Agradecemos a Shlomi Krispin para a imagem do tubo neural. Em particular, reconhecemos Yuval canela para iniciar a técnica de transfecção GFP. Este trabalho foi financiado por concessões do Ciência Israel Foundation, Francaise Associação Miopatias contre les, e Forschungsgemeinshaft Deutche, Centro de Pesquisa Colaborativa 488 CK

1. Preparação de Micropipetas Puxamos nossas pipetas em um padrão Narishige pp-83 pipeta extrator com uma configuração de calor de 13,5. A definição precisa deve ser calibrado, visando um diâmetro ponta da pipeta de 8 a 10 microns. Usamos filamento contendo tubos de vidro de borosilicato com um diâmetro exterior de 1,0 mm e diâmetro interno de 0,75-0,78 mm. As pipetas são, consequentemente, armazenados em um prato de plástico com as pontas protegidas do contato com as bordas do prato. 2. Preparação DNA O plasmídeo de interesse é transfectado em DH5α E. coli usando os procedimentos padrão. Culturas durante a noite de colônias isoladas são usadas para purificar o plasmídeo usando maxi-prep kits (qualquer kit comercial deve fazer). Usamos uma concentração plasmídeo de 1,0 mg / mL para não-clonal injeções. Concentrações mais altas aumentam o entupimento das pontas de pipeta. Para aplicações clonal, as concentrações de plasmídeo são muito menores e deve ser ajustada (ver abaixo). Para pCAGG-GFP, a concentração ideal produzindo resultados clonal foi encontrado em cerca de 0,05-0,1 mg / mL. Um a 2 mL de plasmídeo é tipicamente usado por experiência, e uma quantidade mínima de fast-verde em pó (aderindo à ponta de uma pipeta de vidro seco, sharp) é adicionado ao plasmídeo antes do experimento começa. O plasmídeo é então centrifugado em uma centrífuga de mesa por 2 minutos em velocidade máxima. Este procedimento parece reduzir pipeta-entupimento problemas. 3. Injeção de Embriões 3.1 Preparação de embriões Usamos codornas, assim como os ovos de galinha para injectáveis. Os ovos são incubados deitado no seu longo eixo até o estágio de desenvolvimento desejado. Os ovos são limpo com álcool 70% e deixa-se secar. A ponta do ovo é perfurado com uma tesoura cirúrgica (isto é necessário apenas em ovos de galinha) e 1 mL (em codornas) ou 2 mL (bico) de albumina é traçada a partir do ovo com uma seringa de 10 mL (19G agulha). Os buracos são seladas com parafina quente. Antes da injeção real, uma janela é aberta no topo da casca do ovo com uma tesoura cirúrgica. Colocação de fita adesiva sobre a casca e cortando-lo pode ajudar a reduzir os detritos da shell. Tampão PBS contendo antibióticos é pipetado imediatamente para o ovo. Para acessar o embrião, o vitelínico e / ou membranas amnióticas são cortadas e desviada usando pinos 0,14 milímetros de insetos montados em um suporte de agulha. Tinta não tóxica (Pelican # 17) é injetado debaixo da blastoderma para ajudar a visualizar o embrião, usando um fogo puxado capilar montado em um aspirador. Carregando 3,2 e montagem de micropipetas O micropipetas extrator pode ser carregado com o plasmídeo pelo fogo puxado capilares de diâmetro adequado, montados em um aspirador. A quantidade mínima de plasmídeo é desenhado com o capilar e carregado na pipeta seu oposto abertura para a ponta afiada, e se aproximando da ponta do lado de dentro, tanto quanto possível. A pipeta é, consequentemente, carregado em uma pressão de ar manual injector montado em um micromanipulador. Pressão mínima é aplicado, se necessário, de modo a permitir a solução de plasmídeo para alcançar a ponta da pipeta. 3,3 injeção Plasmid A pipeta é manipulado no meio líquido do ovo ao aplicar alguma pressão de ar para evitar o entupimento da ponta da pipeta. O domínio do tecido relevante é perfurada. A mudança na pressão como a ponta entra no tecido é muitas vezes suficiente para liberar plasmídeo com verde rápido visível. Se este não for o caso, aplique uma leve pressão na seringa até que o verde plasmídeo / fast são ejetados. Este processo pode ser repetido ao longo do eixo do embrião, por exemplo, em somitos adjacentes ou ao longo da extensão do tubo neural. Após as injeções, PBS podem ser adicionados. A janela é selada com fita adesiva (parafilme não é desejável especialmente para ovos de codorna, ela aumenta as taxas de mortalidade embrionária, provavelmente através do bloqueio troca de oxigênio através do shell). Os embriões tratados são retornados para uma incubadora. Evitar a ventilação e coloque pequenos recipientes com água na incubadora como eles ajudam a manter rendimentos e aumentar a umidade. 4. Ajustar os parâmetros de injeção e Monitoramento Taxas de Sucesso Asessing e calibrar vários parâmetros de injeção é crítica para aplicações que visam a análise de uma única célula. Não um evento cada injecção levará a rotulagem de sucesso de uma única célula. Plasmídeo de concentração que é muito alto pode levar a não-clonal rotulagem, enquanto concentrações muito baixas resultam em elevadas taxas de insucesso. A concentração do plasmídeo injetada deve ser otimizado para injeções clonal. Recomendamos diluição de todo o estoque purificada plasmídeo, em vez de diluir preps indivíduo a uma concentração pré-determinada. O últimopoderia introduzir alguma variação de taxas de sucesso, provavelmente devido a variações na pureza e outros parâmetros como a proporção de plasmídeo superenrolado. 4,1 Avaliando as taxas de sucesso pela observação montar toda Avaliação inicial de embriões injetados podem ser realizadas por todo o monte de observação com um binóculo fluorescente. De seis a oito horas após a injecção são suficientes para avaliar as taxas de sucesso com uma construção GFP pCAGG avançada. Isto é, desde que o site de destino é superficial o bastante para ser prontamente aparente (por exemplo, o somito dorsal, tubo neural dorsal, etc ectoderma, veja a Figura 1A-C).. Esta etapa é particularmente útil para avaliar a série experimental exibindo ou muitas células marcadas ou, alternativamente, na falta de quaisquer células fluorescentes. Se mais de incubação é desejado, os antibióticos contendo solução de PBS devem ser adicionados ao ovo e depois de ver a fita de vedação deve ser substituído. Avaliando 4,2 clonalidade pelo serial-seção de análise O melhor meio para avaliar as taxas de injeções de sucesso é de série-secção embriões injetado e utilizando imuno-histoquímica para visualizar as células marcadas. Sob essas condições, os tempos de incubação pode ser tão curto como 4 horas após a injecção. Os embriões são fixadas e processadas para o seccionamento de parafina (ou cryosectioning). De vidro montada em secções são então de-paraffinized e imuno-coloração para visualização repórter. Métodos de amplificação, como biotina-estreptavidina pode ser desejável. Finalmente, as seções de série são verificados para detectar células marcadas nos segmentos injetados. Se, após testes iniciais múltiplas em vez de células individuais são obtidas, o estoque plasmídeo deve ser diluído eo processo é repetido até que os resultados adequados sejam atingidos. Duas a 10 vezes diluições da solução-mãe plasmídeo pode ser necessária em casos de taxas de sucesso serem muito altas. Para cada plasmídeo a ser transfectadas, uma calibração minuciosa que garante a clonalidade deve ser repetido. 5. Resultados representante Normalmente, realizar uma única injeção de pCAGG-GFP por somito, ao passo que a focalização nos segmentos 12/06 por embrião 1 2. Sob essa configuração, um claro sinal pode ser detectado por toda observação pós-injeção de montagem de 8 horas, em pelo menos um segmento de um embrião em cada dez. Sob essas condições, rotulagem foi confirmada para ser clonal (Figura 1B, C). Quando se utiliza concentrações elevadas de DNA, a maioria dos embriões podem apresentar pelo menos uma injeção de sucesso, levantando a possibilidade de que várias células foram transfectadas. Análise da seção de série revelou que transfections clonal foram alcançados quando a taxa de sucesso foi de cerca de 10%. Isto significa que para atingir clonalidade, a técnica é, por definição, altamente ineficiente. Por outro lado, nessas condições, mais de 93% dos eventos de rotulagem positiva foram encontrados para ser um clonal. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Injeções clonal de pCAGGS-GFP em progenitores neurais e esquelético. (AC) seções transversais mostrando rotulagem do tubo neural dorsal (NT) (A), de domínio ventrolateral do dermomyotome (DM) (B), ou folha de DM central (C) , 6h após a microinjeção de pCAGGS-GFP a um único progenitor. (D) Dois dias após a transfecção clonal da central DM, progenitores único gerado derivados em ambos os derme (D), bem como músculo (M) (ver ref. 1 para detalhes).

<ol>
	<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates.">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium,+smooth,+and+striated+muscle.">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li><li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+.">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. .</a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos.">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito acima é uma modificação de uma técnica descrita anteriormente para a entrega de corantes lipofílicos para subpopulações de células pequenas ou progenitores única 3. Ele tem três grandes vantagens sobre a técnica de eletroporação padrão. Primeiro, ele fornece um meio para a rotulagem com sites de confiança discretas em tecidos-alvo, permitindo maior resolução espacial do que eletroporação (ver, por exemplo, Figura 1B, C). Segundo, que permite a rotulagem de uma única cél...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipette tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>B100-75-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>2-000-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Watkins &amp; Doncaster</td>
<td>E6871</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>03-031-1B</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

single cell transfection in chick embryos

Um tema central em biologia do desenvolvimento é a diversificação de linhagens ea elucidação dos mecanismos subjacentes molecular. Isto implica uma análise profunda dos destinos de uma única célula em condições normais e experimentais. Para este fim, métodos de transfecção que visam única progenitores são um pré-requisito. Descrevemos aqui um método tecnicamente simples para transfecting células individuais em tecidos de frango in-ovo, permitindo que a linhagem confiável de rastreamento, bem como a manipulação genética. Domínios tecidos específicos são direcionados dentro do somito ou tubo neural, e DNA é injetado diretamente no epitélio de interesse, resultando em transfecção de células individuais esporádicos. Usando repórteres, populações clonais pode conseqüentemente ser seguido por até três dias, e comportamento de populações geneticamente manipulados clonal pode ser comparada com a de controles. Este método aproveita a acessibilidade do embrião de galinha juntamente com ferramentas emergentes para a manipulação genética. Nós comparar e discutir suas vantagens sobre o método de eletroporação amplamente utilizado, e possíveis aplicações e uso em mais in-vivo modelos são também sugeridas. Defendemos o uso deste método como um acréscimo significativo e complementar para os actuais linhagem rastreamento e ferramentas de interferência genética.

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Single Cell Transfection in Chick Embryos

Usando ponta fina micropipetas injetamos DNA plasmídeo em subdomínios de somitos frango ou tubos neural. A concentração do plasmídeo é ajustada para gerar única células transfectadas. Em seguida, permitir que as células de se transformar em populações clonais.

Transfecção única célula em embriões de galinha

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K visualizações.  Hadassah Medical School - Hebrew University. Usando ponta fina micropipetas injetamos DNA plasmídeo em subdomínios de somitos frango ou tubos neural. A concentração do plasmídeo é ajustada para gerar única células transfectadas. Em seguida, permitir que as células de se transformar em populações clonais.

Vídeo: Single Cell Transfection in Chick Embryos

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biologia

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.