Os ovos de galinha GFP fertilizados foram fornecidos pela Prof. Helen Sang, o Instituto Roslin e a Universidade de Edimburgo, Reino Unido. O Roslin Transgenic Chicken Facility é financiado pelo Wellcome Trust e pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BBSRC). O trabalho foi parcialmente financiado, e nt apoiado, por Great Ormond Street Hospital Children's Charity, Londres, Reino Unido. Os autores agradecem a Ben Jevans, do Instituto de Saúde infantil da UCL, pela ajuda na preparação de embriões para enxerto.

1. Preparação de Micro-bisturi para ablações de tubos neurais
<ol><li>Modele um micro-bisturi a partir de uma agulha de costura de aço comercialmente disponível.<ol>
<li>Primeiro achate a agulha em ambos os lados usando uma roda de moagem montada em um moedor de banco alimentado.</li>
		<li>Comece a moldar o bisturi, primeiro em uma pedra grosseira do Arkansas usando um movimento circular controlado, em direções alternativas, em ambos os lados da agulha.</li>
		<li>Continue os mesmos movimentos de afiação em uma pedra arkansas de grau extra fino para moldar um micro-bisturi ultra fino, com uma borda de corte bem definida(Figura 1A, B). NOTA: Alternativas ao micro-bisturi podem ser agulhas eletroliticamente afiadas, agulhas de tungstênio comercialmente disponíveis ou agulhas de vidro puxadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Incubar ovos selvagens e gfp para o estágio desejado
<ol><li>Armazene ovos de galinha fertilizados e ovos de galinha GFP transgênicos em uma incubadora resfriada a 14 - 15 °C antes da incubação à medida que o desenvolvimento é interrompido a esta temperatura. Guarde ovos por alguns dias, até uma semana.</li>
	<li>Para iniciar o desenvolvimento, coloque ovos de tipo selvagem e GFP em uma bandeja horizontalmente e incubar simultaneamente em umidificado (58 - 60%) incubadora a 37,5 ºC, de modo que os embriões estão em estágios correspondentes para enxerto de tubo neural.</li>
	<li>Para obter embriões no estágio de desenvolvimento de 10 a 12 somites para a realização do enxerto de tubo neural vagal, incubar ovos por 1,5 dias (33 - 38 horas) e embriões de estágio de acordo com as tabelas de desenvolvimento de Hamburger e Hamilton21.</li>
</ol>3. Prepare ovos para janelas e enxertos
<ol><li>Mova um ovo de cada vez para um suporte de ovos feito sob medida para janelas. Faça um pequeno furo na casca do ovo batendo repetidamente, com uma tesoura reta, na superfície superior da extremidade pontiaguda do ovo.</li>
	<li>Remova 2 - 3 ml de albumina do ovo com uma agulha hipodérmica de 181/2 G e 5 ml de seringa. A remoção da albumina abaixa a gema dentro do ovo e facilita a janela subsequente sem causar qualquer dano ao embrião.<ol>
<li>Descarte a albumina. Sele o orifício com uma pequena tira de fita clara cortada em tamanho com uma tesoura fina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando uma tesoura curva, bata outro orifício na superfície superior da casca do ovo. Insira a ponta da tesoura no orifício e, mantendo a tesoura paralela ao banco, trabalhe em um movimento circular para cortar uma janela de ~2 cm de diâmetro em cima da concha.<ol>
<li>Mantenha a tesoura em posição estacionária e gire o ovo. Descarte o disco removido da casca de ovo. Em E1.5, o embrião é reconhecível como um disco amarelo mais escuro em cima da gema.</li>
		<li>Remova os detritos da casca que caíram dentro do ovo usando pinças. Descarte quaisquer ovos não fertilizados (identificados por uma pequena mancha branca em cima da gema amarela clara).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Prepare o embrião hospedeiro para receber tecido enxertado
<ol><li>Ajuste o microscópio estéreo ao nível dos olhos e otimize a orientação da fonte de luz gooseneck para iluminar adequadamente o embrião sem causar reflexos.</li>
	<li>Para visualizar o embrião propriamente dito,injete uma pequena quantidade de tinta indiana sob o centro do disco amarelo mais escuro, usando um tubo bucal e uma micro-pipeta de vidro puxado(Figura 1C, Oii).<ol>
<li>Prepare a tinta 50:50 com PBS contendo Penicilina/Estreptomicina a 100 μg/ml de concentração final. Insira a micro-pipeta através da membrana da gema fora do perímetro da blastoderm e, em seguida, angeta cuidadosamente sua ponta diretamente abaixo do embrião.</li>
		<li>Entregue tinta debaixo do embrião soprando no tubo bucal. Se a pipetação bucal não for permitida, use uma seringa de 1 ml em vez disso. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar sob o embrião, que pode levar à contaminação, em seguida, remova cuidadosamente a micro-pipeta de vidro. Este é um passo delicado que pode levar à morte do embrião se não for feito com precisão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enseia o embrião por referência a Hamburger e Hamilton21 e grava o palco em um livro de laboratório.</li>
	<li>Usando um micro-bisturi feito sob medida (ou uma agulha de tungstênio fino) montado em um suporte de agulha, faça um corte muito pequeno na membrana vitelline, ao lado da área onde a microcirurgia será realizada.<ol>
<li>Aplique cuidadosamente 2 - 3 gotas de PBS sobre a ruptura da membrana (usando uma micro-pipeta de vidro e o tubo bucal) para criar espaço entre o embrião e a membrana. Corte uma janela maior na membrana para expor toda a região onde ocorrerá a microcirurgia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a região de interesse do tubo neural usando o micro-bisturi, começando com incisões transversais rostral e caudal em todo o tubo neural dorsal (ao nível de somite 1 a 7 no vídeo).<ol>
<li>Corte bilateralmente entre o tubo neural e os somitas para separar o tubo neural dos tecidos circundantes, sem danificar os somites.</li>
		<li>Muito gentilmente separe o tubo neural do notochord subjacente, que deve permanecer intacto. Note que a excisão do tubo neural bem sucedida deixará todos os tecidos circundantes perfeitamente intactos(Figura 2).</li>
		<li>Remova o tubo neural excisado aspirando-o em uma micro-pipeta de vidro, em seguida, descarte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regisso nível de ablação de tubo neural em um livro de laboratório. O embrião hospedeiro está pronto para receber o tubo neural do doador.</li>
</ol>5. Prepare o tecido do enxerto de doador
<ol><li>Selecione um embrião GFP com janelas e partidas de palco, visualizando sob um microscópio estéreo fluorescente com filtro FITC. A fluorescência GFP torna muito fácil visualizar os somites e encenar o embrião.</li>
	<li>Uma vez identificado um embrião compatível com o estágio, remova o embrião do ovo fazendo 4 incisões, com uma tesoura de mola Pascheff-Wolff(Figura 1C, l) em uma forma de retângulo ao redor do embrião e, em seguida, pegá-lo suavemente com uma colher de embrião.</li>
	<li>Coloque o embrião em um vidro de relógio quadrado com uma base de polímero sylgard. Agite suavemente o embrião com Dumont #5 pinças para remover qualquer gema presa. Remova a membrana vitelina e fixe o embrião na base do polímero usando pinos de minutien inoxidáveis(Figura 1C).</li>
	<li>Usando a Tesoura de Mola, faça 4 incisões em uma forma retangular ao redor do tubo neural e somitas circundantes, na mesma região que foi removida do embrião hospedeiro.</li>
	<li>Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira o tubo neural e os tecidos de somite do embrião GFP doador para um vidro de relógio contendo 0,2% de pancreatina em Pen/Strep PBS.</li>
	<li>Permita que a digestão enzimática prossiga por 10 minutos no RT para ajudar a separar os tecidos. Após a incubação em enzima, use pinos de minutien inoxidáveis montados em uma alça para separar manualmente o tubo neural de todos os tecidos adjacentes.</li>
	<li>Usando uma micro-pipeta de vidro, transfira o tubo neural dissociado para outro vidro de relógio contendo DMEM + 10% de soro (por exemplo,cabra, cavalo ou bezerro fetal) no gelo, para enxaguar o excesso de pancreatina e parar a digestão enzimática. Após 5 min, o tubo neural dissecado está pronto para ser enxertado ortotopicamente no hospedeiro filhote(Figura 2 e S1).</li>
</ol>6. Enxertar o tecido
<ol><li>Usando uma micro-pipeta de vidro, transfira cuidadosamente o tubo neural dissecado do vidro do relógio para o embrião hospedeiro. Posicione o tubo neural na orientação anterior-posterior correta e empurre suavemente a explanta adjacente à região excisada do hospedeiro do filhote usando o micro-bisturi. Deixe um pequeno fragmento de ectoderme ligado, ou cortando um pequeno corte na superfície dorsal para identificar a orientação do tubo neural.<ol>
<li>Se necessário, use o micro-bisturi para aparar a explanta ao tamanho exato da região excisada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Guie suavemente o tubo neural para a região ablada e posicione-o de tal forma que o lado dorsal seja corretamente orientado. Use uma micro-pipeta de vidro, montada em um tubo bucal, para remover PBS e/ou fluido ao redor do enxerto. Isso ajuda o doador e os tecidos de acolhimento a aderir e o enxerto a se estabelecer.</li>
	<li>Sele toda a janela com fita clara de 24 mm de largura para evitar desidratação e contaminação.</li>
	<li>Rotule o embrião quimérico marcando com um lápis na casca de ovo e grave seu número no livro de laboratório. Devolva o ovo à incubadora para maior desenvolvimento.</li>
</ol>7. Injete DII em vasos sanguíneos de embrião hospedeiro
<ol><li>No ponto de tempo experimental desejado (aqui, 3 - 10 dias depois), recupere o embrião quimérico da incubadora e remova a fita clara usando uma tesoura reta para ter acesso ao embrião dentro do ovo.</li>
	<li>Se necessário, amplie a janela da concha usando a tesoura. Tenha cuidado para não danificar a membrana corioallantónica se estiver presa à casca, o que resultaria em hemorragia e colocaria em risco a rotulagem dos vasos sanguíneos.</li>
	<li>Escolha uma veia acessível na gema certificando-se de que o fluxo sanguíneo seja direcionado para o embrião. Escolha um ponto de ramificação de uma das veias vitelline(Figura 3B, C). NOTA: Em E6.5 - E7.5, a membrana corioallantórica pode precisar ser suavemente movida de lado com pinças para acessar as veias da gema. Após o E8.5, a única opção é injetar em uma das veias de membrana corioallantóica, já que, por esta fase, a membrana corioallantóica cobre totalmente o embrião.</li>
	<li>Remova a membrana vitelline acima do ponto de injeção escolhido usando duas pinças Dumont #5 rasgando em direções opostas.</li>
	<li>Quebre uma agulha de vidro puxada usando um #5 Dumont e ajuste seu diâmetro para o tamanho aproximado da veia antes de carregar com CellTracker CM-DiI. Faça a solução de estoque DiI a 40 μg/μl em DMSO e armazene a -20 °C. Prepare a solução de trabalho em 0,3 M de sacarose/PBS a uma concentração de 4 μg/μl.<ol>
<li>Aspire entre 5 - 10 μl de DII em 0,3 M de sacarose/PBS na agulha usando sucção com um tubo bucal. Embriões mais velhos podem exigir até 25 μl ou mais. A partir de E8.5, os embriões têm veias maiores e mais musculares, que podem precisar ser mantidas em posição com um #5 Dumont antes de esfaquear com a agulha de vidro carregada de DII.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insira rapidamente a agulha na veia e sopre constantemente com o tubo bucal para permitir que o DII se junte ao fluxo sanguíneo lentamente sem formar um coágulo. Alternativamente, use um injetor de pressão para a entrega de DII.</li>
</ol>8. Colher embriões para secção ou exame de integral
<ol><li>Para reter o máximo de DII dentro do embrião possível, colde o embrião imediatamente após a injeção, recolhendo-o em uma colher perfurada e cortando os vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos com um par de tesouras retas, para libertar o embrião da gema.</li>
	<li>Remova quaisquer membranas soltas e disseque os órgãos de interesse (ou seja,os pulmões e o trato digestivo neste tutorial), tomando muito cuidado para não comprimir o tecido, o que cria difusão do DII. Fixar imediatamente os tecidos por imersão em 4% pfa por 1 - 2 horas na RT.</li>
	<li>Enxágüe o tecido por 5 min em PBS, depois 15 min em PBS contendo 5 μg/ml DAPI. Monte as amostras em um slide de microscópio ponte para exame de montagem inteiro ou incorpore-as para seção criobiósa.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método de enxerto de tubo neural intraespécie, combinado com a rotulagem dos vasos sanguíneos aqui descrito, aproveita ao máximo a facilidade de acesso do embrião aviário dentro do óvulo (comparado com outros embriões vertebrados) para estudar o co-desenvolvimento de um elemento do sistema nervoso autônomo (o ENS) e do sistema vascular.
Para rotular derivados NCC, o método de enxerto de subespécie de pintinhosGFP-chickque descrevemos tem uma série de vantagens sobre o método clássico de quimera de codorna que foi estabelecido há mais de 40 anos1-3. Primeiro, sob a luz FITC, a fluorescência GFP é extremamente brilhante, na medida em que as células GFP+ são facilmente discerníveis em embriões quiméricos vivos. Isso permite que o sucesso do enxerto seja verificado no ovo,enquanto o enxerto de codorna exige que o embrião seja morto, processado e imunossuído usando QCPN, antes que o sucesso do enxerto possa ser apurado2. Em segundo lugar, a expressão GFP no filhote transgênicoGFP é citoplasmática, portanto não apenas rotula corpos celulares, mas também permite que as projeções das células transplantadas sejam visualizadas22. Isso permite que redes neuronais intrincadas sejam observadas em alta resolução (observe que as projeções finas são melhor visualizadas quando a amostra é imunossuada com anticorpo anti-GFP). Como a rotulagem de QCPN é restrita ao núcleo da célula de codorna, tais redes não são reveladas usando quimeras de codorna. Em terceiro lugar, o enxerto de intraespécie elimina quaisquer diferenças potenciais de espécies entre as células dentro do embrião quimérico. Uma vez que os embriões de codorna têm um período de incubação menor do que o filhote (19 dias versus 21 dias) tem sido sugerido que as células de codorna têm uma taxa de proliferação maior do que as células-pintinhos, o que poderia afetar potencialmente o desenvolvimento dos tecidos quiméricos23. Curiosamente, também tem sido demonstrado em plantas que o enxerto interespécie poderia produzir alterações extensas nos padrões de metilação de DNA no hospedeiro 24. Em quarto lugar, oChick GFP facilita experimentos de transplante suplementar para abordar temas como destino NCC e comprometimento celular25. Em quinto lugar, o filhote transgênicoGFP também é útil para muitas outras técnicas, incluindo a triagem FACS de subpopulações celulares GFP+, cultura organotípica de órgãos contendo células GFP+, manipulação genética do tecido enxertado GFP+ através de eletroporação de plasmídeos de expressão26,e outras tecnologias de imagem, como a tomografia de projeção óptica27.
A abordagem de transplante de tubo neural pode ser modificada substituindo microsurgicamente quantidades mais curtas de tubo neural. Usando segmentos menores do tubo neural, a microcirurgia é potencialmente menos prejudicial ao embrião e a sobrevivência pode ser melhorada. No entanto, a desvantagem de transplantar menos tubo neural é que o número de GFP+ NCC no hospedeiro será reduzido. Os usuários poderiam tentar obter um equilíbrio entre a quantidade de tubo neural transplantado para dar a melhor sobrevida de embriões, e o número de GFP+ NCC dentro do intestino hospedeiro suficiente para dar resultados informativos.
Para a pintura de vasos, DiI tem a vantagem de que sua fluorescência é muito brilhante e robusta. Além disso, tem a capacidade de difundir durante a fixação garantindo a coloração dos melhores capilares abertos. Por ser um corante vital, os embriões podem sobreviver ao procedimento de injeção e continuar se desenvolvendo com um sistema vascular manchado (até 24 horas em nossas mãos, embora a coloração se torne mais pontual ao longo do tempo, ver Figura 3E). A combinação de enxertoGFP com pintura vascular dii é, portanto, compatível com imagens vivas. Além de todas essas vantagens, é importante notar que a injeção vascular só rotula vasos luminosos e, portanto, não identifica capilares não abertos, células de ponta endotelial ou células endoteliais isoladas. No entanto, novos progressos na transgênese aviária poderiam fornecer novas maneiras de contornar tais questões, como exemplificado por experimentos usando embriões de codorna Tg (tie1:H2B-eYFP) para estudar morfognese vascular28. Outra limitação dessa técnica é que, para uma rotulagem eficaz de vasos em embriões em E7.5 e além, maiores quantidades de corante precisam ser injetadas, o que pode tornar os experimentos caros. No entanto, uma modificação da técnica pode incluir rotulagem de vaso sanguíneo de baixo custo com tinta de destaque14,embora essa abordagem não tenha sido testada em nossas mãos.
As etapas críticas dos procedimentos incluem o processo de visualização do embrião injetando tinta sob o blastodisc. Se a membrana que cobre a gema for rasgada pela agulha cheia de tinta nesta fase, então a sobrevivência do embrião será severamente comprometida. Além disso, é importante, ao preparar um tubo neural doador, que o tecido não seja deixado por um tempo excessivamente longo em pancreatina (considere aproximadamente 10 min como um máximo). A exposição prolongada à pancreatina danifica o tecido e o tubo neural é então difícil de manusear e não incorporará bem no hospedeiro. Ganhar experiência da técnica de injeção dii em embriões do tipo selvagem é essencial antes de injetar embriões quiméricos, pois apenas uma tentativa de injeção é geralmente possível para cada embrião. O volume de DI E o diâmetro da agulha são parâmetros críticos para cada embrião e devem ser avaliados em tipo selvagem, controles combinados de estágio.
Em conclusão, nosso método de rotulagem dupla de transplante de tubos neurais e pintura de vasos dii em embriões de filhotes vivos pode ser usado para investigar as inter-relações entre ncc e redes de vasos sanguíneos durante a organogênese. Considerando que os mecanismos responsáveis por estabelecer a inervação e vascularização corretas durante o desenvolvimento dos órgãos ainda são amplamente desconhecidos, essa metodologia tem potencial para futuras descobertas nesse campo.

O embrião de frango é um organismo modelo inestimável na biologia do desenvolvimento de vertebrados, até porque seu desenvolvimento em ovo permite manipulações experimentais que são impossíveis de realizar em vertebrados que se desenvolvem no útero. Essa acessibilidade e facilidade de manipulações levou o embrião de pintinhos a desempenhar papéis-chave em muitas descobertas seminais no campo da biologia do desenvolvimento. Entre as técnicas mais poderosas tem sido o uso de embriões quiméricos de codorna para estudar o destino celular, método pioneiro pela professora Nicole Le Douarin na década de 19701-3. Em particular, quimeras de quail-chick têm sido especialmente úteis para marcar geneticamente e seguir populações de células de crista neural altamente migratórias (NCC) durante o desenvolvimento precoce. NCC é uma população multipotente de células migratórias, surgindo no ectoderme dorsal às margens do tubo neural, que dão origem a uma ampla gama de tipos celulares em todo o embrião vertebrado. Estes incluem estruturas craniofaciais (cartilagem, osso, músculos), neurônios e glia (nos sistemas nervosos sensorial e autônomo), melanócitos e subpopulação de células do sistema endócrino2,4,5. Um dos fatores mais importantes que influenciam o destino do NCC é sua localização inicial ao longo do eixo anterior-posterior do tubo neural. Por exemplo, o NCC entérico, que dá origem aos neurônios e à glia do sistema nervoso entérico (ENS), surge de duas subsu populações discretas: a primeira localizada na região do vagal (cérebro traseiro caudal) e a segunda na região sacral do tubo neural6-13. O enxerto inter ou intraespédicos das regiões correspondentes do tubo neural tem sido a técnica de escolha para rotular permanentemente essas células e, posteriormente, permitir o rastreamento, desde seu nascimento nas margens do tubo neural, até seus destinos finais dentro do trato digestivo6,7,10.
Outra manipulação embrionária mais fácil de realizar em filhotes, em comparação com outros modelos animais, é a rotulagem vital do sistema vascular. De fato, à medida que o embrião do filhote se desenvolve, ele fica em cima de uma rede vascular extraembrionária que circula oxigênio e nutrientes da gema. Esta rede vascular acessível, localizada na superfície da gema, pode ser usada como porta de entrada para rotular o sistema vascular em desenvolvimento do embrião durante a organogênese12,14-17. A injeção intravascular de vários corantes, como o corante lipofílico DiI, permite delinear/manchar todos os vasos luminosos da rede vascular nascente.
Como os órgãos em desenvolvimento precisam estar conectados tanto ao sistema nervoso (para controle sensorial e motor) quanto ao sistema vascular (para troca de gás, fluxo e fornecimento de nutrientes), as duas redes se desenvolvem lado a lado e compartilham semelhanças marcantes em sua arquiteturaramificada 18-20. Aqui relatamos manipulações embrionárias que nos permitem estudar o desenvolvimento simultâneo do ENS derivado do NCC, juntamente com o sistema vascular, durante a organogênese. Isso é conseguido através da geração de quimeras de frango através do transplante de segmentos discretos do tubo neural, incluindo a crista neural, combinada com a injeção vascular de DII. Como um avanço das quimeras de codorna-galinha, nosso método usa embriões transgênicos de filhotes de GFP para enxerto de subespécies, tornando a técnica de transplante mais poderosa, em termos de células de imagem e suas projeções, e eliminando qualquer viés potencial ligado às diferenças de espécies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="58">
			<td height="79" rowspan="2" style="height:80px;width:528px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:312px;">Company&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:320px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Fertilised chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">Henry Stewart and Co, Louth, UK</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">Fertilised GFP chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Egg incubator (Profi-H Hatcher)</td>
			<td>Lyon Technologies, CA, USA</td>
			<td style="width:320px;">910-033</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">14C Incubator</td>
			<td style="width:312px;">Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK</td>
			<td style="width:320px;">Model LT2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo-microscope&#160;</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">Model MZ 12.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">DC500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">IM50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Goose neck halogen cold light source</td>
			<td style="width:312px;">Advanced Imaging Concepts, Inc</td>
			<td>KL 1500 LCD&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">181&#8260;2 G hypodermic needle&#160;</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">HSWNH181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancreatin</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">P3292</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>D5030</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>G6767</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">5ml syringe</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z248010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Mouth tube</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">A5177</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in.</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">S6018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Transfer pipettes, polyethylene</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z350796&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>PY8 30-0035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holders (Nickel-plated pin holder)&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pascheff-Wolff Spring Scissors&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:320px;">15371-92</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>11251-30&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Minutien pins&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">26002-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11210-10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perforated spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10370-18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten needles (0.125mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10130-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sellotape (clear, 24mm width)</td>
			<td style="width:312px;">Any Supplier</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution</td>
			<td style="width:312px;">VWR international</td>
			<td>101447-068&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:312px;">Dow Corning</td>
			<td>S09 512 516</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pelikan black ink</td>
			<td style="width:312px;">Pelikan</td>
			<td>211-169</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">C-7001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Settings for glass needle puller&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller model P-86</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual labeling of neural crest cells and blood vessels within chicken embryos using chickgfp neural tube grafting and carbocyanine dye dii injection

Todos os órgãos em desenvolvimento precisam estar conectados tanto ao sistema nervoso (para controle sensorial e motor) quanto ao sistema vascular (para troca de gás, fluido e fornecimento de nutrientes). Consequentemente, tanto os sistemas nervosos quanto vasculares se desenvolvem lado a lado e compartilham semelhanças marcantes em sua arquitetura ramificada. Aqui relatamos manipulações embrionárias que nos permitem estudar o desenvolvimento simultâneo do tecido nervoso derivado da crista neural (neste caso o sistema nervoso entérico) e o sistema vascular. Isso é conseguido através da geração de quimeras de frango através do transplante de segmentos discretos do tubo neural, e crista neural associada, combinada com injeção de DII vascular no mesmo embrião. Nosso método usa embriõesGFP de filhotes transgênicos para enxerto de subespécies, tornando a técnica de transplante mais poderosa do que o protocolo clássico de enxerto interespécie de codorna usado com grande efeito desde a década de 1970. O enxerto intraespécie dopintinho-filhotefacilita a imagem de células transplantadas e suas projeções em tecidos intactos, e elimina qualquer viés potencial no desenvolvimento celular ligado às diferenças de espécies. Este método aproveita ao máximo a facilidade de acesso do embrião aviário (comparado com outros embriões vertebrados) para estudar o co-desenvolvimento do sistema nervoso entérico e do sistema vascular.

A Figura 1 mostra instrumentos típicos necessários para realizar isolamento microcirúrgico e transplante do tubo neural. A Figura 2 mostra o procedimento de transplante. Após transplante, os embriões são examinados para o sucesso do transplante. Isso envolve examinar o embrião sob um microscópio de fluorescência estéreo, tipicamente na manhã seguinte à microcirurgia, para a presença de NCC derivado do enxerto (GFP+). Se o transplante foi um sucesso, então o GFP+ NCC pode ser observado nas proximidades do tubo neural e nas vias migratórias precoces que levam ao foregut. Se o procedimento não tiver sido bem sucedido, o GFP+ NCC não será observado fora do tubo neural, ou se eles estiverem presentes no hospedeiro, eles podem estar em menor número. Estes embriões mal sucedidos são descartados. Normalmente, 5-8 transplantes de tubo neural são realizados em um dia, e destes 80% são bem sucedidos. As razões para o transplante de tubo neural mal sucedido incluem a morte do embrião devido a danos teciduais incorridos durante a microcirurgia, ou falha do tubo neural para se integrar ao embrião hospedeiro. Este último pode resultar da má colocação do tubo neural dentro do hospedeiro ou de um tubo neural de má qualidade devido à má técnica de dissecção ou da exposição excessiva à enzima dissociação. A etapa inicial de triagem, bem como exames posteriores semelhantes para células GFP+, é útil, pois significa que tempo e recursos não são desperdiçados pela realização de experimentos em embriões que não têm NCC rotulado por GFP dentro do intestino.
A Figura 3 mostra o procedimento para injeção dii dos vasos sanguíneos. A eficiência/sucesso da técnica de injeção dii depende: primeiro, cortar a agulha de injeção para o diâmetro ideal para a veia alvo, segundo um gesto preciso ao inserir a agulha na veia (para não perfurar pelo outro lado), e terceiro evitando que a agulha seja plugada durante a injeção soprando a uma taxa constante. Se algum desses três parâmetros for feito incorretamente, o embrião sangrará ou precisará de várias horas para se recuperar antes que uma segunda tentativa seja feita, pois a hemorragia torna quase impossível reinjetar imediatamente. Embriões bem sucedidos devem ser selecionados imediatamente visualizando sob um microscópio de estereofluorescência e devem ser dissecados rapidamente. Em embriões bem sucedidos, os vasos sanguíneos rotulados por DII estão presentes em todo o embrião (Figura 3C,D), incluindo leitos capilares(Figura 3D).
Após a colheita de embriões e exame de seções teciduais ou tratos gastrointestinais de toda adoeção, resultados típicos revelam que o GFP+ NCC dentro do ENS primitivo e a estrutura fina das redes de vasos sanguíneos rotulados por DiI(Figura 4) Preparações integrais podem ser examinadas por meio de microscopia confocal pela qual as pilhas de imagem produzem reconstruções tridimensionais (3D) mostrando as inter-relações entre as projeções finas das células GFP+ ENS e o sistema vascular manchado de DI(Figura 4 A-C; G-I; Vídeos 1 e 2).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig1.jpg"> Figura 1. Instrumentos de microcirurgia recomendados. (A) micro-bisturi em forma de agulha de costura. (B) pedra fina do Arkansas para moldar um micro-bisturi. (C) a) tesoura reta, b) tesoura curva, c) seringa de 5 ml com agulha hipodérmica de 181/2 G, d) pipeta plástica, e) suporte de ovo feito sob medida, f) tinta preta, g) vidro de relógio quadrado, h) vidro de relógio quadrado com base sylgard preta, i) micro-bisturi no porta-agulhas, j) pinos minutien, k) minutien ou agulha de tungstênio no porta-agulhas, l) Tesoura de mola Pascheff-Wolff, m) Dumont #5 pinças, n) colher perfurada, oi) agulha de transferência de fogo curta, oii) longo fogo puxado na agulha, p) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig2.jpg"> Figura 2. Transplante de tubo neural intraespécie. As imagens do tubo neural chick/GFP foram modificadas de Delalande et al. 12. A vascularização não é necessária para a colonização intestinal por células de crista neural entárica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig3.jpg"> Figura 3. Injeção intravenosa de DiI. (A) Instrumentos recomendados: a) Queda do CellTracker CM-DiI no parafilme, b) agulha de injeção de vidro puxada, c) tubo bucal. (B) Diagrama esquemático da injeção dii intravenosa em embrião quimérico E4. (C) em ovo DiI injeção intravenosa mostrando agulha de vidro fina contendo DI Inserida na veia (seta). (D) Embrião quimérico E4 pós injeção dii (vermelho) com tubo neural GFP+ (seta). (E) DiI manchou rede de vasos sanguíneos finos em um embrião vivo, 24 horas após a injeção. Br: cérebro; H: coração; LB: broto de membro; A: allantois. As imagens em (C) e (D) foram modificadas de Delalande et al. 12 A vascularização não é necessária para a colonização intestinal por células de crista neural entônica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig4.jpg"> Figura 4: Resulta representativo no estômago e caecum de um embrião de pintinho E5.5. (A-C) 3D reconstrução dimensional (3D) de uma pilha de imagens confocal na região do estômago mostrando (D) as células de crista neural enteric GFP+ (ENCC) (E) o sistema vascular manchado de DiI e (F) uma imagem mesclada de ambas as redes D-F Seções histológicas ao nível do estômago mostrando (G) o GFP+ ENCC (H) o sistema vascular manchado do DII e (I) uma imagem mesclada de ambas as redes. Os núcleos estão manchados com DAPI (ciano). (G-H) reconstrução 3D de uma pilha de imagens confocal na região do caecum mostrando (A) a frente de migração GFP+ ENCC em verde, (B) o sistema vascular manchado de DiI em vermelho, e (C) uma imagem mesclada de ambas as redes. As imagens (A-F) foram modificadas de Delalande et al. 12 A vascularização não é necessária para a colonização intestinal por células de crista neural entônica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/52514/52514figS1.jpg"> Figura S1. Isolamento de um tubo neural GFP+ doador dos tecidos circundantes por digestão enzimática e microdiscção. (A) Tubo neural GFP+ e somitas adjacentes dissecados do embrião doador. (B) Tubo neural isolado após digestão de pancreatina e micro-dissecção usando pinos minutien inoxidáveis. Então: somitas; NT: tubo neural; Nc: Notochord.
<img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514video1.jpg"> Vídeo 1. rotação 360° tridimensional da imagem na Figura 4C, mostrando o sistema vascular e o ENCC no estômago em E5.5 (HH27-28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video1.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514video2.jpg"> Vídeo 2. rotação 360° tridimensional da imagem na Figura 4I, mostrando o sistema vascular e a frente de migração ENCC na região do caecum em E5.5 (HH27-28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video2.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a>

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Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Aqui relatamos rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos usando enxerto de intraespécie do tubo neuralGFP combinado com injeção intra-vascular diI. Esta técnica experimental nos permite visualizar e estudar simultaneamente o desenvolvimento do sistema nervoso derivado do NCC (entérico) e do sistema vascular, durante a organogênese.

Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

dual-labeling-neural-crest-cells-blood-vessels-within-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

8.0K visualizações.  UCL Institute of Child Health. Aqui relatamos rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos usando enxerto de intraespécie do tubo neuralGFP combinado com injeção intra-vascular diI. Esta técnica experimental nos permite visualizar e estudar simultaneamente o desenvolvimento do sistema nervoso derivado do NCC (entérico) e do sistema vascular, durante a organogênese. 

Vídeo: Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Biologia do Desenvolvimento

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Dissecção, cultura e análise de células da crista neural craniana primária do mouse para o estudo de delaminação e migração de células de crista neural

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

Isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco originais de adipose da crista neural do tecido adipogênico periaorótico

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

Um sistema otimizado de O9-1/Hidrogel para estudar sinais mecânicos em células de crista neural

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

Placa neural de Murine Alvo por In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) no Dia Embrionário 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...