We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

Floresan Protein Kimeralar 1. Nesil ve Doğrulama <ol><li> Standart rekombinant DNA stratejileri 13 ile ilgili proteinin amino ya da karboksil uçları da yeşil floresan protein (GFP) ekleyin. NOT: Bu yaygın olarak GFP kullanılmış olsa da, bu mavi floresan proteinin (CFP), sarı floresan proteini (YFP) gibi diğer varyantlar DsRed ve MCherry kullanılabilecektir. Fluorofor katlama verimliliği, parlaklık ve fotostabilite gelişmeler sürekli olarak yapılıyor ve araştırmacılar yeni nesil yapıları kendilerini boşuna gerekir. <ol><li> Doğru DNA sekansına edin ve GFP grup, ilgi konusu proteini ile çerçeve içinde olduğundan emin olun. Standart rekombinant DNA stratejileri 21 kullanılarak sıralamayı yapın. NOT: Birçok kurum araştırmacı ek bilgi için irtibat için teşvik edilir çekirdek DNA imkanları var. </li><li> Tek ya da çift geçişli membran proteinleri için, oluşturmakfüzyon proteinlerinin 19 amino ve karboksil terminal versiyonları. </li><li> Çok kapsayan proteinler için varsayılan extramembrane döngüler içinde GFP gibi terminaline yerleştirin. Protein ER translokon geçtikten sonra sinyal diziler genellikle proteoliz ile ayrılmaktadır hedef proteinin amino terminaline bağlı floresan füzyon proteini ile transmembran kimeralar üreten özel bir dikkat. </li><li> Sağlam bir amino terminal etiketli floresan proteini içeren olgun bir proteini üretmek üzere kaybolmamış sinyal dizileri söz konusu olduğunda, yarılma sitesi floresan füzyon proteini distalinde yerleştirin. Kimeralarının 21 nesil için standart rekombinant DNA stratejileri istihdam. </li></ol></li><li> Ilgi hücre hattı yeterli uygun lokalize floresan sinyal varlığını belirler. <ol><li> ÖDENEK altında GFP içsel floresan kullanarak Epifloresans mikroskobu altında hücreleri gözlemleyinFiltre set koşulları yedik. 510-560 nm kapsayacak GFP filtre setleri için, doğru filtreler kullanılan fluorophore için kullanılan olduğunu doğrulamaktadır. NOT: gözle değerlendirme sinyali bulunduğu hücresel yapı kolayca arka plan üzerinde giderilmiş olduğunu yeterince güçlü bir sinyal sağlar zaman yeterli sinyal elde edilir. Buna ek olarak, GFP protein boyama modeli, uygun bir organele için işaretler ile tutarlı ve ana etiketlenmemiş proteinin ya da tercihen aynı olmalıdır. </li></ol></li><li> Bir sabit veya geçici transfeksiyon yaklaşımı proteini değerlendirilen dayalı kullanılacaktır belirleyin. NOT: Kararlı transfektanları genellikle geçici sistemlere göre daha ifade düzeyi düşük göze. Geçici ifade (proteine ​​bağlı olarak ~ 5-24 saat sonra transfeksiyon) protein ve artış sinyal yoğunluğunun yüksek düzeyde ekspresyonunu elde edilir, ancak, aynı zamanda, örneğin, protein AGGR gibi aşın eserler yol açabilirhatalı hücre içi lokalizasyonu giden egation veya protein hedefleme yollarının doygunluk,. </li></ol> Hücreler ve Hücre Kültürü 2. Transfeksiyon NOT: Birçok hücre, HEK293, HeLa, COS-7 ve CHO hücreleri 14 de dahil olmak üzere, FPP analizine tabi tutulabilirler. Aşağıdaki açıklama Hek293 hücreleri membran proteinleri ifade dayanmaktadır. <ol><li> Büyüme, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK293) uyumlu tekli katman olarak muhafaza 6 37 ° C&#39;de,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 sodyum piruvat ve 250 ug / ml penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM), ml % 5 CO2 ile soğutuldu. Laminer akış doku kültürü kaputu hücreleri ile tüm çalışmaları gerçekleştirin. T-75 balonuna% 80 konfluent ~ kadar kültür ortamı içinde büyür. </li><li> Transien oluşturmak için lipid, vira- veya elektroporasyon-tabanlı teknolojiler de dahil olmak üzere herhangi bir standart, yüksek verimlilik, düşük toksisite transfeksiyon yöntemi kullanılarak Transfect hücrelerit veya kalıcı tanımlama. Tipik olarak, 1 x 10 6 hücre başına plazmid DNA 2 ug tekrarlanabilir protein ifadesini sağlar. CO2 sahip doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de, uygun bir doku kültürü ortamı içinde 5-48 saat boyunca hücrelerin muhafaza edin. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak uygun bir filtre kümesi kullanılarak GFP iç floresan sinyali kullanılarak, epifloresans mikroskobu kullanılarak GFP füzyon proteininin sentezlenmesi için hücre izleyin. Floresan sinyali genellikle transfeksiyonunun takip 24-72 saat içinde maksimuma ulaşır. Floresans sinyali bir maksimum değere ulaştığı zaman hücreler kullanın. Ilgili proteinin ya da GFP kısmı ya karşı antikorlar kullanılarak immünolojik leke analiziyle protein ekspresyonu seviyesini takip edin. </li><li> Kaplanmış lamelleri deneysel analiz plaka hücreleri için. Canlı hücre yapılandırması veya aşağıdaki tespit altında ya görüntüle ve mikroskopi slaytlar monte. Plaka hücreler 24-48 saat içerisinde 60% -80% izdiham elde etmek için. <ol><li> Bütün yüzeyi kaplanana kadar poli-lizin çözeltisi (0.1 mg / ml) ile kaplayın lamelleri. 37 ° C&#39;de bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 60 dakika, ardından oda sıcaklığında bir mor ötesi ışık altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Aşırı poli-lisin çıkarın ve PBS 3 kez lamelleri durulayın. </li><li> Seçenek olarak ise, yağ daldırma hedefleri ile doğrudan görüntülenmesine olanak vermek üzere bir optik cam alt hücre kültürü plakaları kapsayan bir bölmeli kapak camı üzerine hücreler plaka. Gerçek mikroskopi kurulum araştırmacı mevcut ekipman bağlıdır, ancak hızlı çözüm değişiklikleri yeteneğine sahip olmalıdır. Hücre tipi ve hücre şekli ile ilgili olarak, hücreler, FPP deneyinde zamanında yaklaşık% 60-90 konfluent olmalıdır. </li></ol></li></ol> 3. Floresan Mikroskopi Kurulumu <ol><li> Böyle bir 60X, 1.42 NA immersiyon yağı hedefi olarak maksimum sinyal toplama ve uzamsal çözünürlük, yüksek bir sayısal diyafram (NA) yağ daldırma hedefi kullanın. Inci kullanıne fluorophores uyarmak için lazerler aşağıdaki: argon gazı 488 nm (GFP ve YFP) ve 561 diyot (RFP, mCherry). </li><li> Her yapı için görüntülerin optimal pozlama, kazanç ve yakalama oranını belirleyin. (Adım 7.1.2 bakınız) photobleaching en aza indirmek için lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlayın. </li><li> (Örneğin, bir membran proteini markeri ile uyum içinde membran geçirgenliği için çözünür bir belirteci), uygun bir filtre tercih birden florofor ile çalışmaları için sinyal yansesi en aza indirmek ve sinyal-gürültü oranı en üst düzeye ayarlar. </li></ol> 4. Plazma membran geçirgenliği için optimal şartları oluşturulması <ol><li> (Örneğin, EGFP DsRed), sadece çözünür floresan proteinleri eksprese eden hücrelerden elde edilen hücre kültür ortamı çıkarın. KHM tampon hücreleri, 3 kez (1 dk) yıkayın (110 mM potasyum asetat, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.2). Oda sıcaklığında hücreleri ile deneyler ve reaktifler yapın. </li><li> Yer hücreleri on lamelleri bir floresan mikroskop sahnede KHM tamponunda (adım 2.4) ve kontrol &#39;olmayan geçirgenleştirildi&#39; sahne temsil ilk görüntü, toplamak. </li><li> Seçici olarak, plazma membran geçirgenliği için, hücrelere KHM tamponu digitonin (30 uM) ilave edin. 10-60 saniye için 5 ml / dakikalık bir hızla tampon (tampon + digitonin) ile hücrelerin serpmek. </li><li> Yavaş yavaş digitonin konsantrasyonu artırarak optimum digitonin konsantrasyonunu belirlemek. dijitonin uygulama 10-60 saniye içinde çözünen EGFP floresan sinyalinin tamamen kaybı olduğunda uygun dijitonin konsantrasyon elde edilir. Birçok hücre için 10-50 uM digitonin uygulama hücre membran geçirgenliği için yeterli değildir. <ol><li> Için tüm uygulamalar digitonin mümkün olan en düşük konsantrasyon kullanın. Permeabilize arka plan sinyali için geçirgenliği digitonin sonra görüntü Toplama. </li></ol></li><li> Ilgi GFP proteini kimera zar olduğunu doğrulayınplazma zarı 16 digitonin permeabilization aşağıdaki floresan sinyalinin hücresel tutma onaylayarak bütünleşmiş. <ol><li> Bir organel özel floresan proteini 23 Express. Mitokondriyal proteinler, örneğin bu bağlamda 16, pDsRed2-Mito vektör iyi çalışır. Adım 2.1 açıklandığı gibi uygun ifade koşullarını belirleyin. </li><li> Hücre içi organellerin morfoloji digitonin için uzun süreli (60 dk) maruz boyunca sabit kalmasını digitonin konsantrasyon sağlayarak istihdam hücre tipi için uygun olduğundan emin olun. NOT: Bu tür lizozomlardan gibi çeşitli hücresel bölmeleri karşı antikorlar kullanarak Kullanım standart immunofloresan mikroskopi protokolleri, (örneğin, LAMP1), Golgi (örneğin, TGN38), endoplazmik retikulum (örneğin, calnexin), endozomlar (örneğin, Rab5), mitokondri (örn, sitokrom c) işlendi. Hücre içi organel morfolojisi / bütünlük değişiklikleri dramatik ove iser, 60 dakika, bu dijitonin konsantrasyonu çok yüksek olduğu muhtemeldir ve dijitonin konsantrasyonu ve / veya maruz kalma süresinde bir azalma gereklidir. NOT: Digitonin Teneffüs ve cilt ile temasında toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin. </li></ol></li></ol> Floresan Protein 5. Proteaz İle Muamele <ol><li> Proteaz ekleyin (proteinaz K; KHM tamponu içinde 50 ug / ml) KHM tampon hücreleri yıkanır ve doğrudan hücreler üzerine. 5 ml sürekli hazırlama banyosu yerçekimi vasıtasıyla beslenmesini perfüzyon sistemi kullanılarak / dakikalık bir akış hızında hücreleri serpmek. <ol><li> 50 ml &#39;lik şırıngaya saklayın çözeltiler ve polietilen boru banyosu (5 ml / dk akış oranı) tek bir çıkış ile bir manifolda bağımsız rezervuar bağlı. Sabit (0.5 mi) banyo hacmi korumak ve el ile perfüzyon rezervuar arasında geçiş yaparak çözelti değişimi elde etmek için bir emme pipet yerleştirin. </li></ol></li><li> Flor belirlemek için görüntüleri toplayınescent sinyal devam ederse veya alçaltır. 30-60 saniye boyunca ilk sinyal yoğunluğunun&gt;% 90 bir kayıp GFP proteini kimera proteolitik bozulması ile tutarlıdır (Örnek Sonuçlar bakınız). </li><li> Hiçbir sinyal bozulması proteinaz K ile görülürse, bu tür kayıp beklenen zaman, KHM tamponunda tripsin (4-8 mM) ile proteinaz K çözümü değiştirin. Gerekirse, proteinaz K, tripsin bir karışımını kullanmaktadır. Proteaz aktivitesini bastırmak için bir ihtiyaç vardır. </li></ol> Dış Etki Plazma Membran Proteinleri 6. Alternatif Yaklaşım <ol><li> Plazma membran proteinleri için, geçirgenliği digitonin önce dış floresan proteinleri kimeralar için tahlil yapmak. KHM tamponu lamelleri hücreleri (5 mi / dakika x 3 dakika) yıkanır, ve ön-proteaz tedavisi için bir görüntü ve Aşama 7&#39;deki gibi ön-proteaz floresan sinyalini ölçmek. </li><li> Proteaz hücreleri Açığa (proteinaz K, 50 ug / ml veya mM KHM tamponunda 4-8 tripsin) tKHM ortam ihtiva eden bir proteaz (akış hızı 5 ml / dak) ile hücrelerin perfüze digitonin arasında da yokluğu. Sinyal kaybolur ya da ne kadar sinyal devam nasıl hızlı bir şekilde belirlemek için, floresan protein görüntüleri toplayın. </li><li> Dijitonin geçirgenliği önce,% 10 serum (FBS) ihtiva eden hücre kültür ortamı içinde hücreleri üç kez (1 dk) yıkayarak, bunların hepsi proteaz etkinliğe söndürün. </li><li> 2 dakika boyunca KHM tamponu (5 ml / dk akış oranı) ile perfüze hücreleri yıkayın. Bir ön-permeabilizasyon görüntü elde. Aşama 4&#39;te tarif edildiği gibi, hücre membran geçirgenliği. </li><li> Aşama 5&#39;te tarif edildiği gibi proteaz ilave edildikten sonra görüntü Toplama. </li></ol> 7. Görüntü Analizi <ol><li> Flüoresan sinyal kaybı gerçek zamanlı olarak izlenmesini mümkün kılan &quot;canlı hücre&quot; kayıt kapasitesine sahip bir ters mikroskop kullanın. Sürekli izleme için, aynı parametreler (pozlama süresi, kazanç, lazer yoğunluğu, vb) kullanır. <ol><li> Exper belirleyinKontrol koşulları altında (yani, KBH sadece tampon) altında ilgi GFP protein floresan sinyalini gözlemlenerek imental parametreleri. 10-20 dakikalık bir süre boyunca sinyal yoğunluğu kayda değer kaybı olmasını sağlamak için bilgisayar odaklı mikroskop kazanç, lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlarını ayarlayın. NOT: Sinyal yoğunluğu bir mutlak değer değil, ama her PI mevcut mikroskop sistemi ve ayarlar dayanmaktadır. Nispi flüoresan yoğunluğundaki değişiklik izler. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, proteaz tarafından takip digitonin set zaman noktalarında hücreleri tedavi ve önceki görüntüleme için lamelleri montaj hücreleri düzeltmek. Zaman noktaları ampirik adım 4 ve ilk soruşturma için 5. prosedürleri takip belirleyin, digitonin veya proteaz 0, 30, 60, 120 ve 300 sn sonrası ek başlayacak. <ol><li> Hücreleri (oda sıcaklığında 20 dakika) tam th daldırmak için sabitleyici yeterli bir miktarını (PBS içerisinde% 3.7 paraformaldehit) kullanarak saptamakE hücreler. </li><li> PBS, 20 mM glisin ile (3 x 5 dk) içeren hücrelerin durulanarak artık paraformaldehid söndürüldü. </li><li> Lamel fazla sıvıyı çıkarılması ve bir cam mikroskop 50 ul montaj ortamına lamel tersini Mount lamelleri görüntüleme için slaytlar. Slaytlar görüntüleme gecede önce kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Floresan mikroskop görüntüleri toplayın bilgisayar kontrollü floresan mikroskop video görüntü yakalama işlevini kullanarak (uygun filtreler altında flüoroforun kullanılan uyumlu setleri). </li><li> İnkübasyon durumunun bir fonksiyonu olarak flüoresan sinyal yoğunluklarını ölçmek. Tek bir hücreyi çevreleyen faiz (ROI) bir bölgede ortalama piksel yoğunluğu edinin. </li></ol>

<ol>
	<li>Sevier, C. S., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+transfer+of+disulphide+bonds+in+living+cells.">Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).</li><li>Brodsky, J. L., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum:+Recent+lessons+from+yeast+and+mammalian+cell+systems.">Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems.</a> Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+displaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.</a> J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Ott, C. M., Lingappa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+protein+biosynthesis:+why+topology+is+hard+to+predict.">Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict.</a> J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).</li><li>Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topological+analysis+of+integral+cytoplasmic+membrane+proteins.">The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins.</a> The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).</li><li>Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+transmembrane+alpha-helices+in+prokaryotic+membrane+proteins:+the+dense+alignment+surface+method.">Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method.</a> Protein Eng. 10, 673-676 (1997).</li><li>Geest, M., Lolkema, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+topology+and+insertion+of+membrane+proteins:+search+for+topogenic+signals.">Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).</li><li>Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+topology+mapping+by+the+substituted+cysteine+accessibility+method+(SCAM(TM)):+application+to+lipid-specific+membrane+protein+topogenesis.">Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis.</a> Methods. 36, 148-171 (2005).</li><li>Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+membrane+topology+by+glycosylation+site+insertion.">Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion.</a> J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Zamyatnin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells.">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li><li>Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+protease+protection+of+GFP+chimeras+to+reveal+protein+topology+and+subcellular+localization.">Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization.</a> Nat Methods. 3, 205-210 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+you+know+the+sex+of+your+cells?+American+journal+of+physiology.">Do you know the sex of your cells? American journal of physiology.</a> Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).</li><li>Wang, H., Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transmembrane+Ser/Thr+kinase+complexes+with+protein+phosphatase-1+and+inhibitor-2.">A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2.</a> J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).</li><li>Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+protease+protection+reveals+the+topology+of+the+integral+membrane+protein+Lemur+Tyrosine+Kinase+2+(LMTK2).">Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2).</a> Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).</li><li>Tagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+trafficking+of+caveolar+domains+in+the+cell:+caveolae+as+stable,+cargo-triggered,+vesicular+transporters.">Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters.</a> J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues.">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells.">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Curr Biol. 5, 635-642 (1995).</li><li>Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+phenotyping+of+secretory+and+nuclear+prion+proteins+associated+with+inherited+prion+diseases.">Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases.</a> J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).</li><li>Ben-Gedalya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin-A-induced+prion+protein+aggresomes+are+dynamic+quality-control+cellular+compartments.">Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments.</a> J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).</li><li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+of+the+Syrian+hamster+prion+protein+utilizing+chimeric+and+mutant+genes+in+a+vaccinia+virus+expression+system.">Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.</a> J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).</li><li>Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+mislocalization+of+a+tail-anchored+GFP+redefines+the+identity+of+peroxisomal+ER.">Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER.</a> Traffic. 4, 491-501 (2003).</li><li>Brandee, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+and+degradation+of+human+P23H-Rhodopsin-GFP+in+knockin+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa.">Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

Membran proteinlerinin doğru yönlendirme ve topoloji bunların uygun fonksiyonu için gereklidir. Membran proteini topoloji anlama önemine rağmen, bu veriler tamamen yoksun olduğu için birçok protein vardır. SOP kolay ve verimli bir membran proteini topoloji belirleme şekli ve en laboratuvarlar tarafından yapılabilir bir sağlar. FPP yaklaşımı, protein topoloji belirlemek için önceki yöntemlere göre önemli avantajlar tanıyor. Örnek olarak, ilgili 31 proteinin tekrar çeşitli etki yönlen...

plazma zarları, yanı sıra çok sayıda hücre içi zarlar, iki sulu bölmelerini ayıran engel olarak hizmet vermektedir. Plazma membranı durumunda, ayırma dış tarafı arasında ve hücrenin içinde olduğu; hücre içi organellere için sitoplazma ve organel lümen arasında. Örneğin, endoplazmik retikulum (ER) membran ortamı 1 azaltıcı sitozolik ER lümeninde bir oksitleyici ortam ayırır. Zar proteinleri, ER-bağlantılı, ribozomlar üzerinde sentezlendiği ve ER zar 2 içinde son topoloji elde edilir. proteinler için uygun membran yönelim ve topoloji edinimi normal fonksiyonu için önemlidir. Doğru topolojisi bağlanma partnerleri ile etkileşim zar proteinlerinin uygun etki sağlayan, kritik post-translasyonel modifikasyonlar meydana sağlar ve plazma zar proteinleri durumunda, hücre ile karşılıklı etkileşim ve t yanıt sağlarçevresini o. Tam bir membran proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için, bu protein, bulunduğu olan membran, örneğin, zar topolojisine göre yönlendirilmiştir nasıl açıkça şarttır. Membran proteinleri farmakolojik hedefler 3 çoğunluğunu oluşturan bu yana bir protein yüzey yönleri farklı ortamlara maruz kalan bir membran proteini ve hangi topoloji anlamak temel bilimsel bilginin edinimi, ek olarak klinik etkileri işaretlenmiş. Yakın zamana kadar, zaman ve para önemli yatırım gerektirmiştir veya gelmek zor olan reaktifler gerektirmiştir membran proteini topoloji belirleme yaklaşımları. Hem deneysel ve silico yaklaşımlar plazma zarı içinde bulunan proteinlerin membran topolojisini belirlemek için kullanılmıştır. Bireyler değerlendirilir hidrofobisitesine göre membranlı etki ilk tahminleri yanaÇift amino asitler 3, çok sayıda öngörü algoritmalar artık internette mevcuttur ve sadece proteinin amino asit dizisinin bilgisi gerektirir. Ancak, varsayımlar genellikle topoloji 4,5 yanlış atamaları neden böyle modelleme programları, varsayımlara merkezi vardır. Bu bilgisayar tabanlı tahminler geçici zar kapsayan bölgeleri atayabilirsiniz Dahası, onlar her zaman amino ya da proteinlerin karboksi terminali organel lümen veya hücre dış, sitoplazmasında olup olmadığını belirlemek değil. Hesaplama gücü artmış, ve hatta makine-öğrenme algoritmaları 6, bu tür verilerin kullanımı hala bir modeldir ve deneysel elde edilen veriler kullanılarak valide edilmelidir. Membran topoloji doğrudan deneysel belirlenmesi onların imünoreaktivitenin değerlendirilmesi öncesi ve hücre geçirgenleştirmeden sonra yapılmış protein, dağılmış bilinen epitoplarıyla monoklonal antikor panelleri kullanılarak üstlenilmiştir. Buyaklaşım ilgili protein için mevcut olmayabilir antikorlar, bir dizi gereklidir. Alternatif bir strateji yeniden öncesi ve membran geçirgenleştirmeden sonra imünoreaktivite belirlenmesi ardından protein boyunca çeşitli yerlerde, içine myc veya hemagglutinin (HA) gibi epitop etiketleri mühendisi olduğunu. Imünojenik etiketleri ek olarak, ve bu sistein tarama gibi kimyasal değişiklikler (alkalin fosfataz, P-galaktosidaz β, β-laktamaz ya da dahil olmak üzere), enzimatik etiketler, tüm zar proteini topoloji 7,8 belirlemek için kullanılmıştır. Plazma zar proteinlerinin topolojik haritalaması için kullanılan bir başka yöntem de epitop etiketleri için biraz farklı bir yaklaşıma dayanmaktadır. Bu yöntemde etiket dizisi N-bağlantılı glikosilasyon konsensüs sekansı NXS / T&#39;dir. Bu tür bir sekans biyosentetik yolun bir luminal karşı etiketin varlığının lümeninde var olduğunda glikosilasyon yalnızca oluşur yanasitozolik bölmesi kolayca SDS-PAGE jelleri üzerinde bir kitle vardiya olarak görülmektedir. Böyle bir yaklaşım, multispanning iyon kanalının CFTR 9 uygulanmıştır. Tüm bu yaklaşımlar kullanılmıştır olmakla birlikte, bunların hepsi oluşturmak ve çeşitli yapıları sıralamak için moleküler biyoloji önemli yatırımlar gerektiren açıktır. Hücre içi organellere içinde bulunan zar proteinleri ile ilgili topolojik bilgileri belirlemek için daha zor olduğu kanıtlanmıştır. floresan tabanlı teknolojilerin uygulanması, ancak zar topoloji çok basit belirlenmesi yaptı. bimoleküler floresan komplementasyon tekniği (BiFC) o proteinin 10 floresan özelliklerinin korunması, bir fluoresan proteininin iki floresan olmayan fragmanlar arasında etkileşimine dayanmaktadır. Ilk olarak, in vivo 10 protein-protein etkileşimlerini belirlemek için tarif edilmiş olmasına rağmen, bu yaklaşım aynı zamanda kullanılmıştırBitki hücrelerinde 11 zar proteini topolojisini tespit etmek. Bununla birlikte, bu yaklaşım, ilgili protein, aynı zamanda sitosol veya organel lümenine hedeflenen füzyon proteinlerinin çeşitli füzyon proteinlerinin sadece oluşumunu da gerektirir gibi yoğun süresi de, ve ilgi bulunan hücre içi protein membranlar olan bilgi gerektirir . Zar proteini topoloji olarak belirlemenin bir alternatifi daha basit bir yaklaşım 12 tarif edilmiştir. Deney, Fluoresans Proteaz koruma (FPP), GFP ve ilgili gen arasındaki bir füzyon proteini üretilmesini gerektirir. yaklaşım GFP kısmı için spesifik olmayan proteazlar nispi erişilebilirlik üzerine dayanmaktadır; olup GFP bağlı olarak hücre içi organellerin lümeninde bulunan ile proteoliz tarafından korunduğu veya sitoplazmada mevcut olan vasıtasıyla proteolize maruz kalmaktadır. Ilgilenilen proteinin GFP kısmı sitoplazma dönük Böylece, eğer, bu maruz kalacağıproteaz aktivitesi ve floresan sinyali kaybetti. Ilgi protein GFP kısmı (örneğin Golgi lümen gibi) proteazm bir ortam &#39;korumalı&#39; karşı karşıya Tersine, daha sonra floresan sinyali devam edecektir. Proteazlar hücreye girmesine izin, ancak kolesterol bağlayıcı ilaç digitonin kullanılan hücre içi membran bölmeleri girmek değil. Kolesterol omurgalıların baskın steroldür ve özellikle hücre içi bölümlere göre plazma membranında zenginleştirilmiştir. glikozit toksini, dijitonin, bitki Digitalis purpurea&#39;nın elde edilir. Digitonin&#39;dir bu 14,16 (Şekil 1) permeabiliztion seçici membran neden kolesterol açısından zengin zarlar için afinitesi vardır. Küçük sitosolik bileşenlerin çıkış sağlayan ek olarak, dijitonin geçirgenleştirme, aynı zamanda, proteinaz K ya da tripsin gibi eksojen moleküllerin girişini mümkün kılar. FPP protokol fac yararlanırPlazma membranı, ER gibi diğer organellere, oysa, golgi endozomlarda, çok düşük bir kolesterol içeriği vardır mitokondri, 14 olduğu gibi kalır, hücresel kolesterolün 17% 80 kadar ihtiva t. plazma zarının kolesterolün seçici dahil S. gibi çeşitli ökaryotik türlerde dijitonin bağımlı plazma membran geçirgenliği kullanımını sağlayan, çok sayıda ökaryotik hücrelerde gözlenmiştir İnsan 14,18 ile cerevisiae. FPP deneyi (a) proteini zara bağlı / ilgili veya sitosol ve membran proteini, (b) etki serbestçe nüfuz olup sitosol veya organel lümeni yüzler belirlemek için bir basit, hızlı ve oldukça sağlam bir araç sağlar. Bir zar proteini birden yönelimleri varsa, sinyal baskın biçimde ortaya çıkacak ve minör form tespit edilmez. Ilgi proteine ​​GFP kısmının eklenmesi işlevini etkileyebilir ki bazı endişeler olabilir iken ve/ Veya hücre içi lokalizasyonu, bu gerçek aslında daha teorik. Gerçekten de birçok çalışmalar net bir şekilde GFP etiket protein 19,20 özelliklerini değiştirmediğini göstermiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="370">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:111px;">Name</td>
			<td style="width:80px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cav1-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td align="right">44433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAcGFP-1 Golgi</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">632464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polylysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>cS704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Plazma Membran Permeabilization Etkin plazma membran geçirgenleştirilmesi çözünür floresan protein (örneğin, GFP, DsRed) (Basamak 4) kullanılması ile tespit edilir. Bu proteinler, hücrelerde ifade edildiğinde, sitozol içinde dağıtmak için serbesttir ve plazma membranı (Şekil 2) digitonin ile geçirgenleştirildi zaman kaybolur. Floresan sinyalinin bir tamamen yok dijitonin uygulama 10-60 saniye içinde gerçekleşmelidir. Ilgili protein, h...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP at JoVE.com

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.6K Görüntüleme.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

Video: Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Biyoloji

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.