Nosso protocolo fornece uma abordagem fácil e rápida para o isolamento do fibroblasto primário com um foco claro em evitar a contaminação de bactérias, o que pode ser um grande problema. Especialmente para iniciantes. A principal vantagem de nossa técnica é sua simplicidade.
Uma vez que não requer extensas habilidades manuais ou experiência e pode ser facilmente aprendido por todos em um curto período de treinamento. Apresentando a técnica estará Manja Newe, técnica de fora do laboratório. Antes de começar a dissecção, coloque dois pares de luvas descartáveis, um em cima do outro.
E fixar o mouse em uma almofada de poliestireno. Desinfete a pele com 70% de etanol, certificando-se de que o animal está encharcado. E use fórceps cirúrgicos esterilizados com etanol e tesouras atraumáticas para acoar a pele bem acima do trato urogenital.
Corte de três a quatro centímetros ao longo da linha média da incisão inicial ao pescoço, adicionando cortes de alívio nos membros. E fixar a pele na almofada para obter acesso ideal à musculatura que cobre a cavidade abdominal. Em seguida, desinfete a musculatura abdominal duas vezes com 70% de etanol fresco.
Quando o etanol secar, retire o primeiro par de luvas. E use um novo conjunto estéril de fórceps e tesouras para incisar a camada muscular para abrir a cavidade abdominal e o tórax. Para remover os órgãos de interesse, segure suavemente cada órgão com os fórceps cirúrgicos sem perfurar o tecido.
E use a tesoura para cortar cuidadosamente os vasos sanguíneos perto do ponto de entrada do órgão. Coloque cada órgão em um tubo de PBS estéril e frio e feche o tubo firmemente. Colocando cada tubo no gelo molhado à medida que os órgãos são coletados.
Quando todos os órgãos tiverem sido colhidos, pulverize os tubos com 70% de etanol antes de colocá-los em uma capa de cultura celular estéril. Usando um par de luvas frescas, use fórceps estéreis para transferir cada órgão para metade de uma placa de Petri estéril de seis centímetros. E lave brevemente os órgãos com PBS fresco para remover o excesso de sangue.
Transfira os órgãos enxaguados para a segunda metade de cada placa de Petri e remova o excesso de PBS. Usando dois bisturis estéreis, pica os órgãos em fragmentos de um a dois milímetros. E use uma espátula estéril para transferir os pedaços de tecido em novos tubos individuais, estéreis, de 15 mililitros.
Adicione dois mililitros de solução de trypsin de 0,25% a cada tubo. E coloque os tubos em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por cinco minutos. No final da incubação, o vórtice dos tubos a cerca de 1400 rotações por minuto durante dez segundos.
E prenda a reação de Trypsin com quatro mililitros de um meio de cultura apropriado suplementado com soro de bezerro fetal por tubo. Em seguida, adicione o volume apropriado de solução de mistura de colagenase a cada tubo. E coloque os tubos em um banho de água ultrassônica de 37 graus Celsius por 10 minutos.
No final da sônicação, gentilmente vórtice os tubos por 10 segundos. Antes de colocar os tubos de volta no banho de água ultrassônica por mais 10 minutos. No final da segunda sônicação, vórtice os tubos por mais 10 segundos.
E desinfetar os tubos com 70% de etanol. Na capa de cultura celular, filtrar as suspensões celulares através de filtros individuais de 40 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros. E coletar as células por centrifugação.
Suspenda as pelotas em um mililitro de meio fresco por tubo. E ver as células em vasos de cultura celular adequados em densidades apropriadas de revestimento. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular durante a noite.
Na manhã seguinte, lave cada cultura três vezes com PBS antes de adicionar meio fresco e devolver as células à incubadora. Usando este protocolo, fibroblastos viáveis podem ser obtidos para uso em experimentos subsequentes. Como testes de coloração amino-fluorescente ou proliferação.
Os fibroblastos adultos são células planas em forma de fuso com múltiplos processos celulares que normalmente crescem em monocamadas. No entanto, podem ser observadas diferenças morfológicas distintas em populações de fibroblastos de diferentes órgãos. Por exemplo, os fibroblastos renais são menores e crescem em densidades maiores do que os fibroblastos cardíacos, pulmonares ou hepáticos.
Os fibroblastos isolados apresentam altas taxas de proliferação, atingindo uma confluência óptica superior a 90% após aproximadamente seis dias. Aqui, pode-se observar um myofibroblast diferenciado com microfilamentos de actina muscular alfa liso distintos. Essas células são encontradas em abundância nas culturas cardíaca, renal, hepática e celular pulmonar.
Enquanto apenas cerca de 20 a 30% das células isoladas e cultivadas expressam microfilamentos de actina muscular suave, organizados e suaves, praticamente todas as células são positivas para Vimentin e Dom-receptor de domínio discoidina 2 após sete dias na cultura. O mais importante a ser lembrado é usar a técnica certa durante todo o procedimento, pois a contaminação por bactérias deve ser evitada. Após o isolamento do fibroblasto primário, as células podem ser usadas para todos os tipos de experimentos de psiquiatria e caracterização.
Como a proliferação da química imunocítica ou ensaios de cura de feridas, ou avaliações biológicas moleculares.
