Agradecemos ao Dr. U. Ashery pelo dom da NPY-MRFP cDNA. Agradecemos Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein para ajuda inestimável com microscopia e análise de imagem. Agradecemos também o Dr. Joseph Orly para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Israel Ciência, fundada pela Academia de Ciências de Israel (1139/12 a RS-e.).

1. Preparação de células RBL Meios de Cultura <ol><li> Misturar 500 ml de meio de Eagle modificado de baixo teor de glucose de Dulbecco (DMEM) com 56 ml de soro fetal bovino (esta faz com que 10% de FBS), e, em seguida, adicionar 5,5 ml de penicilina estreptomicina (isto faz ~ 1% PEST). </li><li> Filtrar a mídia usando 500-1.000 ml Bottle-Top Filtros de vácuo com 0,22 tamanho dos poros e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Cultura de Células RBL <ol><li> Cultivar células RBL em uma atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C quer em placas ou frascos. Células RBL que estão crescendo em placas de 10 cm deve ser suplementado com 10 ml de meio e formar monocamada confluente de ~ 10 7 células / placa. </li><li> Quando a camada celular se aproxima confluência, replate a cultura a uma densidade inferior. <ol><li> Remover o meio de cultura a partir da placa / frasco, utilizando uma pipeta pasteur estéril ligada a vácuo. </li><li> Lavar a monocamada de células com pré-aquecido (37° C) de 0,25% de tripsina / EDTA, que cobre toda a monocamada (o volume depende do tamanho da placa de cultura / frasco; 2 ml para placa de 10 cm). Isto vai separar as células. </li><li> Alternativamente, lavar a monocamada de células com tampão de fosfato salino (PBS), remover o PBS e adicionar pré-aquecido (37 ° C) de tripsina / EDTA. Este passo separa as células mais rapidamente. </li><li> Colocar a placa / balão numa incubadora a 37 ° C (não mais do que 10 min). </li><li> Inspecione as células ao microscópio óptico para verificar se eles têm destacado. Se as células não se separar após 10 min, bater suavemente na placa / balão. </li><li> Adicionar suporte para a placa de cultura / frasco para suspender as células (o volume do meio deveria ser de pelo menos 2 vezes maior do que o volume da solução de tripsina). </li><li> Agregar as células por centrifugação durante 3 minutos a 200 g a 25 ° C. </li><li> Ressuspender as células em meio. Dilui-se as células por 1:10 e sementes de uma nova placa de cultura. Incubar as células durante 48-72 horas, até que eles REACh aproximadamente 90% de confluência. </li><li> Repita o mesmo procedimento (seção 2.2.1-2.2.8) para até 3 meses (30 passagens). </li></ol></li></ol> 3. Preparação de Transfection Mídia. <ol><li> Prepara-se uma solução 100 mM de K-Tubos de pH 7, de solução de 1 mM de Ca2 + de etilo e solução 100 mM de acetato de Mg 2+. </li><li> Dilui-se a solução 100 mM de K-pipes pH 7 em 20 mM utilizando meio DMEM, adicionar a solução de 1 mM de Ca2 + de etilo até uma concentração final de 10 uM e solução 100 mM de acetato de Mg 2+ para uma concentração final de 2 mM. </li><li> Pesar glutamato de potássio e adiciona-se à solução a uma concentração final de 128 mM, misturar bem e manter a 4 ° C até à sua utilização. Manter as soluções restantes (isto é., K-Tubos, Ca 2+ acetato, Mg 2+ de etilo) a -20 ° C. </li></ol> 4. transfecção de células RBL <ol><li> Remover o meio de cultura a partir da placa / balão usando umpipeta pasteur estéril ligada a vácuo. </li><li> Lavar a monocamada de células com pré-aquecido (37 ° C) tripsina / EDTA que devem cobrir todo o monocamada. Colocar a placa / balão numa incubadora a 37 ° C (não mais do que 10 min). Verificar se as células terem separado utilizando o microscópio óptico. </li><li> Adicionar suporte para a placa de cultura / frasco para suspender as células (o volume dos meios de comunicação deve ser, pelo menos, 2-maior mais do que o volume da solução de tripsina). </li><li> Contar o número de células usando hemocitômetro. </li><li> Agregar 1,5 × 10 7 células por centrifugação durante 3 minutos a 200 xg a 25 ° C. Descartar o sobrenadante e adicionar 280 uL de meio de transfecção. Transferir a mistura reaccional para dentro de 4 milímetros cuvete. </li><li> Adiciona-se 20 ug de plasmídeo MRFP NPY-e ou 30 ug de plasmídeo de controlo vazio ou um plasmídeo testado. O volume final da mistura de reacção deve ser de 300 uL. </li><li> Colocar imediatamente em gelo durante 10 min. Limpe a tina de água residual e proceed a electroporação a 300 V durante 9 ms. </li><li> Para as medições de exocitose, replate as células imediatamente em placas de 24 poços de cultura de tecidos contendo meio de 300 ul. Adicionar 8 ul da mistura reaccional (4 x 10 5 células) para cada poço. Adicionar células 4 × 10 5 não transfectadas para poços adicionais para o controle. Prepare poços suficientes para ter, pelo menos, poços duplicados para cada tratamento para cada transfecção. </li><li> Para a microscopia de lapso de tempo, replate as células imediatamente num sistema de câmara de lamela de borossilicato de 8 poços contendo 80 ul médio. Adicionar 1,5 mL da mistura de reacção (7,5 x 10 4 células) para cada câmara. (Tentar evitar o uso das câmaras na borda da lamela, as câmaras no centro da lamela são mais fáceis de imagem). NOTA: É importante ressaltar que nem todas as células envolvidas na resposta a um gatilho e, ocasionalmente, a microscopia de lapso de tempo é revogada devido à perda de foco e deriva do borosi câmara de 8 poçossistema lamela licate. Assim, preparam-se pelo menos oito câmaras de cada tratamento para cada transfecção. </li><li> Para sensibilizar as células para a activação mediada FceRI, adicionar 1 ug / ml de DNP de rato monoclonal IgE específica para os meios de comunicação (incubar as células com níveis de IgE durante pelo menos 2 horas). </li><li> Após 18-24 h usar um microscópio de fluorescência para confirmar que as células expressam os plasmídeos. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência são MRFP: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP deve aparecer em estruturas vesiculares que correspondem aos GV. Se o segundo gene de interesse é fundido com um marcador fluorescente usar um microscópio de fluorescência para confirmar a co-expressão de ambos os plasmídeos nas mesmas células. Por exemplo, se o gene testado é fundido a GFP, Os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência da GFP são: λEx 488, λEm 507 nm. A proteína GFP tag deve aparecer nas mesmas células que expressam NPY-MRFP. </li><li> Para as medições de exocitose proceder to passo 5 e para a microscopia de lapso de tempo, vá para a etapa 6. </li></ol> 5. Medição NPY-MRFP Exocytosis <ol><li> Preparação de tampão de Tyrode: <ol><li> Prepara-se uma solução de KCl 54 mM, 20 mM de MgCl2, 2,74 M de NaCl e 8 mM de NaH 2 PO 4 em DDW. Misturar bem e armazenar a 4 ° C. Este passo é para a preparação de 20x tampão de Tyrode. </li><li> Prepara-se uma solução de tampão Hepes 20 mM, pH 7, CaCl 2 1,8 mM, 1 mg / ml de BSA, 5,6 mM de glucose e 1 a 20 de Tyrode diluição 20x em DDW e misturar bem. Este passo é para a preparação de 1x tampão de Tyrode. </li><li> Alíquota da 1x tampão Tyrode e armazenar a -20 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido. </li></ol></li><li> Remover o meio de cultura da placa de 24 poços e lava-se 3 vezes com tampão de Tyrode. Preparar as células não estimuladas por adição de tampão de Tyrode 200 ul a poços de controlo. </li><li> Preparar 10 ul / poço de reagente de activação concentrada 20X [(por exemplo, 1.000 ng / mL DNP-BSA ou DNP-HSA (Ag), 200 uM de ionóforo de Ca 2+ (por exemplo, A23187), e uma combinação de 20 uM de ionóforo de Ca 2+ e 1000 nM de 12-O- tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA)]. Se os reagentes são armazenados em DMSO, dilui-se os reagentes em 20x concentração em tampão de Tyrode contendo 1% de DMSO. Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remove-se os sobrenadantes de cada poço cuidadosamente para uma placa de 96 poços, colocar em gelo e evitar de luz. (Os sobrenadantes contêm o péptido quimérico NPY-MRFP que foi libertado a partir das células). </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de Tyrode contendo 0,5% de Triton X-100 a cada poço e incubar a 37 ° C durante 10 min. (Este passo é importante para a preparação de lisados ​​de células que contêm o restante do NPY-MRFP que não foi libertado das células). Recolher os lisados ​​de células e transferir para uma placa de 96 poços, colocar em gelo e evitar de luz. </li><li> Medir a fluorescência das células sobrenadantes e os lisados ​​de células utilizando um fluoresleitor de placas cia, utilizando um 590-, 20 nm de largura de banda de excitação do filtro e 635-, 35 nm, filtro de emissão de largura de banda. </li><li> Calcular a percentagem de NPY-MRFP lançado: NOTA: A medida leitor fluorescência unidades de fluorescência arbitrárias (AFU). AFU valores dependem da máquina e a sua sensibilidade e a eficácia de transfecção. <ol><li> Defina a autofluorescência de células RBL não transfec- em branco. Divida a AFU de cada sobrenadante para a fluorescência total (AFU do sobrenadante + AFU do ligado correspondente) e multiplicar por 100. </li></ol></li></ol> 6. Time-lapse Microscopia de Exocytosis <ol><li> Semente de 7,5 x 10 4 a de células / câmara num sistema transfectadas lamela de borosilicato câmara de 8 poços. Após 18-24 h, remover o meio de cultura a partir das câmaras e lavar 3 vezes com tampão de Tyrode </li><li> Adicionar 72 ul de tampão de Tyrode para cada câmara. Dilui-se os reagentes de activação em tampão de Tyrode a 10X a concentração. </li> &lt;li&gt; Use um microscópio confocal de fluorescência equipado com uma câmara aquecida (37 ° C) e CO 2 controlador (4,8%) e uma objectiva de 40X ou 63X. Ligue os sistemas de microscopia: lâmpada de mercúrio, computador e lasers. Certifique-se de que a câmara aquecida está na temperatura certa antes do início do experimento. </li><li> Coloque a câmara na câmara aquecida e certificar-se de que a câmara está instalada corretamente e estável. </li><li> Ligar a luz de fluorescência de acordo com o fluoróforo em causa e visualizar as células transfectadas. Desligue fluorescência uma vez por célula de interesse está no campo, a fim de minimizar o branqueamento e citotoxicidade. É importante que este campo irá conter cerca de 2-3 células transfectadas. As células transf deve ser bem espalhado, mas não tocar o outro. </li><li> Ajustar a potência do laser (dependendo do microscópio) para minimizar o ruído e supersaturação, bem como a toxicidade, e definir o ganho e deslocamento para modificar a relação sinal-ruído. Digitalização rápida ouder a minimizar a duração de exposição a laser (média de 2). </li><li> Ajustar o tamanho do furo de pino para um máximo, isto capaz de reduzir a potência do laser e para manter as imagens focadas por um longo período de tempo. Se desejar, defina os parâmetros para a pilha Z para reconstruir a imagem em três dimensões, ajustar o tamanho pinhole a 1 unidade arejado (UA), que dá a melhor relação sinal-ruído e adquirir digitalização sucessiva de fatias ópticos confocal bidimensionais no -axes z com fatias ópticos ≤0.7 mm. </li><li> Defina o tempo de intervalo entre cada aquisição de 15-30 seg e a duração de aquisição total para 15 min e começar a aquisição de imagens. Após 5 min de aquisição pausa da série histórica. Adicionar 8 mL da trigger 10x e continuar imediatamente a aquisição. </li><li> Salve as imagens, execute deconvolution usando um software deconvolution e reconstruir as pilhas de imagens tridimensionais e um filme usando software Imaris. </li></ol><ol><li> Importar os dados a partir das imagens da série deconvoluídos vez que foram obtidos pela microscopia de fluorescência confocal para software Imaris. Este software lê mais de 40 arquivos de microscopia. Se o software não consegue ler os arquivos; converter os arquivos para arquivos tif e importação. </li><li> Para adicionar pontos de tempo para o fim de um conjunto de dados aberto pressione editar -&gt; Adicionar pontos no tempo e importar o novo conjunto de dados. </li><li> Criar superfície do canal MRFP usando opção de assistente de superfície. Escolha o algoritmo padrão. Escolha o canal de NPY-MRFP. Marque a opção de suavização para reduzir o ruído. Para evitar a perda de pequenos detalhes reduzir o nível de detalhe área de 0,05 um. </li><li> Defina o limite de intensidade. New superfície cinzenta será exibida. Vá em &quot;Configurações&quot; e mude o estilo do &quot;ponto Center&quot; para &quot;Surface&quot;. </li><li> Vá até a aba estatística nas propriedades do objeto selecionado, selecione a guia detalhado e o suc valor específicoh como intensidade de fluorescência, volume, etc. </li><li> Analisar os dados e confirmar que os valores são compatíveis com as imagens. Por exemplo, dois ou mais grânulos adjacentes pode ser medido como um grânulo maior. Para quantificar o tamanho médio de grânulo de dividir o tamanho dos grânulos fundidos para o número real de grânulos. </li><li> Exportar os conjuntos de dados desejados para arquivos do Excel e analisar os dados. </li></ol> f

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The authors have no financial conflicts of interest.

Descrevemos uma estratégia inovadora que combina quantificação de MCs exocitose e quatro (x, y, z, t) quantificações de dimensão por imagiologia tridimensional tempo decorrido dos SGs em células vivas, utilizando um gene repórter para a exocitose. Esta técnica permite a triagem das famílias de proteínas para o seu impacto sobre a função MC como SGs de monitoramento a partir tão cedo quanto a sua saída do Golgi através de sua maturação, a aquisição de competências exocitose e degranulação. A combin...

Mastócitos (MC) são células imunes que são melhor conhecidas pelo seu envolvimento em reacções alérgicas e inflamatórias tais como artrite, asma, esofagite eosinofílica, dermatite crónica e choque anafilático 1,2 bem como outras patologias, incluindo doença da artéria coronária e 3,5 cancro 3,4. Além disso, MCs desempenham importantes papéis na imunidade inata e adaptativa, tanto na defesa do hospedeiro contra as bactérias e os parasitas e por supressão de respostas imunológicas, por exemplo, induzir tolerância do enxerto 5,6. MCs originam a partir da medula óssea, o desenvolvimento de células CD34 + / CD117 + células progenitoras pluripotentes 7. Medula óssea Committed progenitores MC são liberados na corrente sanguínea e migram para os tecidos periféricos que localizam predominantemente no interior de tecidos conjuntivos e superfícies epiteliais 8. Maturação e diferenciação terminal, eventualmente, são alcançados sob a influência of citocinas no meio circundante 8,9. MCs pode ser activado por um alergénio (antigénio, Ag), cujo encontro resultou na geração de imunoglobulina E (IgE) digite anticorpos. A ligação de IgE a receptores de tais FceRI do MC, seguido por ligação cruzada de IgE ligada à célula após re-exposição ao mesmo Ag, resulta em agregação FceRI e iniciação de uma cascata de sinalização que culmina na desgranulação celular [revisto em 10,11] . MCs também são ativadas, independentemente de IgE, por neuropeptídeos 5,12, toxinas 13, bacteriana e antígenos virais 14,15, uma série de peptídeos carregados positivamente colectivamente referidos como secretagogues básicos, células do sistema imunológico e citocinas 5,13,12,16 , 17. MCs também são activadas por muitos dos seus próprios mediadores libertados, que desenvolvem ainda mais a resposta inflamatória. MCs são embalados com grânulos de secreção (SGs) que contêm imunomediadores reguladoras, incluindo aminas vasoactivas, tais como histamina e serotonina (em roedores), proteoglicanos, proteases, tais como triptase e quimase, factor de crescimento endotelial vascular e várias citocinas e quimiocinas 8,9. Estes mediadores são &quot;pronto para ir&quot; e uma vez MCs são ativados por um estímulo adequado, esses mediadores são liberados das células por exocitose regulada (desgranulação) em questão de segundos a minutos 18,19. Este evento inicial é seguido pela síntese de novo e libertação de uma grande variedade de substâncias biologicamente potentes, incluindo metabolitos de ácido araquidónico, várias citocinas e quimiocinas 20,21,22. Lançamento de produtos recém-sintetizados ocorre independentemente da liberação SG. Coletivamente, esses mediadores iniciar precoces e fase tardia respostas inflamatórias e alérgicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos responsáveis ​​por ativação MC e degranulação são ambos de imp teórico e clínicoortance. A dificuldade de manipular geneticamente MCs primárias e cultivadas tem dificultado as tentativas para elucidar os mecanismos subjacentes MC degranulação, que continuou mal resolvidos. Para superar este problema foi desenvolvido um ensaio baseado repórter por co-transfecção da linha de células da mucosa do mastro, leucemia basofílica de rato (RBL) -2H3 (aqui referidos como RBL) ou da medula óssea derivadas MCs (BMMCs) 30 com um gene de interesse e O neuropeptídeo Y (NPY) fundido a RFP monomérica (MRFP), como um repórter SG. NPY foi anteriormente mostrado para recapitular o comportamento dos marcadores SG endógenos em outros sistemas. Além disso, porque MRFP fluorescência é insensível pH, a expressão do NPY-MRFP permite a visualização dos GV de ácidos, bem como a avaliação quantitativa de exocitose, utilizando placas de 96 poços e um leitor de placas de fluorescência. Mostrámos que o NPY-MRFP é entregue aos SGs ácidas de células RBL e BMMCs e é libertado a partir das célulasde uma forma regulada juntamente com a carga SG endógenos (isto é, β-hexosaminidase e serotonina) 30, 32. Este protocolo prevê uma metodologia baseada em imagens de alta resolução que permite que genes de triagem de interesse para a sua fenotípica e funcional impacto sobre as características de SG e desgranulação em células RBL 32. Especificamente, este protocolo permite o acompanhamento em tempo real do MC SG e quantificação da sua área ou tamanho do volume, o seu número, a cinética de montagem, o seu movimento ao longo do citoesqueleto da célula e a sua fusão definitiva com a membrana do plasma sob diferentes condições. Por exemplo, sensibilizar as células com DNP-IgE específica e desencadear as células com um Ag multivalente (DNP conjugado a albumina do soro) sob diferentes perturbações (isto é, o knockdown de genes de interesse, sobre a expressão de genes wt ou mutantes, ou manipulações farmacológicas) e comparação com células de controlo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

Mastócitos (MC) são células secretoras do sistema imunitário que realizam as suas funções fisiológicas e patológicas através da libertação de mediadores alérgicos, inflamatórios e imuno pré-formada e recém-sintetizadas. Mediadores MCs &#39;afetar vários tecidos e órgãos, culminando em respostas alérgicas e imunológicas. A síntese, armazenamento e liberação dos mediadores MC são altamente regulamentados. Os mediadores pré-formados são embalados em grânulos secretores citoplasmáticos (SG) que se fundem com a membrana plasmática e libertam o seu conteúdo por exocitose regulada. Apresenta-se um protocolo, com base na co-expressão de um gene de interesse com um gene repórter que está voltado para as SG e é libertada de um modo regulado com os mediadores de SG endógenos. O protocolo permite alta resolução quatro confocal dimensional análises do MC GV e monitorização da sua linha do tempo a partir de biogênese a exocitose disparada. Assim, usando esse protocolo para a triagem de genes entreest por sua fenotípica e funcional impacto permite decifrar os mecanismos moleculares que governam a biogênese e exocitose do MC GV e identificar os reguladores envolvidos. Assim, devem ser fornecidos mais insights sobre os mecanismos celulares que respondem por função MCs na saúde e na doença.

Devido à baixa eficiência de transfecção de MCs, as manipulações genéticas são susceptíveis de deixar um impacto sobre as leituras de secreção média medidos por mediadores endógenos SGs. No entanto, mediante o estabelecimento de co-expressão completa do gene repórter NPY-MRFP e o plasmídeo de co-transfectados nas mesmas células, a monitorização dos resultados NPY-MRFP exclusivamente no controlo da população de células que expressa o gene de interesse. Portanto, a vantagem deste ensaio em comparaç?...

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K visualizações.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor. 

Vídeo: Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

A visualização não-lítica exocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

Imunofluorescência de rotulagem dupla usando anticorpos da mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.