We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

1. Geração e Validação de Quimeras proteína fluorescente <ol><li> Acrescente proteína fluorescente verde (GFP) para o grupo amino ou carboxilo da proteína de interesse, utilizando as estratégias de ADN recombinante, convencionais 13. NOTA: Embora tenhamos GFP usado extensivamente, outras variantes, tais como a proteína fluorescente ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (YFP), DsRed mCherry e podem ser empregues. Melhorias na fluorophore dobrar eficiência, brilho e fotoestabilidade estão sendo feitas constantemente, e os investigadores devem valer-se das últimas construções geração. <ol><li> Confirmar sequência de ADN correcta e assegurar que a porção da GFP é em grelha com a proteína de interesse. Execute sequenciamento utilizando estratégias convencionais de DNA recombinante 21. NOTA: Muitas instituições têm instalações de DNA do núcleo, que o investigador é encorajado a contactar para obter informações adicionais. </li><li> Para proteínas de membrana passe simples ou duplas, gerarambas as versões de terminal amino e carboxilo das proteínas de fusão 19. </li><li> Para as proteínas de multi-GFP abrangendo inserir dentro de laços extramembrane putativos, assim como os terminais. Tomar cuidado especial quando gerar quimeras transmembranares com a proteína de fusão fluorescente ligado ao terminal amino da proteína alvo como sequências de sinal são muitas vezes clivado por proteólise, uma vez que a proteína tenha passado através do translocon ER. </li><li> No caso de sequências de sinal existentes, inserir a proteína de fusão fluorescente distai ao local de clivagem de modo a gerar uma proteína madura contendo uma proteína fluorescente marcado intacta amino-terminal. Empregam estratégias de ADN recombinante padrão para a geração de quimeras 21. </li></ol></li><li> Determinar a presença do sinal fluorescente apropriadamente localizada suficiente na linha celular de interesse. <ol><li> Observe as células sob microscopia de epifluorescência utilizando a fluorescência intrínseca da GFP sob aprocomi filtro definir condições. Para conjuntos de filtros de GFP que englobam 510-560 nm, confirmar que os filtros de correcção são utilizados para o fluoróforo utilizado. NOTA: Um sinal suficiente é alcançada quando a avaliação a olho fornece um sinal forte o suficiente para que a estrutura celular dentro do qual o sinal reside é facilmente resolvido acima do fundo. Além disso, o padrão de coloração da proteína GFP deve ser consistente com a de marcadores para o organelo adequado, e de preferência idêntica à da proteína nativa não marcada. </li></ol></li><li> Determinar se uma abordagem transfecção estável ou transitória será utilizado com base na proteína que está sendo avaliada. NOTA: Os transfectantes estáveis ​​geralmente pagar menores níveis de expressão do que os sistemas transientes. Embora a expressão transitória produz expressão de nível elevado de proteínas e aumento da intensidade de sinal (~ 5-24 horas após a transfecção, dependendo da proteína), mas também pode levar a artefactos, tais como sobre-expressão da proteína aggregation ou saturação da proteína alvo vias, levando a localização subcelular errônea. </li></ol> 2. transfecção de células e Cultura de Células NOTA: Uma variedade de células são passíveis de análise FPP, incluindo Hek293, HeLa, COS-7 e células CHO 14. A descrição a seguir baseia-se na expressão de proteínas de membrana em células Hek293. <ol><li> Crescer as células embrionárias de rim humano (Hek293) como monocamadas aderentes em 6 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com soro a 5% de bovino fetal (FBS), piruvato de sódio a 1%, e 250 ug / ml de penicilina / estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO 2. Realizar todos os trabalhos com células em um fluxo laminar de cultura de tecidos capô. Cultivar células em meio de cultura até ~ 80% confluentes em um frasco T-75. </li><li> Células transfecção usando qualquer padrão de elevada eficiência, baixo método de transfecção de toxicidade, incluindo lipídeos, tecnologias viral- ou à base de eletroporação para gerar transient ou expressão estável. Tipicamente de 2 ug de DNA de plasmídeo por 1 x 10 6 células proporciona uma boa expressão de proteínas reprodutível. Manter células para 5-48 horas em meio de cultura de tecido apropriado, a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 capaz de cultura de tecidos. </li><li> Monitorar células para expressão da proteína de fusão GFP-usando microscopia de epifluorescência, utilizando o sinal de fluorescência intrínseca da GFP, utilizando conjuntos de filtros adequados de acordo com o protocolo do fabricante. Sinal de fluorescência geralmente atinge um máximo dentro de 24-72 horas após a transfecção. Use células quando o sinal de fluorescência atinge um nível máximo. Monitorizar os níveis de expressão de proteína por análise de imunotransferência utilizando anticorpos dirigidos quer contra a proteína de interesse ou a porção da GFP. </li><li> Para células da placa análise experimentais sobre lamelas revestidas. Ver ou sob uma configuração de células vivas ou após fixação e montagem em lâminas de microscopia. Células da placa para atingir 60% -80% de confluência no período de 24-48 h. <ol><li> Lamelas de revestimento com solução de poli-lisina (0,1 mg / ml), de modo que toda a superfície é coberta. Incubar durante 30 min sob uma luz ultra violeta à temperatura ambiente, seguido de 60 min numa incubadora de cultura de células a 37 ° C. Retire o excesso de poli-lisina e lavar as lamelas em PBS 3 vezes. </li><li> Como alternativa, a chapa células em uma tampa de vidro câmaras que consiste em placas de cultura de célula com um fundo de vidro óptico para permitir imagens diretas com os objetivos de imersão em óleo. A verdadeira configuração microscopia depende do equipamento disponível para o investigador, mas deve ser capaz de mudanças rápidas da solução. Dependendo da forma do tipo de célula e de células, as células devem ser cerca de 60-90% confluentes no momento do ensaio FPP. </li></ol></li></ol> Setup 3. microscopia de fluorescência <ol><li> Use um objetivo de imersão em óleo de alta abertura numérica (NA) para a coleta de sinal máximo e resolução espacial, como um 60X, 1,42 NA objetivo de imersão em óleo. Use the seguindo lasers para estimular os fluorophores: gás Argon 488 nm (GFP e YFP) e 561 de diodo (RFP, mCherry). </li><li> Determine a taxa de exposição, ganho e captura ideal de imagens para cada construção. Ajuste intensidade do laser e tempo de exposição para minimizar a fotodegradação (veja o passo 7.1.2). </li><li> Para os estudos que utilizam múltiplos fluorophores (por exemplo, um marcador solúvel para permeabilização da membrana em conjunto com um marcador de proteína de membrana), escolha os filtros utilizados para minimizar o sinal de cross-talk e maximizar a relação sinal-ruído. </li></ol> 4. Estabelecer as condições ideais para Plasma Membrane Permeabilização <ol><li> Remover o meio de cultura celular a partir de células expressando apenas proteínas fluorescentes solúveis (por exemplo EGFP, DsRed). Lavam-se as células 3 vezes (1 min cada) em tampão de KHM (acetato de potássio 110 mM, 3 mM de MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Realizar experiências com células e todos os reagentes à temperatura ambiente. </li><li> Coloque células Sn lamelas (veja o passo 2.4) em tampão KHM em um palco microscópio de fluorescência e recolher a primeira imagem, que representa o controle do estágio de &quot;não-permeabilizadas &#39;. </li><li> Para selectivamente permeabilizar a membrana plasmática, adicionar digitonina (30 uM) em tampão de KHM para as células. Perfundir células com tampão (tampão de digitonina +) a um caudal de 5 ml / min durante 10-60 seg. </li><li> Determinar a concentração óptima de digitonina, aumentando gradualmente a concentração de digitonina. A concentração óptima de digitonina é alcançado quando ocorre perda completa do sinal de fluorescência de EGFP solúvel dentro de 10-60 segundos de aplicação de digitonina. Para muitas células aplicação de 10-50 uM de digitonina é suficiente para permeabilizar a membrana celular. <ol><li> Para todos os aplicativos usam a menor concentração possível de digitonina. Coletar imagens após Digitonina permeabilização para sinal de fundo permeabilizada. </li></ol></li><li> Confirme se a quimera GFP-proteína de interesse é na membranagrados confirmando retenção celular do sinal de fluorescência após a permeabilização digitonina da membrana plasmática 16. <ol><li> Expressar uma proteína fluorescente organela específica 23. Proteínas mitocondriais funcionar bem neste aspecto de 16, por exemplo, pDsRed2-Mito vector. Determinar as condições óptimas de expressão, tal como descrito na etapa 2.1. </li><li> Confirmar que a concentração de digitonina é apropriado para o tipo de célula utilizado, assegurando que a morfologia das organelas intracelulares permanece constante ao longo (até 60 minutos) a exposição prolongada a digitonina. NOTA: Use protocolos de microscopia de imunofluorescência utilizando anticorpos padrão contra vários compartimentos celulares, tais como lisossomas (por exemplo, LAMP1), de Golgi (por exemplo, TGN38), retículo endoplasmático (por exemplo, calnexina), endossomas (por exemplo, Rab5), mitocôndria (por exemplo, o citocromo c). Se organela intracelular mudanças morfologia / integridade dramaticamente over 60 min, é provável que a concentração de digitonina era demasiado elevada, e requer uma diminuição na concentração de digitonina e / ou tempo de exposição. NOTA: Digitonin é tóxico por inalação e contato com a pele. Use equipamento de proteção individual (EPI). </li></ol></li></ol> 5. Tratamento de Protease Proteínas Fluorescentes <ol><li> Lavam-se as células em tampão de KHM e, em seguida, adicionar a protease (proteinase K; 50 ug / ml em tampão de KHM) directamente para as células. Perfundir células a uma taxa de fluxo de 5 ml / min utilizando um sistema de perfusão alimentada por gravidade para o banho continuamente preparação. <ol><li> Armazenar as soluções em seringas de 50 ml e um tubo de polietileno ligado reservatórios independentes para um colector com uma única saída na banheira (taxa de fluxo de 5 ml / min). A posição de uma pipeta de sucção para manter um constante (0,5 ml) e volume do banho atingir troca da solução de comutação manual entre reservatórios de perfusão. </li></ol></li><li> Coletar imagens para determinar se o fluorsinal escent persistir ou se degradar. Uma perda de&gt; 90% da intensidade de sinal inicial ao longo de 30-60 seg é consistente com a degradação proteolítica da proteína quimera-GFP (ver Resultados representativos). </li><li> Se nenhuma degradação do sinal é observado com proteinase K, quando essa perda é antecipada, substituir a solução de proteinase K com tripsina (4-8 mM) em tampão de KHM. Se necessário, utilizar uma mistura de proteinase K e tripsina. Não há necessidade para extinguir a actividade da protease. </li></ol> 6. abordagem alternativa para Plasma Proteínas de Membrana com domínios externos <ol><li> Para as proteínas de membrana de plasma, para realizar o ensaio de proteínas fluorescentes externos quimeras antes de digitonina permeabilização. Lavam-se as células em lamelas em tampão de KHM (5 ml / min x 3 min), e tomar uma imagem para o tratamento de pré-protease e quantificar sinal de fluorescência pré-protease tal como no Passo 7. </li><li> Expor as células de protease (proteinase K; 50 ug / mL ou tripsina 4-8 mM em tampão de KHM) em tele ausência de digitonina em perfundir as células com meio contendo a protease KHM (taxa de fluxo de 5 ml / min). Coletar imagens da proteína fluorescente, para determinar a rapidez com que o sinal desaparece ou quanto tempo o sinal persiste. </li><li> Antes de permeabilização de digitonina, extingue toda a actividade de protease, por lavagem das células três vezes (1 min cada) em meios de cultura celular contendo 10% de soro (FBS). </li><li> Lavam-se as células com tampão de perfusão por KHM (taxa de fluxo de 5 ml / min) durante 2 minutos. Adquirir uma imagem de pré-permeabilização. Permeabilizar a membrana da célula, tal como descrito no Passo 4. </li><li> Coletar imagens seguintes disso protease como descrito na Etapa 5. </li></ol> Análise 7. Imagem <ol><li> Usar um microscópio invertido capaz de &quot;célula viva&quot; de gravação, em que a perda de sinal de fluorescência podem ser monitorizadas em tempo real. Para o monitoramento contínuo, empregam parâmetros idênticos (tempo de exposição, ganho de intensidade laser, etc.). <ol><li> Determine experparâmetros imental observando o sinal de fluorescência da GFP-proteína de interesse em condições de controle (ou seja, KBH tampão sozinho). Ajuste as configurações de tempo de ganho, de intensidade do laser e de exposição sobre o microscópio orientada por computador para garantir que não há perda significativa de intensidade de sinal ao longo de um período de 10-20 min. NOTA: A intensidade de sinal não é um valor absoluto, mas baseia-se no sistema de microscópio e configurações disponíveis para cada PI. Monitorar mudanças na intensidade de fluorescência relativa. </li></ol></li><li> Alternativamente, o tratamento de células em conjunto pontos temporais em digitonina seguido de protease, e corrigir as células antes da montagem em lamelas de imagiologia. Determinar pontos de tempo empiricamente seguindo os procedimentos nas etapas 4 e 5. Para a investigação inicial, começam em 0, 30, 60, 120 e 300 além sec cargo de digitonina ou protease. <ol><li> Fix células (20 min) à temperatura ambiente utilizando uma quantidade suficiente de fixador (3,7% de paraformaldeído em PBS) para submergir inteiramente thcélulas e. </li><li> Extingue-se paraformaldeído residual lavando as células com PBS contendo 20 mM de glicina (3 x 5 min). </li><li> Montagem de lamelas, removendo o excesso de líquido da lamela e invertendo a lamela em meios de montagem 50 mL em uma lâmina para a criação de imagens. Permitir slides para secar durante a noite antes de imagem. </li></ol></li><li> Recolhe imagens de microscopia de fluorescência (sob os conjuntos de filtros adequados compatíveis com o fluoróforo ser utilizada), utilizando a função de captação de imagem de vídeo em um computador controlado microscópio de fluorescência. </li><li> Quantificar intensidades do sinal de fluorescência como uma função da condição de incubação. Obter a média de intensidade de pixel dentro de uma região de interesse (ROI) que inclui uma célula individual. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

A orientação correta e topologia de proteínas de membrana é essencial para o seu funcionamento adequado. Apesar da importância de compreender topologia proteína de membrana, existem muitas proteínas para as quais os dados são completamente inexistentes. FPP proporciona uma maneira fácil e eficaz de determinar a topologia de proteína de membrana, e uma que pode ser executado pela maioria dos laboratórios. A abordagem FPP oferece vantagens significativas em relação aos métodos anteriores para determinar a to...

As membranas de plasma, bem como as numerosas membranas intracelulares, servem como barreiras que separam dois compartimentos aquosos. No caso da membrana do plasma, a separação é entre o exterior e o interior da célula; para organelos intracelulares é entre o citoplasma e o lúmen de organelos. Por exemplo, a membrana do retículo endoplasmático (ER) separa um ambiente oxidante no interior do lúmen do ER de um ambiente redutor citosólica 1. As proteínas da membrana são sintetizadas nos ribossomos associados-ER, e alcançar sua topologia final dentro da membrana ER 2. A aquisição de orientação e topologia de membrana apropriado para proteínas é crítico para a sua função normal. Topologia correcta permite domínios relevantes de proteínas de membrana para interagir com os seus parceiros de ligação, que permite que as modificações pós-traducionais críticos para ocorrer, e, no caso de proteínas de membrana de plasma, permite que a célula interagir com e responder to seu meio ambiente. Para apreciar a função de uma proteína de membrana, é manifesta a necessidade de saber que a proteína é orientada em relação à membrana no interior da qual reside, ou seja, a sua topologia de membrana. Além disso a aquisição de conhecimentos científicos básicos, compreendendo a topologia de uma proteína de membrana e que aspectos da superfície de uma proteína são expostos a ambientes diferentes marcou implicações clínicas, uma vez as proteínas da membrana são a maioria dos alvos farmacológicos 3. Até recentemente, abordagens para determinar topologia proteína de membrana têm exigido um investimento considerável de tempo e dinheiro ou ter exigido reagentes que são difíceis de encontrar. Ambas abordagens experimentais e in silico foram empregues para determinar a topologia de membrana de proteínas residentes no interior da membrana plasmática. Desde as primeiras previsões de membrana que mede domínios com base na hidrofobicidade avaliada de indiviaminoácidos dupla 3, inúmeros algoritmos de previsão estão agora disponíveis na internet, e simplesmente exigem o conhecimento da seqüência de aminoácidos da proteína. No entanto, as hipóteses são muitas vezes central para tais programas de modelagem, premissas que podem levar a atribuições incorretas de topologia de 4,5. Além disso, embora estas previsões baseadas em computador pode atribuir provisoriamente membrana regiões que abrangem, eles não sempre determinar se o amino ou carboxi de proteínas estão no citoplasma, lumen organela ou exterior da célula. Mesmo com o aumento do poder computacional, e o uso de algoritmos de aprendizado de máquina 6, esses dados ainda é um modelo, e deve ser validada experimentalmente usando dados adquiridos. Determinação experimental direta de topologia membrana foi realizada por meio de painéis de anticorpos monoclonais com epitopos conhecidos distribuídos em toda a proteína, em que a avaliação da imunorreatividade foi feita antes e após a permeabilização celular. Esteabordagem requer um conjunto de anticorpos, que podem não estar disponíveis para a proteína de interesse. Uma estratégia alternativa é projectar tais como marcadores de epitopo myc ou de hemaglutinina (HA) em vários locais da proteína, novamente seguido de determinação da imunorreactividade antes e após a permeabilização da membrana. Além de marcas imunogênicas, etiquetas enzimáticas (incluindo fosfatase alcalina, β-galactosidase, β-lactamase ou) e de modificações químicas, como a digitalização de cisteína têm sido empregados para determinar a topologia de proteína de membrana 7,8. Um método adicional utilizado para mapeamento topológico de proteínas da membrana plasmática depende de uma abordagem um pouco diferente para marcadores de epitopo. Neste método, a sequência de marcador é a sequência de consenso de glicosilação ligada a N NXS / T. Uma vez que a glicosilação ocorre apenas quando uma tal sequência está presente no lúmen da via biossintética, a presença do marcador numa relação luminalum compartimento citosólico é facilmente observado como um deslocamento de massa em géis de SDS-PAGE. Tal abordagem foi aplicada ao canal iónico multispanning CFTR 9. Enquanto todas essas abordagens têm sido utilizados, é claro que todos eles exigem investimentos consideráveis ​​em biologia molecular para gerar e seqüenciar as construções múltiplas. Para determinar informações topológicas sobre proteínas transmembrana localizados dentro organelas intracelulares provou ser mais desafiador. A aplicação de tecnologias baseadas fluorescência no entanto, fez com que a determinação da topologia da membrana muito mais simples. A técnica de fluorescência bimolecular complementação (BiFC) baseia-se na interacção entre dois fragmentos não fluorescentes de uma proteína fluorescente, restaurando as propriedades fluorescentes de que a proteína de 10. Embora inicialmente descritos para determinar as interacções proteína-proteína in vivo 10, esta abordagem também foi utilizadapara determinar a topologia de proteína de membrana em células de plantas 11. No entanto, esta abordagem também é demorada, uma vez que requer a geração não só de proteínas de fusão com a proteína de interesse, mas também uma variedade de proteínas de fusão, dirigidos às citosol ou organelos lúmen, e requer o conhecimento de que membranas intracelular da proteína de interesse reside . Uma abordagem mais simples para determinar a topologia alternativa de proteína de membrana 12 tem sido descrita. O ensaio de Fluorescência Protease Protecção (FPP) requer a geração de uma proteína de fusão entre o GFP e o gene de interesse. A abordagem é baseada na acessibilidade relativa de proteases não específicas para a porção da GFP; dependendo se GFP é protegido contra a proteólise por residente no lúmen das organelas intracelulares ou está exposta a proteólise por estar presente no citosol. Assim, se a porção da GFP na proteína de interesse está virado para o citoplasma, que será exposto aa actividade da protease e o sinal de fluorescência perdido. Por outro lado, se a porção da GFP na proteína de interesse enfrenta um ambiente &quot;protegidos&quot; de protease (tais como o lúmen de Golgi), então o sinal de fluorescência irão persistir. Para permitir que as proteases para entrar na célula, mas não entrar compartimentos membranares intracelulares a ligação colesterol digitonina droga é usada. O colesterol é o esterol dominante em vertebrados, e é especificamente enriquecido em membrana plasmática em relação aos compartimentos intracelulares. A toxina glicósido, digitonina, é extraído a partir da planta Digitalis purpurea. Digitonina tem uma afinidade para as membranas ricas de colesterol, onde se leva a membrana selectiva permeabiliztion 14,16 (Figura 1). Além de permitir a saída de pequenos componentes citosólicos, permeabilização digitonina também permite a entrada de moléculas exógenas, tais como a proteinase K ou tripsina. O protocolo FPP aproveita o fact que a membrana plasmática contém até 80% de colesterol celular 17, ao passo que outros organelos, tais como o ER, Golgi, endossomas, mitocôndrias, que têm muito baixo teor de colesterol, 14 permanecem intactos. A incorporação selectiva do colesterol pela membrana de plasma tem sido observada em muitas células eucariotas, permitindo a utilização de permeabilização da membrana do plasma dependentes de digitonina em diversas espécies eucarióticas tais como S. cerevisiae para humano 14,18. O ensaio de FPP proporciona um meio simples, rápido e relativamente robustos de determinar (a) se uma proteína ligada à membrana é / ou associados livremente difusivel no citosol e (b) que domínio de uma proteína de membrana enfrenta o citosol ou organelos lúmen. No caso de uma proteína da membrana tem múltiplas orientações, o sinal vai surgir a partir da forma dominante e formas menores não serão detectados. Embora possa haver alguma preocupação de que a adição de uma porção de GFP para a proteína de interesse pode afectar a sua função e/ Ou localização subcelular, este é, na verdade, mais teórica do que real. Com efeito, muitos estudos mostraram claramente que o tag de GFP não alterar as propriedades da proteína 19,20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="370">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:111px;">Name</td>
			<td style="width:80px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cav1-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td align="right">44433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAcGFP-1 Golgi</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">632464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polylysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>cS704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

A permeabilização da membrana plasmática Permeabilização da membrana plasmática eficiente é determinada pela utilização de proteínas fluorescentes solúveis (por exemplo, GFP, DsRed) (Passo 4). Estas proteínas, quando expressa nas células, são livres de se difundir no citosol, e são perdidos quando a membrana plasmática é permeabilizadas utilizando digitonina (Figura 2). Um completo desaparecimento do sinal fluorescente deve ocorrer dentro d...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.6K visualizações.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.