We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

형광 단백질 키메라 1. 생성 및 검증 <ol><li> 표준 재조합 DNA 전략 (13)를 사용하여 관심의 대상이되는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 추가. 참고 : 우리가 광범위하게 GFP를 사용하고 있지만, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP)와 같은 다른 변종 DsRed의 및 mCherry가 이용 될 수있다. 형광 접는 효율성, 밝기와 광 안정성의 개선이 지속적으로 이루어지고 있으며, 연구자들은 최신 구조의 자신을 소용합니다. <ol><li> 정확한 DNA 서열을 확인하고 GFP 부분이 관심의 단백질과 프레임에 있는지 확인하십시오. 표준 재조합 DNA 전략 (21)를 사용하여 시퀀싱을 수행합니다. 참고 : 많은 기관이 조사가 추가 정보를 문의 권장 핵심 DNA 시설을 가지고있다. </li><li> 단일 또는 이중 패스 막 단백질의 경우, 생성융합 단백질 (19)의 아미노 및 카르 복실 단말기 버전 모두. </li><li> 다중 스패닝 단백질 추정 extramembrane 루프 내에서 GFP뿐만 아니라 말단를 삽입합니다. 단백질은 ER에 translocon 통과 한 후에 신호 서열은 종종 단백질 분해에 의해 절단 될 때 목적 단백질의 아미노 말단에 부착 된 형광 융합 단백질 트랜스 키메라를 생성 할 때 특히주의. </li><li> 그대로 아미노 - 말단 태그 형광 단백질을 함유하는 성숙한 단백질을 생성하도록 현존하는 신호 계열의 경우, 절단 부위에 형광 융합 단백질 말단을 삽입한다. 키메라 (21)의 생성을위한 표준 재조합 DNA 전략을 사용한다. </li></ol></li><li> 관심 세포주 충분한 적절히 국부 형광 신호의 존재를 결정. <ol><li> appropri에서 GFP의 고유 형광을 이용하여 표면 형광 현미경 하에서 세포를 관찰필터 설정 조건을 먹었다. 510-560 nm의를 포함 GFP 필터 세트의 경우, 올바른 필터가 사용되는 형광체에 사용되는 것을 확인합니다. 참고 : 눈에 의한 평가는 신호가 상주하는 내 세포 구조가 쉽게 배경 위에 해결되었는지 충분히 강한 신호를 제공 할 때 충분한 신호를 얻을 수있다. 또한 GFP 단백질의 염색 패턴은 적절한 세포 기관에 대한 마커의 것과 일치하고, 기본 태그가 지정되지 않은 단백질의 바람직 동일해야합니다. </li></ol></li><li> 안정적인 또는 일시 발현 방식이 단백질이 평가되고 기반으로 활용할지 여부를 결정합니다. 참고 : 안정 형질은 일반적으로 일시적인 시스템보다 표현의 낮은 수준을 감당할. 일시적 발현은 (단백질에 따라 5-24 시간 ~ 포스트 형질) 단백질 및 증가 된 신호 강도의 높은 수준의 발현을 얻을 수 있지만, 또한 단백질 등의 과발현 AGGR 인공물을 초래할 수잘못된 세포 내 현지화로 이어지는 egation 또는 단백질 대상 경로의 포화,. </li></ol> 세포와 세포 배양 2. 형질 참고 : 세포의 다양한 HEK293, 헬라, COS-7, CHO 세포 (14)를 포함하여, FPP 분석 의무가 있습니다. 다음의 설명은 HEK293 세포에서 막 단백질을 발현에 기초한다. <ol><li> 성장 인간 배아 신장 세포 (HEK293) 부착 단층 등의 6 개의 37 °에서 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 피루브산 나트륨 및 250 ㎍ / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글스 중간 (DMEM), ml의 5 % CO 2와 C. 층류 조직 문화 후드 세포와 모든 작업을 수행합니다. T-75 플라스크에서 80 % 컨 플루 언트 될 때까지 ~ 배지에서 세포를 성장한다. </li><li> transien를 생성하는 지질, 또는 일렉트로 viral- 기반 기술을 포함하는 임의의 표준 고효율, 낮은 독성의 형질 전환 방법을 사용하여 세포를 형질t 또는 안정 식입니다. 일반적으로 1 × 10 6 세포 당 플라스미드 DNA의 2 μg의 좋은 재현성 단백질 발현을 제공합니다. CO 2 할 수있는 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 적절한 조직 배양 배지에서 5-48 시간 동안 세포를 유지한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 적절한 필터 세트를 이용하여, 극한의 GFP 형광 신호를 이용하여, 표면 형광 현미경을 이용하여 GFP 융합 단백질의 발현을 위해 세포를 모니터한다. 형광 신호는 보통 다음 형질 감염 24-72 시간 이내에 최대에 도달한다. 형광 신호가 최대 레벨에 도달 할 때 셀을 사용한다. 관심있는 단백질 또는 GFP 잔기 하나에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석에 의한 단백질 발현 수준을 모니터링. </li><li> 코팅 된 커버에 실험 분석 판 세포하십시오. 라이브 셀 구성 또는 다음 고정에서 하나보고 현미경 슬라이드에 탑재합니다. 플레이트 세포는 24 ~ 48 시간 내에 60 % -80 %의 합류를 달성하기 위해. <ol><li> 전체 표면이 피복되도록 폴리 라이신 용액 (0.1 ㎎ / ㎖)으로 코팅 된 커버. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 60 분,이어서 실온에서 자외선 광 하에서 30 분 동안 인큐베이션. 초과 폴리 라이신을 제거하고 PBS 3 회에 커버 슬립을 씻어. </li><li> 대안 적으로, 오일 - 침지 목적과 직접 촬상 할 수 있도록 광학 유리 바닥이있는 세포 배양 플레이트로 구성된 챔버 커버 유리 셀을 접시. 실제 현미경 설정은 연구자가 사용할 수있는 장비에 따라 다르지만 빠른 솔루션을 변경 할 수 있어야한다. 세포 형태 및 세포 형태에 따라, 세포는 FPP 분석시의 주위 60-90% 합류이어야한다. </li></ol></li></ol> 3. 형광 현미경 설정 <ol><li> 이러한 60X, 1.42 NA 오일 침지 목적으로 최대 신호 수집 및 공간 해상도에 대한 높은 개구 수 (NA) 오일 침지 목표를 사용합니다. 일 사용전자 형광 물질을 자극하는 레이저를 다음과 아르곤 가스를 488 나노 미터 (GFP와 YFP) 및 561 다이오드 (RFP, mCherry을). </li><li> 각각의 구조에 대한 이미지의 최적의 노출, 이득 및 캡처 속도를 결정합니다. (단계 7.1.2 참조) photobleaching에 최소화하기 위해 레이저 강도와 노출 시간을 조정합니다. </li><li> (예를 들면, 세포막 단백질 마커와 협동하여 막 투과성으로 대 수용성 마커), 적절한 필터를 선택할 여러 형광 물질을 이용하여 연구를위한 신호 크로스 토크를 최소화하고 신호대 잡음비를 최대화하도록 설정한다. </li></ol> 4. 플라즈마 막 투과성으로 최적 조건을 설정 <ol><li> (예 EGFP DsRed의) 전용 수용성 형광 단백질을 발현하는 세포로부터 세포 배양 배지를 제거한다. KHM 버퍼 셀을 3 회 (각각 1 분)을 워시 (110 mM 아세트산 칼륨, 3 mM의 MgCl 2, 20 mM의 HEPES-NaOH를, pH가 7.2). 실온에서 세포 실험과 모든 시약을 수행합니다. </li><li> 장소 세포 오N, 커버 슬립 형광 현미경 스테이지 KHM 버퍼 (단계 2.4 참조), 제어 &#39;비 - 투과 가능&#39;단계를 나타내는 첫 번째 이미지를 수집한다. </li><li> 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하려면, 세포 KHM 디기 토닌 완충액 (30 μM)을 첨가. 10-60 초 동안 5 ㎖ / min의 속도 완충액 (+ 디기 토닌 완충액)로 세포를 관류. </li><li> 서서히 토닌의 농도를 증가시킴으로써 최적 토닌 농도를 측정. 디기 토닌 애플리케이션 10-60 초 이내에 용해 EGFP에서 형광 신호의 완전한 손실이있을 때 최적 토닌 농도가 달성된다. 많은 세포 10-50 μM의 디기 토닌의 적용은 세포막을 Permeabilize 하시려면하기에 충분하다. <ol><li> 모든 응용 프로그램은 디기 토닌의 가장 낮은 농도를 사용합니다. 투과 가능 배경 신호에 대해 투과성으로를 토닌 후 이미지를 수집합니다. </li></ol></li><li> 관심의 GFP 단백질 키메라는 막에 있는지 확인세포막 투과성으로 디기 토닌 (16)의 다음의 형광 신호의 세포 유지를 확인함으로써 tegrated. <ol><li> 세포 소기관 특정 형광 단백질 (23)을 표현한다. 미토콘드리아 단백질은 예를 들어, 이와 관련 16 일, pDsRed2 - 미토 벡터에서 잘 작동합니다. 2.1 단계에 설명 된대로 최적의 발현 상태를 확인합니다. </li><li> 세포 내 소기관의 형태가 토닌에 장시간 (60 분에) 노출을 일정하게 유지하는 토닌 농도를 확인하여 사용되는 세포 유형에 적합한 지 확인합니다. 참고 사항 : 리소좀 같은 다양한 세포 구획에 대한 항체를 사용하여 사용 표준 면역 형광 현미경 프로토콜 (예 LAMP1), 골지 (예 TGN38) 소포체 (예컨대, calnexin), 엔도 솜 (예 Rab5), 미토콘드리아 (예를 들면, 시토크롬 C). 세포 내 소기관의 형태 / 무결성 변경 극적으로 비켜 경우R 60 분, 그것은 토닌 농도가 너무 높았다 같으며 토닌 농도 및 / 또는 노출 시간의 감소를 필요로한다. 참고 : 토닌은 흡입 및 피부 접촉에 의해 독성. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 할 것. </li></ol></li></ol> 형광 단백질의 5. 단백질 분해 효소 처리 <ol><li> 단백질 분해 효소를 추가 한 후 (단백질 분해 효소 K를, KHM 버퍼에 50 ㎍ / ㎖) KHM 버퍼에있는 세포를 씻으 직접 세포에. 5 mL의 연속적 제조를 목욕 관류 중력 공급 시스템을 사용하여 / 분의 유속으로 세포를 관류. <ol><li> 50 ㎖ 주사기에 보관 솔루션과 폴리에틸렌 튜브 목욕 (5 ml / 분의 유량)에서 단일 출구 매니 폴드에 독립적 인 저수지를 연결. 상수 (0.5 mL) 중 조 볼륨을 유지하고 수동 저수지 관류 용액의 전환에 의해 교환을 달성하기 위해 흡인 피펫을 위치. </li></ol></li><li> 불소 여부를 결정하기 위해 이미지를 수집escent 신호가 지속되거나 저하. 30-60 초 이상 초기 신호 강도의&gt; 90 %의 손실이 GFP 단백질 키메라의 단백질 분해 열화와 일관성 (대표 결과 참조). </li><li> 신호 열화가 테 K 관찰되지 않는 경우, 이러한 손실이 예상되는 경우, 버퍼 내의 KHM 트립신 (4-8 mM)을 가진 테 K 솔루션을 대체. 필요한 경우, 프로 테이나 제 K 및 트립신의 혼합물을 이용한다. 프로테아제 활성을 해소 할 필요가 없다. </li></ol> 외부 도메인에 플라즈마 막 단백질 6. 대안 <ol><li> 세포막 단백질, 투과성으로 토닌을하기 전에 외부 형광 단백질 키메라에 대한 분석을 수행한다. KHM 버퍼 된 커버에 세포 (5 ml / 분 × 3 분) 세척 및 사전 단백질 분해 효소 처리에 대한 이미지를 촬영하고 7 단계로 사전 단백질 분해 효소 형광 신호를 정량화. </li><li> 프로테아제 세포를 노출 (단백질 분해 효소 K를 50 ㎍ / ㎖의 또는 mM의 KHM 버퍼에 4-8 트립신) t에KHM 매체 함유 프로테아제 (유량 5 ㎖ / 분)로 세포를 환류시켜두면 그 토닌의 부재. 신호가 사라지거나 얼마나 오랫동안 신호가 지속 얼마나 빨리 결정하기 위해, 형광 단백질의 이미지를 수집합니다. </li><li> 디기 토닌 투과성으로 전에, 10 %의 혈청 (FBS)을 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 세 번 (각각 1 분)을 세정함으로써, 모든 프로테아제 활성을 급냉. </li><li> 2 분 동안 KHM 완충액 (5 ㎖ / 분의 유량)으로 환류시켜두면 세포를 세척 하였다. 사전 투과성으로의 화상을 취득. 단계 4에 기재된 세포막 Permeabilize 하시려면. </li><li> 5 단계에 설명 된대로 프로테아제 또한 다음과 같은 이미지를 수집합니다. </li></ol> 7. 이미지 분석 <ol><li> 형광 신호의 손실은 실시간으로 모니터링 할 수있는 &quot;생균&quot;기록 가능한 도립 현미경을 사용한다. 지속적으로 모니터링 동일한 파라미터 (노출 시간, 게인, 레이저 강도 등)을 이용한다. <ol><li> EXPER 결정제어 조건 (즉, KBH 혼자 버퍼)에서 관심의 GFP 단백질의 형광 신호를 관찰하여 imental 매개 변수를 설정합니다. 10-20 분 동안의 신호 강도의 뚜렷한 손실이 없다는 것을 보장하기 위해 컴퓨터 - 기반 현미경 이득, 레이저 강도 및 노출 시간 설정을 조정한다. 주 : 신호 강도의 절대 값이 아니라, 각각의 PI 사용할 현미경 시스템과 설정에 기초한다. 상대 형광 강도의 변화를 모니터링합니다. </li></ol></li><li> 또한, 단백질 분해 효소에 의해 다음 토닌에 설정된 시간 지점에서 세포를 치료, 이전 이미징 된 커버에 장착에 세포를 고정합니다. 시점 경험적 4 단계와 초기 조사 제의 절차에 따라 결정, 디기 토닌 또는 프로테아제의 0, 30, 60, 120 및 300 초 후 첨가 시작한다. <ol><li> 세포 (실온에서 20 분간) 완벽 번째 잠기하는 고정액 충분한 양 (PBS에 3.7 % 파라 포름 알데히드)를 사용하여 해결전자 세포. </li><li> PBS 20 mM의 글리신 (3 × 5 분)를 함유하는 세포를 세척하여 잔여 파라 포름 알데히드를 켄칭. </li><li> 커버 슬립에서 물기를 제거하고 유리 현미경에 50 μl의 설치 매체에 커버 슬립을 반전하여 마운트 된 커버는 이미징 슬라이드. 슬라이드 영상 전에 밤새 건조하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 형광 현미경 이미지를 수집 컴퓨터 제어 형광 현미경 영상 캡쳐 기능을 사용함으로써 (아래에서 적절한 필터하면 형광 물질이 사용되고 호환 세트). </li><li> 배양 조건의 함수로서 형광 신호 세기를 정량화. 개별 셀을 둘러싸는이자 (ROI)의 영역 내의 평균 픽셀 강도를 구합니다. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

막 단백질의 정확한 방향 및 토폴로지들은 적절한 기능을 위해 필수적이다. 막 단백질 토폴로지 이해의 중요성에도 불구하고, 이러한 데이터가 완전히 결여되는 많은 단백질이있다. FPP는 쉽고 효율적인 세포막 단백질 토폴로지를 결정하는 단계로서, 대부분의 실험실에 의해 수행 될 수있는 하나를 제공한다. FPP 방식은 단백질 토폴로지를 결정하기위한 기존의 방법들에 비해 현저한 장점들을 제?...

세포막뿐 아니라 수많은 세포 막은, 수성 두 구획을 분리 장벽의 역할을한다. 세포막의 경우, 분리와 외부 셀의 안쪽이고; 세포 내 소기관 것은 세포질 소기관 루멘 사이이다. 예를 들어, 소포체 (ER) 멤브레인을 저감 한 환경 세포질에서 ER의 루멘 내 산화성 환경을 분리한다. 막 단백질은 ER-관련 리보솜에서 합성하고, ER 막 2 내에서 최종 토폴로지를 얻을 수있다. 단백질에 적합한 막 방향 및 토폴로지의 인수는 정상적인 기능을 위해 중요하다. 정확한 토폴로지가 결합 파트너와 상호 작용하는 세포막 단백질의 중요한 영역을 허용 그것은 중요한 번역 후 변형이 발생할 수 있고, 세포막 단백질의 경우, 세포와 상호 작용하고 t를 응답 할 수환경을 오. 완전히 세포막 단백질의 기능을 이해하려면 그 단백질이 존재하는 막 내, 즉, 그 막 토폴로지에 대해 배향되는 방법을 알고 명백히 필수적이다. 막 단백질은 약리학 타겟 (3)의 대부분을 포함 이후 단백질 표면의 양태는 다른 환경에 노출되는 세포막 단백질 어느의 토폴로지를 이해하는 기초 과학 기술의 취득 이외에 임상 적 의미를 표시하고있다. 최근까지, 시간과 비용에 상당한 투자를 필요거나 구하기 어려운 시약을 요구 한 막 단백질 토폴로지를 결정하는 접근한다. 두 실험과 인 실리코 접근법 세포막 내에 존재하는 단백질의 막 토폴로지를 결정하기 위해 사용되어왔다. INDIVI의 평가에 기초하여 소수성 멤브레인 스패닝 영역의 예측 제 보낸이중 아미노산 3 수많은 예측 알고리즘은 이제 인터넷에서 사용할 수 있으며, 단순히 단백질의 아미노산 서열에 대한 지식을 필요로한다. 그러나 가정은 종종 토폴로지 4,5의 잘못된 할당 될 수 있습니다와 같은 모델링 프로그램, 가정의 중심에 있습니다. 이러한 컴퓨터 기반의 예측이 잠정적으로 막에 걸쳐 영역을 할당 할 수 있지만 또한, 그들은 항상 아미노 또는 단백질의 카르복시 말단이 세포 기관 루멘 또는 셀의 외관, 세포질에 있는지 여부를 확인하지 않습니다. 계산 능력을 증가, 심지어 함께 기계 학습 알고리즘 (6), 이러한 데이터의 사용은 여전히 모델이고, 실험적으로 획득 된 데이터를 이용하여 검증되어야한다. 멤브레인 토폴로지 판정 직접 실험은 면역 반응성을 평가 전과 후에 세포 투과성으로 만들어졌다 단백질 걸쳐 분산 공지 에피토프와 모노클로 날 항체의 패널을 사용하여 수행되었다. 이접근법은 관심있는 단백질을 사용하지 못할 수도 항체들의 세트를 필요로한다. 또 다른 전략은 다시 이전과 막 투과성으로 후 면역 반응의 결정 뒤에 단백질에 걸쳐 다양한 위치에 myc의 또는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 같은 에피토프 태그를 엔지니어링하는 것입니다. 면역 원성 태그 이외에, 이러한 시스테인 스캐닝 화학적 변형 (β 갈 락토시다 아제, 알칼리 포스파타제, 또는 β의 마제 포함) 효소 태그는 모든 세포막 단백질 7,8 토폴로지를 결정하기 위해 사용되어왔다. 세포막 단백질의 위상 맵핑 채용 추가적인 방법 에피토프 태그와 약간 다른 접근 방법에 의존한다. 이 방법에서, 태그 서열은 N- 연결 글리코 실화 컨센서스 서열 NXS / T이다. 이러한 시퀀스는 생합성 경로, 내강 대에서 태그의 존재의 루멘에 존재하는 경우에만 발생 글리코 실화 때문에세포질 구획은 쉽게 SDS-PAGE 젤에 질량 변화로 관찰된다. 이러한 접근 방법은 이온 채널 multispanning CFTR 9에인가되었다. 이러한 모든 접근법들이 이용되었지만, 그것들은 모두가 생성 매니 폴드 구조를 서열에 분자 생물학에 상당한 투자를 필요로하는 것이 분명하다. 세포 내 소기관에 위치한 횡단 단백질에 대한 위상 정보를 확인하려면 더 많은 도전 것으로 입증되었습니다. 형광 기반 기술의 적용하지만, 멤브레인 토폴로지 많이 간단의 판정을했다. 이분자 형광 상보의 기술 (BiFC)가 해당 단백질 (10)의 형광 특성을 복원, 형광 단백질의 형광이 아닌 두 단편 사이의 상호 작용에 의존한다. 처음 10 생체 단백질 - 단백질 상호 작용을 결정하기 위해 설명되었지만,이 방법도 이용되고있다식물 세포 (11) 세포막 단백질 토폴로지를 결정한다. 그러나이 방법은 관심의 단백질뿐만 아니라 세포질 또는 세포 내 소기관 루멘 타겟팅 융합 단백질의 다양한 융합 단백질뿐만 아니라 생성을 필요로 시간 집약적이기도 한 관심에있는 세포 내에서는 단백질을 세포막되는 지식이 필요 . 막 단백질의 토폴로지를 결정하는 대안적인 접근법은 단순 12을 설명 하였다. 분석법, 형광 프로테아제 보호 (FPP)는 GFP 및 관심 유전자 간의 융합 단백질의 생성을 필요로한다. 접근법은 GFP 잔기에 비특이적 프로테아제의 상대 접근성에 기반; GFP 여​​부에 따라 세포 내 소기관의 루멘에 존재하여 단백질 분해로부터 보호 또는 세포질 내에 존재하는 단백질 분해 됨으로써 노출된다. 관심 단백질에 GFP 잔기 세포질을 향하게되면 따라서, 그것은에 노출 될프로테아제 활성 및 형광 신호는 손실. 관심 단백질에 GFP 잔기 (예 골지 내강으로) 환경에서 프로테아제 &#39;보호&#39;을 반대로 향하게되면, 다음 형광 신호는 계속된다. 프로테아제는 세포를 입력 할 수 있지만, 콜레스테롤 결합 토닌 약물이 사용되는 세포 내 세포막 구획을 입력하지 않을. 콜레스테롤은 척추 동물 스테롤 지배적이며, 구체적으로는 세포 내 구획에 대하여 세포막에서 농축된다. 배당체 독소, 디기 토닌은 공장 Digitalis 푸로부터 추출된다. 토닌은 (14, 16) (그림 1) permeabiliztion 선택적 막에 이르게 콜레스테롤이 풍부한 막에 친 화성을 ​​가지고 있습니다. 작은 세포질 성분의 출구 수있을뿐만 아니라, 디기 토닌 또한 투과성으로 단백질 분해 효소 K 또는 트립신과 같은 외인성 분자의 침입을 허용한다. FPP 프로토콜은 FAC 활용세포막은 ER 다른 소기관 반면, 골지체는 엔도 좀이 매우 낮은 콜레스테롤 함량을 가지고 미토콘드리아, 14 그대로 남아, 셀룰러 콜레스테롤 (17)의 80 %까지 포함 t. 세포막에 콜레스테롤의 선택적 혼입 S. 같은 다양한 종에서 진핵 토닌 의존적 세포막 투과성으로의 사용을 허용하는, 많은 진핵 세포에서 관찰되어왔다 인간 (14, 18)에 cerevisiae에. FPP 분석은 (a) 단백질은 막 결합 / 연관 또는 세포질과 세포막 단백질의 (b) 영역에서 자유롭게 확산 여부 세포질 또는 세포 내 소기관 루멘 대향 결정 간단 신속하고 매우 강력한 수단을 제공한다. 막 단백질은 여러 방향이 경우, 신호가 지배적 인 형태에서 발생하고 작은 형태가 감지되지 않습니다. 관심의 단백질 GFP 잔기의 첨가는 그 기능에 영향을 줄 수있는 얼마간의 관심이있을 수있는 반면 및/ 또는 세포 내 현지화,이 실제보다 실제로 더 이론이다. 실제로 많은 연구 명확 태그 GFP 단백질 (19, 20)의 특성을 변화하지 않는다는 것을 보여 주었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="370">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:111px;">Name</td>
			<td style="width:80px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cav1-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td align="right">44433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAcGFP-1 Golgi</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">632464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polylysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>cS704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

플라즈마 막 투과성으로 효율적인 세포막 투과성으로는 수용성 형광 단백질 (예 : GFP DsRed의) (단계 4)의 사용에 의해 결정된다. 이들 단백질은, 세포에서 발현 될 때, 세포질에서 자유롭게 확산 및 세포막은 (도 2)를 사용하여 투과 가능 토닌 경우 손실된다. 형광 신호의 완전한 소멸 토닌 응용 프로그램의 10 ~ 60 초 이내에 발생한다. 관심의 단백질이 ?...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.7K 조회수.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

연구

생물학

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FPP)