Existem muitos protocolos para isolar miofibers solteiros dos músculos esqueléticos de camundongos adultos. Nosso protocolo é criado para ratos muito jovens e para ratos pequenos com um miofibers muito frágil. Este procedimento padronizado pode ser usado para estudar células-tronco musculares assistidas por miofibra durante o desenvolvimento pós-natal ou em modelos de camundongos de doenças que tornam os miofibers particularmente suscetíveis ao estresse mecânico.
O procedimento será demonstrado por Gloria Pegoli, doutoranda, e Federica Lucini, pós-doutora, ambas de laboratório. Para dissecção muscular e colheita, use um pino para fixar um membro traseiro de um rato eutanizado, muito jovem ou muito pequeno em uma placa de dissecação, e use pinças afiadas para levantar o tendão inferior da tíbia anterior à altura do tornozelo. Corte o tendão e use uma tesoura fina para cortar todo o caminho ao redor do músculo até o tendão ao nível da patela.
Coloque o músculo em um tubo de solução de digestão e levante o tendão inferior do comprimento extensor digitorum, puxando suavemente para cima no tendão para separar o comprimento do digitorum extensor de outros músculos. Corte e colhia o músculo. Gire a perna para ver os músculos das costas e levante o tendão de aquiles.
Um músculo gastrocnemius se separará automaticamente dos outros músculos. Corte o tendão superior na parte de trás da patela e coloque o músculo na solução de digestão. Levante o tendão externo da perna e role a pinça sob o tendão para separar suavemente o tendão do músculo.
Em seguida, corte para colher o músculo e colete os mesmos músculos da outra perna da mesma maneira. Quando todos os músculos tiverem sido coletados, coloque o tubo de coleta em um banho de água de 37 graus celsius por 45 a 50 minutos e inverta vigorosamente o tubo 10 vezes a cada 10 minutos. Quando os músculos começarem a se soltar e os miofibers se tornarem visíveis, agite as amostras uma última vez antes de transferir cuidadosamente a suspensão de digestão para uma placa petri pré-aquecida ou revestida de soro de 100 milímetros contendo 10 mililitros de solução de lavagem.
Para isolar miofibers únicos, coloque o prato sob um microscópio dissecando e use um soro de cavalo revestido de 200 microliter pipeta para separar as fibras musculares individuais. Transfira os myofibers viáveis para um soro de cavalo revestido de placa petri de 35 milímetros contendo cinco mililitros de solução de lavagem pré-aquecida. Quando todos os miofibers viáveis tiverem sido coletados, equilibre as amostras de miofibra na incubadora de cultura celular por cinco minutos.
Se mais myofibers forem necessários, use uma pipeta de vidro de grande furo para triturar a amostra restante do tecido muscular até que fibras adicionais sejam liberadas mecanicamente. Quando os myofibers suficientes tiverem sido coletados, coloque o prato na incubadora de cultura celular por uma hora por um período de equilíbrio adicional. No final da incubação, transfira miofibers individuais para um novo prato revestido de soro de cavalo pré-aquecido contendo o meio de cultura adequado e devolva a placa para a incubadora de cultura celular.
Para uma análise imunofluorescente dos miofibers, após a ligação cruzada, remova todos, menos o suficiente, para não remover nenhuma fibra e adicionar ao mesmo tubo um mililitro de 0,5% Triton X-100 em PBS para uma incubação de cinco minutos com agitação suave. Ao final da incubação, deixe as fibras se acomodarem por cinco minutos antes de substituir o supernaspeante por 1,5 mililitros de PBS. Após cinco minutos de agitação suave, deixe as fibras se contentarem por mais cinco minutos antes de substituir o supernaspeso por um mililitro de solução de bloqueio.
Após uma hora de agitação suave, substitua a solução de bloqueio por uma nova solução de bloqueio contendo anticorpos primários de interesse para uma incubação noturna a quatro graus celsius com agitação suave. Na manhã seguinte, lave as fibras com três lavagens de cinco minutos em um mililitro de 0,25% Tween 20 fresco em PBS usando agitação suave e cinco minutos de sedimentação à temperatura ambiente para lavagem. Após a última lavagem, rotule as fibras com os anticorpos secundários conjugados fluorocromáticos apropriados diluídos em solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave, protegidos da luz, seguidos por três lavagens em PBS mais 0,1% Tween, protegidas da luz, como demonstrado.
Após a última lavagem, substitua o supernaspe de um mililitro de solução DAPI para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente com agitação suave, protegido da luz. No final da incubação, lave as fibras e use uma solução de bloqueio revestida pipeta com uma ponta de corte para coletar as fibras e espalhar cuidadosamente as fibras em uma lâmina de vidro. Coloque o slide sob um microscópio dissecando, e usando apenas a luz natural refletida pelo espelho, use uma nova ponta de pipeta de 200 microliter para espalhar suavemente as fibras e remover a solução em excesso.
Depois de remover a solução em excesso, deixe o slide secar no escuro por 10 a 15 minutos até que apenas um volume muito pequeno de solução permaneça. Em seguida, adicione um volume apropriado de meio de montagem sobre as fibras antes de colocar cuidadosamente um deslizamento de cobertura sobre os tecidos. Para recuperar um número suficiente de fibras longas e viáveis que podem sobreviver 96 horas em fator de crescimento médio rico, quatro músculos diferentes são tipicamente colhidos e digeridos.
Apenas as fibras mais intactas devem ser transferidas para o meio cultural. Fibras quebradas e outros detritos devem ser descartados. Após 72 horas de cultura, células satélites ativadas geram agregados celulares ligados à miofibra.
Observamos que a cultura celular derivada de Lamin delta oito 11 camundongos duplos negativos são formados por um número menor de células. Após 96 horas, as células satélites estão expressando MioG, tornam-se visíveis dentro do aglomerado celular, iniciando a diferenciação em relação aos novos miofibers. Notavelmente, uma dinâmica retardada da diferenciação de células satélites é observada em camundongos lamin mutantes homozigos comparados com seus homólogos do tipo selvagem.
Certifique-se de praticar os passos de dissecção muscular como uma colheita muscular rápida e precisa é essencial para o sucesso do experimento. Esta técnica permite o rastreamento de células de satélite únicas durante a ativação e diferenciação, facilitando o estudo de processos-chave subjacentes ao crescimento e regeneração muscular em diferentes condições fisiológicas e patológicas.
