Olá, sou Kai Jin, da Universidade de Yangzhou. Em nome do nosso grupo de pesquisa, apresentarei uma poderosa ferramenta do embrião de frango em pesquisa de desenvolvimento. O embrião de frango é um modelo clássico de desenvolvimento que tem sido usado para investigar o desenvolvimento e a diferenciação, na verdade, as medidas ímãs do laboratório em embriões de frango é uma ferramenta valiosa para a biologia do desenvolvimento, como transfecção genética, reprodução transgênica e a preparação transmural gonadal.
Em nosso laboratório, estabelecemos os métodos de injeção tipo mu, mas para muitos pesquisadores, o detalhe da injeção não é claro e difícil de alinhar. Então, neste vídeo, vamos mostrar os detalhes da injeção vascular durante o estágio inicial do desenvolvimento do embrião de frango no ovo. Sinta-se livre para entrar em contato conosco se você estiver interessado nele.
Aqui, mostramos os detalhes do protocolo. Coleta e preparação de óvulos fertilizados. Primeiro, ao contrário dos mamíferos, a galinha tem milhões de folículos em um único ovário, mas apenas alguns desses folículos são maduros o suficiente para ovular.
Cada folículo contém um oócito ou célula germinadícula. Assim que o folículo amadurece e libera sua gema, ele é incorporado ao funil do tubo falópio. À medida que o folículo entra no abdômen jugular do oviduto, o sêmen se liga ao ovo no corpo da galinha e o cálcio no corpo da galinha forma uma concha que envolve o óvulo fertilizado formando um ovo de casca macia no corpo.
As cascas de cálcio gradualmente engrossam até que o ovo seja produzido. Colete o óvulo fertilizado, academicamente chamado ovos de embrião e coloque-os perfeitamente em um rack em uma incubadora a 37,8 graus Celsius e 60% de umidade. Os embriões são incubados em condições adequadas.
Depois de dois dias incubações pequenos pontos vermelhos pulsantes chamados corações primordiais aparecem. Esse processo é chamado de espancamento de cereja. Em torno de 2,5 dias, os vasos sanguíneos são visíveis e os segmentos do coração e do corpo se formaram.
Agulha e preparação plasmida. Usamos capilares de vidro como agulhas. Antes da injeção prepare os capilares de vidro com o diâmetro externo de um milímetro e o diâmetro interno de 0,6 milímetros.
Os materiais exógenos geralmente são plasmídeos, lentivírus embalados e células germinativas primordiais, ou PGCs. Neste vídeo, usamos o azul trypan para mostrar o traço de materiais injetados. Janelas. Antes de expor os embriões, precisamos esterilizar os embriões para evitar a contaminação dos germes.
Isso é feito limpando suavemente a superfície dos embriões com uma bola de algodão 75% álcool no local da abertura do ovo. Após a desinfecção, bata suavemente a extremidade cega da casca de ovo com fórceps e corte cuidadosamente um buraco de 0,5 centímetro por 0,5 centímetro na superfície da casca de ovo com as fórceps para expor o embrião. Injeção intravascular in-ovo.
Olhe para a vista sob o microscópio, ajuste o foco do microscópio para primeiro localizar o embrião e, em seguida, encontrar os vasos sanguíneos do embrião de frango pronto para injeção. Aponte a agulha com a substância exógena no vaso sanguíneo, observando que a agulha é paralela ao vaso sanguíneo que está sendo injetado. Insira a agulha suavemente no vaso sanguíneo e, em seguida, ligue a bomba de ar.
Neste ponto, a substância estranha entra na artéria e com a batida do coração, circula de volta para o embrião através da artéria, e depois para a veia. Existem dois tipos de injeções vasculares. A é uma injeção de cabeça onde a substância estranha é injetada de uma veia na cabeça do embrião e flui de volta para o coração.
A outra é uma injeção aórtica dorsal onde a substância estranha circula para o embrião com a batida do coração. Com a batida do coração embrionário e a circulação de sangue podemos ver claramente que o material estranho é recebido pelos capilares no final da artéria, na veia e, em seguida, retornar ao embrião da veia, indicando que o material estranho injetado é efetivamente entregue a cada parte do embrião. Após a injeção, remova o ovo do estereoscópio, corte um pedaço de fita médica de três centímetros de comprimento com uma tesoura pequena e conecte a fita à abertura.
Raspe suavemente a fita com a tesoura para espremer quaisquer bolhas de ar, e depois corte outro pedaço de fita para selar a abertura em uma cruz. Após a vedação da abertura, os embriões injetados são cuidadosamente colocados de volta na incubadora. Aqui mostramos as imagens representativas dos embriões de frango após a injeção.
A primeira imagem mostra o resultado da injeção plasmida de lentivírus. A fluorescência verde sob um microscópio de fluorescência estereoscópica indica a expressão bem sucedida de plasmídeo injetado em embriões. Isso sugere a viabilidade da injeção intravascular de plasmídeos em embriões de frango.
A segunda imagem mostra os resultados da injeção de PGC. Os PGCs foram rotulados com RFP. Nesta foto pudemos ver os PGCs injetados que são os pontos vermelhos aqui, localizados na gônada dos destinatários.
Isso indica que os PGCs doadores foram capazes de entrar e colonizar na gônada dos receptores efetivamente. Em conclusão, este protocolo apresenta o processo de injeção intravascular in-ovo de materiais exógenos, plasmídeos ou PGCs em embriões de frango. O método mostrado aqui é fácil de acompanhar e aprender e vale a aplicação em muitos campos.
Isso é tudo que eu gostaria de compartilhar com você. Espero que essa abordagem facilite seu trabalho como uma poderosa ferramenta de pesquisa na definição de embriões de frango e na biologia do desenvolvimento. Obrigado por assistir este vídeo e boa sorte com sua pesquisa.
