The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.

Este protocolo segue as diretrizes LUMC e AMC do comitê de ética em pesquisa humana. 1. Procedimento Cirúrgico e Cobrança Tissue Nota: Apesar de existirem várias técnicas para a excisão cirúrgica da contratura de Dupuytren, o padrão ouro atual é a facectomia parcial 15. A maioria dos doentes são tratados no dia-a cirurgia clínica. <ol><li> Realizar a cirurgia sob anestesia geral ou regional, de acordo com as preferências do paciente e anestesista e das comorbidades do paciente. Estas considerações estão fora do escopo deste artigo. Antes da incisão, tocar a pele com um objeto pontiagudo para verificar que a anestesia é satisfatória. Use um torniquete para facilitar a visualização cirúrgica em um campo sem derramamento de sangue. </li><li> Após Prepping estéril e drapeados, marcar a incisão antecipada com uma caneta. Faça uma incisão na pele com um bisturi sob ampliação lupa ou longitudinalmente or utilizando incisões em ziguezague para impedir contraturas adicionais e também para permitir a exposição suficiente. </li><li> Usando tesoura de dissecção, libertar a pele e subcutâneo dos subjacentes palmaris fáscia contratados. Identificar e proteger o feixe neurovascular do dedo, porque o cabo de doente pode deslocá-lo para a linha média. Uma vez que o tecido fibrótico (nódulo e / ou cabo) é delineada, extirpar, colocou e regionalmente (subtotal), utilizando um bisturi. Hemostasia meticulosa sob controlo torniquete no final do procedimento para evitar a formação de hematoma. </li><li> Para fechar a pele, use-plasties Z adicionais para obter alongamento parcial da pele. </li><li> Para estes estudos usar apenas a parte nódulo do cordão fibrótico, a parte mais ativa e celular da doença. Já o cirurgião realizar a identificação macroscópica. Os nódulos isolados na palma da mão são frequentemente precursores ou um cabo, mas quase nunca são ressecadas, como eles geralmente não causar sintomas.As que ressecados foram os nódulos que faziam parte de um cabo do dedo contratado. Identificar esses nódulos pela parte grossa duro das cordas no handpalm (Figura 1A). </li><li> Uma vez que o cirurgião remove o tecido, imediatamente transferi-lo usando uma pinça estéril para um tubo de 50 ml contendo meio DMEM suplementado com FCS a 10% e 1% (P / S). Manter o tecido durante um período máximo de 2 horas neste meio em uma caixa de gelo triturado (4 ° C) (por exemplo, o transporte do tecido a partir da sala de operação para a instalação de cultura de células). </li><li> Mantenha as amostras em gelo molhado (4 ° C) durante a preparação para a próxima etapa. Preparação de materiais da câmara de cultura de células e requer 10-20 min. </li></ol> 2. Preparação de Instrumentos, Meio de Cultura e Cultura Inserções Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado. <ol><li> Preparar 500 ml de DMEM suplementado com FCS a 10% e 1% (P / S) e filtro sterilize. Pré-aquecer o meio a 37 ° C. </li><li> Fórceps autoclave, um par de tesouras Mayo curvas de lâmina (150-170 mm de comprimento) e um par de tesouras Metzenbaum e guarde em um recipiente estéril. </li><li> Sob fluxo laminar, aberto um estéril de 12 poços da placa de cultura. Coloque uma inserção de cultura (0,45 de tamanho de poro, 12 mm de diâmetro) em cada poço da placa de 12 poços (Figura 1B, painel inferior). </li><li> Encher a placa de 12 poços com 600 ul de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por pipetagem no bem e não directamente na membrana da pastilha. Colocar a placa na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) (Figura 1B, painel superior). <ol><li> Em alternativa, usar uma placa de 24 poços e adicionar 300 uL de meio por poço. O volume de meio por poço é óptima quando uma camada de menisco é formado entre o líquido e a parte inferior do inserto membrana. Nota: o meio, na parte inferior do poço difunde-se através da Membr nitroceluloseane formando a camada de menisco, como representado nos esquemas da Figura 1B (painel inferior). </li></ol></li></ol> 3. Tissue Setup Preparação e Ex Vivo Cultura de Tecidos Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado. <ol><li> Transferir o nódulo parte do cabo a partir do tubo de 50 ml, num prato de Petri 100 milímetros e adicionar 10 ml da pré-aquecido (37 ° C) médio. Certifique-se de que o tecido está em contacto com o líquido durante todo o procedimento. <ol><li> Retirar a camada de gordura perinodular usando a tesoura Metzenbaum. Descartar o tecido adiposo. Com a utilização de fórceps e tesouras as curvas de lâmina, cortar transversalmente o tecido em pequenos pedaços (com uma espessura máxima de 200 mm). </li></ol></li><li> Transferir a placa de 12 poços da incubadora para a capa laminar. Verificar que a membrana do inserto tornou transparente (molhado) e, por conseguinte, está em contacto com o meio. </li><li> Utilizando uma pinçalevantar cuidadosamente uma parte do tecido por tocar na camada exterior (não aplicar tensão no tecido). Coloque uma parte do tecido para a membrana da inserção de cultura de células de modo que o tecido permanece na interfase ar-meio. Cultura um máximo de duas peças de tecido na mesma pastilha / poço. </li><li> Certifique-se de que o tecido é colocado plana sobre a membrana, em contacto longitudinal com o meio de tal modo que o tecido não adere à membrana nem é inteiramente coberta pela mídia. Evitar bolhas de ar. Nota: Nesta fase, é possível adicionar fatores de crescimento ou inibidores de interesse para a mídia; por exemplo, os compostos de ensaio (A, B, C, D, E) de repetições e / ou na curva de concentração. Inclua pelo menos 2 controle (sem tratamento) peças de tecido em condições normais de crescimento para garantir que a experiência tem sido configurado corretamente. Incubar tecidos para 3-7 dias numa incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Infectar o tecido com qualquer um lentivírus ou adenovírus construção se superexpressão ou derrubar experiments de uma necessidade gene de interesse a ser realizado (Figura 2). Transferir uma parte do tecido da placa de 12 poços numa placa de 35 mm, utilizando fórceps. <ol><li> Utilizar um volume máximo de 10 ul de vírus de título elevado. </li><li> Realizar a injecção sob um microscópio de dissecação com uma seringa de insulina carregada com 50 ul de PBS contendo 10 ul de vírus seleccionados. Inserir a agulha perpendicular ao centro do tecido. </li><li> Lentamente injectar o conteúdo da seringa. Não retirar a agulha diretamente. Quando a perfuração do tecido, não deixe que a agulha passar pelo outro lado, mas manter a agulha dentro do próprio tecido (em torno do centro do tecido). </li><li> Transferir o tecido de volta para a placa de 12 poços, fechar a placa de cultura e colocá-lo na incubadora (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol></li></ol> 4. Whole-mount Imunofluorescência Coloração e Reconstrução 3D Nota: Todos os proprocedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado. O protocolo para immunostaining montagem toda e de imagem descritos a seguir é uma adaptação de métodos reportados anteriormente utilizados para outros tecidos 16-19. Tampões e materiais estão descritos na Tabela 1 e Lista de Materiais. <ol><li> Tecidos de transferência da placa de cultura a 2 ml microtubos contendo PBS. Lavar 2x durante 5 minutos em solução de PBS, numa plataforma rotativa. Fix tecidos em 4% tamponada PFA (1,5 ml de solução por tecido em 2 ml de tubos de microcentrífuga), O / N a 4 ° C numa plataforma rotativa. </li><li> Remover e lavar 3x PFA em PBS durante 5 min cada. </li><li> Desidratar tecidos por imersão em uma solução de metanol a 25% durante 2 horas à temperatura ambiente, numa plataforma rotativa. Aumentar gradualmente a percentagem de metanol (50%, 75%, 100%) com os tecidos imersos em cada solução durante 2 horas à temperatura ambiente, numa plataforma rotativa. </li><li> Tecidos de transferência em DMSO / solução de metanol (passo permeabilização) durante 3 semanas a 4 ° C,como anteriormente descrito 18. Nota: Nesta fase, os tecidos podem ser armazenadas a longo prazo em metanol a 100% a -20 ° C. </li><li> Prossiga com coloração procedimento 16, 17; gradualmente re-hidratar os tecidos (75% -50% -25% -0% série metanol). Executar cada etapa de re-hidratação durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C, sob agitação constante. </li><li> Incubar as amostras com anticorpos primários em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 20% de DMSO O / N a 4 ° C. Use anticorpos nas seguintes proporções utilizando as reservas comerciais em PBS: anti-α actina de músculo liso (1: 500, rato), tipo anti-colágeno I (1: 500, de cabra), anti-colágeno tipo III (1: 500, cabra). </li><li> Lavar extensivamente em PBS durante 48 horas a 4 ° C (solução de PBS mudança de 3 a 4 vezes). </li><li> Diluir anticorpos secundários adequados (Alexa 555 anti-ratinho, Alexa 488 anti-cabra) a 1: 250 em PBS contendo 1% (BSA) e 20% de DMSO. Incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar extensivamente em PBS durante 48 horas a 476; C e incubar com contraste nuclear, TO-PRO-3 diluído 1: 500 em PBS no passo de lavagem final. Nota: TO-PRO-3 é um corante vermelho-extremo emissores de ADN (com um He-Ne linha de laser 633 nm) e é combinado para imagiologia simultânea com outros canais; neste tipo de colágeno tipo caso I / colagénio III (488 nm), α actina de músculo liso (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). </li><li> Transferir os tecidos a uma série de metanol (25% -50% -75%) para se desidratar-se lentamente o tecido; executar cada etapa de desidratação durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C sob agitação constante. <ol><li> Tecidos de transferência em tubos de polipropileno. Tecidos claros em metilsalicilato (alça sob o capô química) 18 ou como uma alternativa de uso solução BABB 19. Incubar à temperatura ambiente, sob agitação constante até que os tecidos tornam-se transparentes. Mount entre um slide e uma lamela selado com jogo duro meio de montagem (Figura 1C, painel superior). </li></ol></li><li> Amostras de imagem em um micro confocal invertidoâmbito equipado com alta NA 63X e / ou os objectivos de imersão de óleo 100X (Figura 1C). <ol><li> Limpar a lente com a solução de limpeza fornecido pelo fabricante do microscópio. </li><li> Aplicar uma gota de óleo sobre a lente objectiva. Coloque o slide com o modelo no palco microscópio e foco na amostra. </li></ol></li><li> Defina as configurações no microscópio para gravação simultânea de três canais de fluorescência com linhas de laser de 488 nm, 514 nm e 633 nm. </li><li> Adquira imagens XY individuais ou várias imagens de plano focal (pilha Z) (Figura 3A). Use aumento da largura da pilha Z para executar a reconstrução 3D. Para obter uma imagem de alta resolução utilizam baixa velocidade de digitalização, número de scans médios (≥ 3) e adquirir imagens de resolução de 1.024 x 1.024 pixels de 16 bits. </li><li> Analisar as imagens da pilha Z adquiridos: primeiro renomear e salvar arquivo de imagem (xyz). Utilizando o programa de software do microscópio confocal, configurar uma intensidade máxima projecção das imagens pilha Z em uma reconstrução 3D da imagem. <ol><li> Selecione o arquivo xyz, em &quot;Ferramentas processo&quot;, clique em &quot;Visualização&quot; e &quot;Projeção 3D&quot;. Enter &quot;máximo&quot; no método de projecção (ou &quot;médio&quot;, se o sinal fluorescente é saturada). Para uma única projeção não altere o X, Y, Z e aviões, e aplicar a ferramenta de projeção (Figura 3B, R1). </li></ol></li><li> Use as imagens da pilha Z para criar uma projeção em 3D com animação (software confocal) para fins de visualização. Selecione o arquivo xyz, nas ferramentas de processo, clique em &quot;Visualização&quot; e &quot;Projeção 3D&quot;. <ol><li> Clique em &quot;Criar Filme&quot;. Digite o ângulo de iniciar a rotação em graus (por exemplo, 0 ° como ponto do filme, eixo Y de partida) e clique em &quot;Set Start&quot;. Digite o ângulo de rotação em graus End (eixo Y), como ponto final do filme (por exemplo, 180 ° ou 3606; para uma rotação completa) e clique em &quot;Set End&quot;. </li><li> Escolha &quot;Máximo&quot; como um método de projecção (ou &quot;médio&quot;, se o sinal fluorescente é saturada). Introduzir o &quot;Número de Quadros&quot; para a rotação da reconstrução 3D (por exemplo, 20 ou rotações mais elevadas para reduzir a velocidade de rotação). Clique em &quot;Aplicar&quot;. Exportar o filme como um arquivo visual (por exemplo, &quot;avi&quot;) (Filme Suplementar 1) ou exportar como arquivo &quot;tiff&quot;, que cria um arquivo de imagem para cada ângulo de rotação (Figura 3B, rotação R4, R10, R18). </li></ol></li></ol> 5. Combinada Second Harmonic Generation (colágeno) e de dois fótons de fluorescência Excited (elastina) Imagem em Tissue Ex Vivo durante Cultura Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado. <ol><li> Remover placas transwell da incubadora e coloque um único (não fixo) tiparte ssue em um 35 milímetros placa de cultura celular contendo 500 mL de meio. </li><li> Colocar o tecido de modo que o eixo longo é plana sobre a placa. Mantenha tecido molhado em todos os momentos no entanto, não flutuante. </li><li> Coloque objectivo imerso em água do microscópio multifóton directamente em contacto com o tecido (Figura 1C). </li><li> Obter imagens com um comprimento de onda de excitação de 800 nm e coletar luz emitida entre 371-425 nm (SHG, colágeno) e 474-532 nm (autofluorescência, elastina) (Figura 3C). Execute microscopia de dois fótons em um microscópio confocal vertical equipado com um laser de femtosegundo usando uma objetiva de imersão em água 20X / 1.0 NA. Processo confocal acumula com o software do fabricante. Nota: Excitação com um laser infravermelho próximo de moléculas de colágeno cria alto contraste de imagem de estruturas de colágeno nativas em diferentes profundidades. </li></ol>

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S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+&#945;-smooth+muscle+actin+determines+the+contractile+phenotype+of+Dupuytren's+nodular+cells.">Post-transcriptional regulation of &#945;-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).</li></ol>

Os autores entraram com um pedido de patente para a doença de Dupuytren: cultura de órgão 3D. # GB1307200. Contratos de licença e de serviços comerciais estão disponíveis.

Os passos mais críticos de cultura ex vivo de tecido conjuntivo humano são o uso imediato do tecido após a remoção cirúrgica para assegurar a viabilidade; o tecido deve permanecer na solução de meio ou soro fisiológico em todos os momentos; manter uma cultura estéril; cortes transversais de tecido deve ter espessura máxima de 200 m; configurar o sistema de cultura ex vivo é óptima quando o tecido está em contacto com o suporte, mas não totalmente submerso. Meio deve ser adicionado apenas...

Doença de Dupuytren (DD), uma doença benigna fibroproliferativa provoca a flexão permanente dos dedos, devido à formação de nódulos e os cabos de na palma da mão. Embora a propagação da doença é particularmente elevado entre os caucasianos do norte da Europa, a etiologia genética subjacente da doença permanece desconhecida 1. A principal característica do DD o excesso de produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) (por exemplo, colagénio), que formam um tecido fibroso resistente que ocupa o espaço entre os tendões e pele da palma da mão e dos dedos, interromper permanentemente os movimentos finos da mão 2, 3. A recorrência da doença sugere alterações genéticas subjacentes como causa da fibrose 1, 4. Um tratamento eficaz pode ser de alvejar diretamente os mecanismos fibróticas incontroláveis ​​a nível celular e molecular. Nosso trabalho recente sobre a fibrose nos levou ao desenvolvimento de umnovo sistema de cultura 3D que permite a cultura de curto prazo de tecido fibrótico humano com o potencial de teste de drogas. Este sistema tem ajudado a superar a abordagem limitante de culturas de fibroblastos em 2D e para definir um papel para a regulação para baixo parcial, conseguida por exon skipping, de TGF ativação da via na mediação fibrose 5. Desenvolvemos um método para a cultura ex vivo a partir de amostras de ressecção humano doentes DD para estudar a interacção entre miofibroblastos e a ECM circundante 5, 6. O estudo de DD fibrose do tecido conjuntivo bem como outras doenças fibróticas baseia-se na análise histopatológica do cirúrgico excisado espécimes, o isolamento de fibroblastos a partir do tecido e estabelecimento de culturas primárias ou de procedimentos de separação de células. Estas abordagens são completamente estática, uma vez que não permitem a manipulação exógena das propriedades de doença ou intervenção terapêutica por parte do experimentador. Além disso, ce primárioll culturas tendem a adaptar-se às condições de cultura e suas propriedades de expressão de genes diferem essencialmente da situação in vivo em cima de cada passagem, mesmo durante os primeiros trechos (entre passagem 3 e 6) 7, 8. Conseguimos manter o material cirúrgico resíduos em ex vivo condições de cultivo para um período de tempo que permite o estudo das características específicas do paciente e de triagem de compostos de drogas anti-fibróticas ou anti-inflamatórios. O sistema baseia-se numa membrana de nitrocelulose, que permite o contacto do tecido com o suporte, mas não com o plástico, assim, evitar a alteração do tecido após a fixação, como observado anteriormente, quando a cultura de fibroblastos DD, bem como outros tipos de células 9. Não é necessário um gel de colagénio ou outro substrato de proteína da MEC, desde o próprio tecido DD produz grandes quantidades dessas proteínas. Isto é vantajoso para a manutenção do microambiente ECM nativa e pecado rotatividadesubstratos de matriz ce são importante regulador da arquitetura e da função 10, 11 tecido. Por exemplo, proteínas da MEC como a fibronectina, laminina e colágeno, podem influenciar polaridade traseira e dianteira de fibroblastos como semelhante mostrados para polaridade apical-basal em células epiteliais 12, 13 . células polarizadas têm uma distribuição assimétrica de moléculas extracelulares, que determina a migração celular e a expressão do gene, por exemplo, acessibilidade integrina α1β1 na membrana afecta a adesão das células ao colagénio do tipo I 14. Desde um objetivo primário deste modelo 3D era preservar o microambiente nativa, não foi utilizado nenhum substrato matriz ECM artificial. Em resumo: as amostras de ressecção são igualmente cortar em um ambiente estéril e colocadas em membranas nitrocellular. Se for necessário um tratamento administrado por via de injecção os tecidos são injectadas após terem sido colocados sobre a membrana. Se o tratamento não necessita de ser administrado via injec ç ã o, em seguida, o composto é adicionado ao meio de cultura (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), com 1% de soro fetal de vitelo (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)). As culturas são mantidas durante um período máximo de 10 dias, após o que o tecido é fixado em paraformaldeído a 4% (PFA), processados ​​através de uma solução de sacarose a 30%, embebidos em composto PTU e armazenado a -80 ° C, como descrito anteriormente 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>high glucose, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PIHA01250</td>
			<td>0.45um pore size, 12mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1310-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- &#945; smooth muscle actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type III</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1330-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylsalicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsccope glass coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>BB024060A1</td>
			<td>24x60mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope SuperFrost slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>AA00000102E</td>
			<td>76x26mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 II confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710 NLO upright confocal microscope</td>
			<td>Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA 
			water-immersion objective.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human dupuytren's ex vivo culture for the study of myofibroblasts and extracellular matrix interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

O método de ex vivo, a cultura 3D de tecido conjuntivo é um conjunto up sistema fácil e robusta para entender a relação entre ECM e outros componentes de células que constituem o tecido DD e potencialmente outros tipos de fibrose também. Além disso, este sistema permite que um método fiável para testar os efeitos dos compostos sobre diferentes tipos de células e os seus efeitos sobre a carga 20 fibrótica. As etapas de coleta de resíduos de material cirúrgico...

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Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Doença de Dupuytren (DD) é uma doença fibroproliferativa da palma da mão. Aqui, apresentamos um protocolo para espécimes cultura de ressecção de DD em um (3D) sistema de cultura tridimensional. Tal sistema de cultura de curto prazo permite a preservação da estrutura 3D e propriedades moleculares do tecido fibrótico.

Dupuytren Humano do<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para o Estudo da Miofibroblastos e Matriz Extracelular Interações

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

human-dupuytren-s-ex-vivo-culture-for-study-myofibroblasts

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

10.3K visualizações.  Leiden University Medical Center.  Doença de Dupuytren (DD) é uma doença fibroproliferativa da palma da mão. Aqui, apresentamos um protocolo para espécimes cultura de ressecção de DD em um (3D) sistema de cultura tridimensional. Tal sistema de cultura de curto prazo permite a preservação da estrutura 3D e propriedades moleculares do tecido fibrótico. 

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Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Cultura Vivo de tecido do paciente e Exame de Entrega Gene

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Medicina

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placa aterosclerótica modelo para estudar Lesão Biologia

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedimento para safenas humanas Veias<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão e reforço externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...