px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:104px;">130-090-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F0291</td>
			<td>Prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Epidermal Growth Factor - human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E9644</td>
			<td>Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium)</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:104px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:191px;">Gemini</td>
			<td style="width:104px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron)</td>
			<td style="width:191px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro enrichment of ovarian cancer tumor-initiating cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

Estabelecido linhas celulares de cancro do ovário e uma linha de células de ascite primário cultivadas em condições de cultura aderentes tradicionais, na presença de soro anexos mostram, a morfologia de paralelepípedos, enquanto que as mesmas células cultivadas em condições de cultura de TIC exibem morfologia flutuante esferóide, comuns em populações de TIC. Imagens Brightfield exibidos na Figura 1 A mostra claramente as diferenças morfológicas nas condições de cultura. A Figura 1B mostra as morfologias diferenciadas alcançados após repique os ACI-23 e TGS-3 culturas TIC em condições aderentes tradicionais. Apenas 24 horas após a sementeira de volta em condições aderentes, a maioria dos esferóides multicelulares dissociam-se e aderem à superfície, assemelhando-se as células aderentes típicos. Para verificar se as condições de TIC para enriquecer células com marcadores de células tronco citometria de fluxo foi realizada utilizando dois marcadores comuns de TICs ovarianos - CD133 expression e actividade de ALDH. Os gráficos de pontos mostrado na Figura 2 A destacar o aumento da percentagem de células CD133 + em baixo fixação, condições isentas de soro. Do mesmo modo, a actividade da enzima é mais elevada ALDH nestas condições em comparação com as condições tradicionais de cultura aderentes. Embora as culturas aderentes tradicionais contêm células CD133 +, os aumentos percentuais em condições que aumentam a formação esferóide. Análise de um marcador de pluripotência, TRA-1-60, presta um apoio adicional de que as condições de TIC para enriquecer TICs, Figura 2 B. Quantificação na Figura 2 C demonstra que a dupla positivos (CD133 + ALDH +) ACI-23 células são em grande parte limitada a culturas cultivadas sob condições que reforcem TIC. Alterações nos níveis de proteínas de diferentes fatores de transcrição que ocorrem nas células ACI-23 após cinco dias de cultura nas condições de TIC também foram examinados. Um aumento progressivo em cada um dos marcadoress é visto desde o tradicional ao floater condições TIC em comparação com os níveis relativamente baixos verificados na cultura aderente, Figura 2 D. Curiosamente uma linha de células de ascite humano cultivado nas várias condições exibe a mais elevada fenótipo marcador sob as condições TIC tradicionais com pouca ou nenhuma coloração presentes nos flutuadores condições TIC, Figura 2E. A tumorigenicidade das condições de cultura TIC foi validado através de injecções subcutâneas de números iguais de células viáveis ​​obtidas a partir de todas as condições em coortes de ratinhos nus atimicos. A Figura 3 demonstra que ACI-23 (a, b) e OVCAR-5 (C) a partir de células culturas aderentes tradicionais foram menos tumorigénicas que as das culturas de TIC. Note-se que as culturas floater TIC produzidos tumores maiores em um período de tempo mais curto do que as culturas tradicionais TIC aderentes ou tradicionais. Estes data sugerem que até mesmo com um modesto aumento nos marcadores de TIC ovarianos, há uma alteração fenotípica dramática. No entanto, com outras linhas de células (não mostradas) as culturas tradicionais TIC foram tumorigénicas mais do que as células de cultura de TIC aderentes e flutuador tradicionais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> Figura 1. esferoidal de desenvolvimento em diferentes condições de cultura. (A) estabelecido linhas celulares de cancro do ovário células primárias derivadas de ascites de doentes (TGS-3) cultivadas em frascos de fixação com baixa sem soro (ACI-23, OVCAR-5 e CAOV3) e meios de células estaminais prontamente formar esferóides multicelulares. Imagens mostram condições tradicionais de cultura aderentes manter morfologia paralelepípedos epitelial na ACI-23, OVCAR-5, CAOV3 e TGS-3 células, enquanto que as mesmas células esferóides formados dentro de 96 horas em condições de TIC. A barra de escala 100? M. (B) Após a exposição 24 hràs condições tradicionais de cultura aderentes, as morfologias cultura TIC apresentam um fenótipo diferenciado assemelhando-se a morfologia aderente inicial. Bar Scale 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> Figura 2. Baixa-fixação, condições isentas de soro, para enriquecer as células com marcadores de TIC. (A) análise de citometria de fluxo de ACI-23 células utilizando anticorpo conjugado com APC CD133 demonstra um aumento da percentagem de células CD133 + em frascos com haste de fixação de baixo sem soro meios celulares. Citometria de fluxo utilizando ALDEFLUOR mostra ensaio aumento da atividade ALDH em células cultivadas em frascos de baixo apego com media de células-tronco sem soro. Controle negativo CD133 não contém anticorpos e ALDH con negativocontrole é o substrato activado na presença do inibidor da ALDH (DEAB). (B) Análise usando conjugado com FITC TRA-1-60 anticorpo demonstra maior percentual de células TRA-1-60 + nos floater condições TIC na ACI-23 células. O controlo negativo contém nenhum anticorpo. (C) CD133 + ALDH + células são mais elevadas no TIC tradicional e floater condições TIC na linha celular ACI-23. As barras de erro: SEM, N = 6, * p &lt;0,05. (D) Análise de Western blot mostrando aumento nos níveis de proteína de marcadores de transcrição de células-tronco no ACI-23 células cultivadas em condições de TIC para 5 dias. Os lisados ​​de células inteiras (50 ug) foram analisados ​​com GAPDH como um controlo de carga. (E) gráficos de pontos representativos de TGS-3 células ascite primários analisados ​​como em Um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 3. Baixa-fixação, condições isentas de soro, o enriquecimento em células com o aumento da tumorigenicidade. (A) 5 x 10 5 viáveis ​​ACI-23 As células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus atímicos em triplicado. Os ratinhos foram pesados ​​e os tumores medidos com um compasso duas vezes por semana. A = A cultura tradicional aderente, cultura F = Floater TIC, cultura S = Tradicional TIC. * P &lt;0,05. (B) Imagens representativas de tumores formados a partir ACI-23, depois de 25 dias, utilizando células cultivadas sob diferentes condições de cultivo. (C) 5 x 10 5 viáveis ​​OVCAR-5 células foram injetadas em ratos por via subcutânea nu atímica em triplicado e monitorados como em Um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Em Enriquecimento vitro de câncer de ovário de iniciação Células Tumorais

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

13.7K visualizações.  National Cancer Institute. Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Vídeo: In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Medicina

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

Isolamento livre-Label e enriquecimento de células através de contato dieletroforese

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.