Name: an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
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DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram realizados sob as diretrizes estabelecidas pelo cuidado e uso comitê animal Institucional da Universidade de Louisville, aderindo às regulamentações federais. 1. Preparação de Baixo Ca 2+ e 2 Ca 2+ mM líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) perfusatos <ol><li> Prepare 2x baixo Ca2 + (0,1 mM) da tampão C, 2x Ca 2+ normais (2 mM) da Um tampão, tampão e 2x da B como descrito na Tabela 1. As soluções stock individuais permitem a modificação do conteúdo de iões (por exemplo, baixo ou zero Ca 2+) e pode ser armazenado a 4 ° C durante até um mês. </li><li> Para perfusão intracardíaca durante a dissecção, adicione 100 ml de 2x baixo Ca 2+ da C e 100 ml de 2x da B dentro de uma garrafa de plástico para fazer 1x baixo Ca 2+ aCSF. Misture e armazenar a noite a 4 ° C ou fazer fresco. </li><li> Para perfusão ex vivo medula espinhal durante imagção, adicionar 500 ml de 2x o normal de Ca2 + da A e 500 ml de 2x da B para um frasco de vidro de 1 L para gerar 1x ACSF. Misture e armazenar durante a noite a temperatura ambiente ou fazer fresco. </li><li> Ajustar o pH de 7,4 para buffers de aCSF. Mantendo o ACSF à temperatura ambiente, colocar a partir de Ca2 + aCSF em gelo e, em seguida, as duas soluções de bolha de gás com carbogénio (95% O2, 5% de CO 2) durante 30 min antes da utilização e durante a perfusão contínua. </li></ol> 2. Preparação de Ex Vivo Imagem Câmara <ol><li> Enrole um cobertor de aquecimento (sem desligamento automático) ao redor da garrafa aCSF e ajustar o calor para baixo configuração / médio. </li><li> Inserir uma linha dedicada de perfusão aCSF no frasco ligado a uma bomba de perfusão e aquecedor em linha que é controlada por uma sonda de temperatura bipolar controlador de temperatura e de feedback, como mostrado na Figura 1A. </li><li> Anexar um microscópio plana fase de inserção (152 x 102 mm) para o 2 fótons excitação / confocal fase microscópio equipado com um recipiente de derrame. </li><li> Coloque uma grande câmara de perfusão em banho aberto (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) para o recipiente de vazamento para acomodar e fornecer um fluxo contínuo de novo para ACSF oxigenado ex vivo da medula espinhal (ver Figura 1B para uma saída adequado vivo de imagens desenho da câmara). </li><li> Ligue a porta de saída de metal do aquecedor-line para a câmara de ex vivo de imagens usando tubulação adequada. Coloque uma almofada absorvente fina por baixo da câmara ex vivo para ajudar a manter a temperatura do tampão / tecido durante o exame. </li><li> Aderem a câmara ex vivo de imagens para o fundo da inserção recipiente derramamento / palco usando pegajoso removível. A maleabilidade do pegajoso permitirá a câmara para ser ajustado conforme necessário para garantir o percurso da luz do objectivo é perpendicular à superfície do tecido. Se necessário, use um nível alvo para ajustar a câmara. </li><li> Proteger umsonda em linha de retorno de aquecimento de temperatura perto da entrada de fluido e uma câmara de sucção do tubo de aço inoxidável ligado a uma linha de vácuo na saída da câmara. Titulares de suportes magnéticos e micropipeta adequado são úteis a este respeito. Ligue a fonte de vácuo. </li><li> Ligue a bomba de perfusão para começar a encher a câmara de imagem com aCSF oxigenado. Defina a bomba de perfusão para 1,5-2 ml por min. </li><li> Controlar o volume de aCSF no câmara de imagem, ajustando a linha de vácuo. É importante que haja suficiente ACSF na câmara de imagem para cobrir o segmento da espinal medula e permitir que a distância de trabalho suficiente entre um objectivo imersão de água e a superfície do tecido. A mielina e axônios podem ser prejudicados se o segmento de tecidos não está completamente submerso em fresco oxigenado aCSF levando artefatos induzidas experimentador. </li><li> Ajustar o controlador de temperatura do aquecedor em linha de modo a que a temperatura do perfusato na câmara de imagem é próxima da temperatura ambiente. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissecção do Adulto Murino Cervical Spinal Cord <ol><li> Eutanásia um adulto 6-10 semanas de idade Thy1 -YFP ratinho transgénico (estirpe uso apropriado que tem a expressão de proteína fluorescente em neurónios do gânglio da raiz dorsal) por injecção de uma overdose de pentobarbital a anestesia de sódio (200 mg / kg) via injecção intraperitoneal. </li><li> Uma vez sob o nível adequado de anestesia (por exemplo, nenhuma reação ao pitada toe e perda de reflexo de piscar), fazer a barba cuidadosamente a pele que recobre o cérebro ea medula espinhal com clippers cirúrgicos. Limpe a pele com betadine e 70% de etanol almofadas. </li><li> Spray de peito / área do abdômen com etanol 70%, em seguida, aspergir o assunto transcardially usando refrigerados, borbulhou-carbogen baixo Ca 2+ aCSF. (Veja a Figura 1C para sugeriu banco dissecção top configurada). </li><li> Como o fígado empalidece, fixe a agulha de perfusão para o coração usando um pequeno clip. Vire o assunto para poder ter acesso ao lado dorsal raspada deo assunto e limpe a área depilada com etanol 70%. </li><li> Fazer uma incisão na pele na linha média dorsal a partir do nariz até o quadril usando tesouras de dissecação para expor o cérebro e à coluna vertebral (Figura 2A). Fixe a preparação, colocando pinos no nariz e coxa. </li><li> Usando um microscópio de dissecção a partir deste ponto em diante, firmemente atravessam a superfície dorsal do crânio no nível dos bolbos olfactivos. Introduzir uma das pontas de tesoura para os bordos laterais da incisão e cortar ao longo das bordas da calota craniana bilateral até o cerebelo. NOTA: Não extirpar completamente a calota craniana, uma vez que é necessário mais tarde para levantar o tecido sobrejacente da medula espinhal em toda a dissecção (ver Figura 2B). </li><li> Levante a calota craniana para expor o cérebro. Com cuidado, cortar as extremidades esquerda e direita do osso interparietal (localizado no cerebelo) e puxá-lo para trás caudalmente para expor o tronco cerebral / espinal medula (Figura 2C </strong&gt;). </li><li> Utilize uma tesoura fina inclinados realizada num ângulo de 45 ° com a superfície da mesa e cortar as vértebras bilateralmente apenas inferiores aos das raízes nervosas posteriores. NOTA: Evite contato com as colunas dorsais brancas brilhantes. Estas fibras são as que irão ser espelhados (Figura 2D) e podem ser facilmente danificados. </li><li> Levantar a calota craniana e superfície dorsal da coluna vertebral com uma pinça de ponta fina, puxando o tecido sobreposta numa peça única como os cortes são feitos para expor a medula espinhal. Continuar a cortar vértebras ao nível torácico superior para isolar um segmento de 1-2 cm da coluna cervical para imagiologia subsequente (Figura 2E). </li><li> Utilize uma tesoura para cortar o tecido / osso paralela à coluna vertebral e tecido claro debaixo da coluna. Faça estes cortes o mais nivelado possível. É muito importante que o tecido encontra-se horizontalmente na câmara de modo que o cabo é para imagiologia de nível. </li><li> Use a # 11 bisturi para transecto do tronco cerebral (após oterminação das fibras fascículo grácil) e ao nível torácico superior para isolar o segmento cervical da medula espinhal (ver Figura 2F). Utilize uma tesoura para cortar o tecido / osso nestes mesmos dois pontos. O tecido isolado deve conter 2/3 da coluna vertebral, compreendendo o caudal do tronco cerebral, o alargamento do colo do útero, e na medula espinal torácica superior (Figura 2G). </li><li> Inserir a coluna vertebral isolado em uma placa de Petri de borbulhou-carbogénio, baixo Ca 2+ gelada ACSF. Se necessário, cortar o tecido embaixo da coluna vertebral até que ela fique totalmente no prato. </li><li> Transferir a coluna vertebral isolada para a câmara de imagiologia ex vivo, e aumentar gradualmente a temperatura do perfusato durante 1 hora a 36-37 ° C. Manter esta temperatura durante o exame. </li></ol> 4. Colocação de Ex Vivo Spinal Cord em Imagem Câmara e Mielina Marcando com Nile Red <ol><li> Garantir cuidadosamente a coluna vertebral na icâmara maging com uma fatia de montagem correspondente mantenha pressionado modificado com uma plataforma de rede vertical, que consiste tópicos Lycra finas (remover fios médios da plataforma de rede para permitir espaço para a medula espinhal; ver Figura 3A). </li><li> Descongelar uma aliquota de Vermelho do Nilo (5 mM em DMSO e 0,22 um filtrado; pode ser armazenada durante 1 mês a 4 ° C ou 6 meses a -20 ° C, no escuro). Assim, antes de adicionar Vermelho do Nilo para a câmara de imagiologia, reduzir o fluxo da bomba de perfusão e ajustar a linha de vácuo para garantir que o fluido na câmara de cobre sempre a medula espinhal. </li><li> Junte 5-10 ul solução estoque Vermelho do Nilo para a câmara de imagiologia perto da extremidade caudal da medula (Figura 3B). Usar uma pipeta de 1 ml para misturar suavemente Vermelho do Nilo ao longo da câmara. Permitir Nile Red para ficar em câmara para 1-2 min, em seguida, coloque linha de vácuo para trás e ajustar bomba de infusão, a 1,5-2 ml por min para perfundir continuamente a medula espinhal. </li><li> Levantar cuidadosamente o estágio do microscópioe alinhar o objectivo com o centro do segmento da espinal medula e medialmente sobre as colunas dorsais até a objectiva de imersão em água é de aproximadamente 10 mm a partir da superfície do aCSF na câmara. Use o microscópio roda foco nosepiece para trazer lentamente o objetivo para baixo até que gentilmente toca a superfície da aCSF. Use uma fonte de luz de epifluorescência para focar as colunas dorsais para o campo de visão (Figura 3C). </li></ol> 5. Ex vivo de imagens do Cordão do rato Spinal com TPLSM e induzida por laser Lesão Medular (Lisci) NOTA: A veia posterior fornece um marcador útil para centrar o tecido como as fibras fascículo grácil (originários de corpo celular de gânglios da raiz dorsal e ascender do T6 e abaixo ao longo da linha média da medula espinhal) correm em paralelo a este vaso sanguíneo. As mais grossas YFP + projeções de raiz dorsal cervical também fornecem um marcador útil como o Ascend fibras e descer lateralmente para a YPF + fascículo grácil fibras que são menores em diâmetro. <ol><li> Uma vez que o tecido da medula espinhal está alinhado de forma adequada, mude para o modo de varredura a laser realizar imagem de linha de base das fibras mielinizadas fascículo grácil ascendentes. Para excitar tanto YFP e Vermelho do Nilo, utilizar uma fonte de laser de dois fotões de comprimento de onda ajustado para 950 nm (~ 17 mW medido na saída de um 25X, 1,1 NA objectivo) e dicróicos apropriados (DM) e filtros de banda de passagem para isolar a emissão fluorescente dos fluoróforos (usamos 525/50 DM560, DM640 600/60, e 685/70, para separar YFP, Vermelho do Nilo e em amarelo-alaranjado, e canais vermelho estendidos, respectivamente). <ol><li> Se mais do que 3% dos axónios mostram esferóides axonais em imagiologia de linha de base (30-60 min), descartar a preparação devido a artefactos induzidos por experimentador. </li></ol></li><li> Induzir uma Lisci ampliando o campo de visão para 30.3X (para criar uma ablação ~ 20 um de diâmetro). Sintonizar o laser de 800 nm, e aumentar a potência do laser de 110 mW a ~a amostra. Permitir 5 campo completo de scans vista a laser para garantir fibras são completamente seccionado. </li><li> Confirme Lisci, alterando as configurações de laser de volta para as configurações de imagem (950 nm, 17 MW na amostra, 2.08X) e digitalizar o tecido para visualizar a ablação. Verificar o diâmetro da ablação e que os axónios extirpadas primárias são completamente seccionado (ver Figura 3D). Use as configurações de time-lapse no microscópio combinado com captura de z para gravar a resposta dinâmica dos axônios e mielina a lesão até 8-10 + hr após a lesão. NOTA: Se a ablação é incompleta (ie, transection incompleta de fibras), descarte a preparação, na determinação dos mecanismos de lesão primária e secundária será confundido. Além disso, isolados segmentos da medula espinhal podem ser visualizados até 24 horas pós-Lisci com apenas leve dano tecidual Lisci-independente a moderada. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Descreve-se um método de imagiologia ex vivo da medula espinal axónios mielinizados (isto é, fascículo gracile) combinada com uma lesão da medula espinal induzida por laser para estudar a progressão dinâmica de ambos degeneração axonal mielinizados primário e secundário ao longo do tempo. Ex vivo de imagens da superfície de da medula espinal supera muitas das complicações associadas com a imagem in vivo, tais como artefactos de movimento e o potencial de hipoxia induzida pelo experimentador durante as sessões de imagem prolongados. Este protocolo isola todo o segmento cervical da medula espinhal usando perfusatos oxigenados contendo baixa Ca 2+ e evita danos das fibras axonais sobrepostas, um revés comumente encontrado durante coluna dorsal ou preparações tira substância branca ventral. Além disso, ele permite que o experimentador manipular microambiente da medula espinhal isolado antes ou após a lesão da medula espinal (por exemplo, modificação de Ca 2+concentração e / ou adição de reagentes farmacêuticas). Em contraste com a transecção, contusão, ou esmagar modelos SCI que afectam uma ampla área de axónios, a natureza altamente concentrada da Lisci permite o estudo simultâneo da lesão primária (axónios transeccionados) e o dano axonal secundária que ocorre mais tarde. O ex imaging descrito vivo e protocolo Lisci podem ser utilizados para investigar outros componentes da lesão da substância branca incluindo a desmielinização, neuroinflammation induzida pelo CNS-residentes células do sistema imunológico, incluindo microglia, e mecanismos de lesão anóxica / isquêmicos. Esses estudos também poderia incidir sobre os axônios coluna dorsal como no protocolo ou modificações atual poderia ser feito à imagem de outros tratos de substância branca da coluna vertebral localizados superficialmente. Além disso, outras linhagens de camundongos transgênicos transgênicos ou duplas também pode ser utilizado com este protocolo para estudo de ativação / atividades das células do SNC-residentes. Existem vários con críticaconsiderações para o isolamento bem sucedido de imagem e de um murino ex vivo da medula espinal. Em primeiro lugar, os tampões aCSF precisam ser mantidos oxigenado para prevenir a hipoxia. A medula espinhal devem ser mantidas húmidas por ser submergido no ACSF oxigenado, durante e após o isolamento. Durante a dissecção, é melhor para minimizar o estresse mecânico sobre a medula espinhal, como a pressão excessiva de puxar para trás o tecido sobreposto com muita força e alongamento / flexão da medula espinhal ao limpar o tecido embaixo do segmento da coluna vertebral. Além disso, é crucial para nunca tocar / comprimir as colunas posterior da medula. Mantendo a temperatura óptima perfusato ACSF na câmara de imagem também é importante uma vez que um ambiente hipertérmico pode realçar o tecido da medula espinal. Para assegurar que os axónios são completamente seccionada durante Lisci, é importante imobilizar o segmento de tecido na câmara ex vivo para minimizar o movimento do tecido durante o potencial de laser ablatde iões. Além disso, o tecido no local de ablação desejado deve estar nivelado na câmara de imagem (perpendicular à lente objetiva). Lisci executada em tecido que não é nível leva a uma ablação inclinado que dificulta análise de imagem posterior e diminui a clareza geral da imagem. Por fim, a profundidade do tecido da ablação por laser pode afectar os resultados Lisci. É recomendável configurar o ponto focal para a ablação de ser em torno de 12-15 mm abaixo da pia-máter. Um grande limitação para a utilização deste modelo ex vivo para examinar os mecanismos de axónios e lesão da mielina é que os efeitos de células derivadas do sangue periférico seguintes Lisci não pode ser determinada. Além disso, uma vez que este é um modelo de terminal, os resultados comportamentais e regeneração após a lesão não pode ser avaliada. Uma restrição a este modelo de imagiologia ex vivo Lisci que é partilhada com a imagem in vivo é a profundidade que é capaz de ser resolvido devido à luz forte scattering propriedades da matéria branca da medula espinal. Assim, este modelo de imagiologia ex vivo da medula espinal centra-se principalmente sobre as projecções centrais ascendente a partir dos neurónios sensoriais do gânglio da raiz dorsal, que são as fibras mais acessíveis para visualizar uma vez que estão localizados ao longo da superfície dorsal da medula espinhal. Outros setores axonais mielinizadas, como descendente axônios motores podem reagir de forma diferente após a lesão em comparação com os axônios sensitivos ascendentes documentados neste protocolo. Outra limitação comum para imagiologia in vivo e com o nosso protocolo ex vivo é a duração de imagem. Enquanto este método ex vivo é um excelente meio de estudar mecanismos de lesão aguda, alterações axonais longitudinais imagem de longo prazo, no mesmo segmento de tecidos ex vivo pode ser inviável. Nós normalmente a imagem isolado tecido da medula espinhal para 6-10 horas após Lisci sem qualquer dano notável tecido Lisci-independente; No entanto, nós ter imaginado um segmento da medula espinhalaté 24 horas pós-Lisci apenas com a degradação do tecido moderada sem relação com a lesão induzida. No entanto, se um segmento da espinal medula foi fotografada por longos períodos de tempo, não seria inevitavelmente alguma degradação de tecido que é independente da ablação por laser. Apesar destas limitações em nosso ex vivo medula espinhal modelo Lisci proposto, o conhecimento que pode ser adquirida a partir desta ex vivo de imagens da medula espinhal e modelo Lisci -do romance capacidade de distinguir entre a lesão primária e lesão secundária em tempo real para avaliar a eficácia de reagentes farmacêuticos e manipulações ambientais após injury- pode render uma visão valiosa sobre os mecanismos da axonal dinâmica e respostas mielina após lesão.

A degeneração de axônios é uma causa importante de morbidade abrangendo várias condições neurológicas, incluindo neurotrauma, acidente vascular cerebral, auto-imune, e doenças neurodegenerativas. Ao contrário do sistema nervoso periférico (SNP), sistema nervoso central (SNC) axónios têm uma capacidade limitada para se regenerar uma vez feridas devido a ambas as barreiras intrínsecos e extrínsecos (isto é, moléculas inibidoras do crescimento axonal produzido durante a formação de cicatriz e libertado durante a degeneração da mielina) 1 -7. Embora várias dessas barreiras foram amplamente exploradas, intervenções terapêuticas destinadas a prevenir a degeneração axonal CNS, promover a regeneração axonal robusta, e restaurar connectively funcional, permanecem limitados. Axónios uma vez separados do soma passam por um processo de degeneração estereotipada conhecida como degeneração Wallerina que é caracterizado pela presença de edema axonal, formação esferóide fragmentação e eventual (revistos em 8). Emcontraste, o coto proximal que permanece em continuidade com a soma de um axônio periférico seccionado, forma um inchaço no seu fim, morre de volta ao nó mais próximo de Ranvier, e pode, então, iniciar o crescimento do cone formação, um pré-requisito vital necessário para posterior regeneração axonal 9-11. Em contraste, as terminações axonais proximais dos axónios muitas centrais formam característicos &quot;endbulbs&quot; ou lâmpadas de retracção, não conseguem formar cones de crescimento, e em vez retrair para longe do local da lesão, onde permanecem durante meses após a lesão 12-15. Além da lesão axonal primária, axonal dano / perda adicional também pode ocorrer a axônios que foram em grande parte poupadas da lesão inicial. Esta perda axonal atrasado de axônios inicialmente poupado é referida à degeneração axonal como secundário. Esta resposta inerente de axônios do SNC a lesão torna a regeneração axonal funcional uma meta ainda mais difícil de conseguir no cérebro e na medula espinhal. Embora hallmarks de lesão axonal (por exemplo, a formação de esferóide, lâmpadas de retração) foram bem caracterizados a partir de tecido post-mortem e modelos experimentais de degeneração axonal, elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes a esses processos dinâmicos foi restringido. A maioria desses estudos se baseou em observações ponto final estático que, inerentemente, não conseguiu captar respostas axonal individuais ao longo do tempo. Embora exogenamente aplicado marcadores axonais ter sido útil para elucidar respostas axonal das seções estáticas e durante o exame ao vivo, a disponibilidade de marcadores axonais geneticamente codificados tem melhorado muito a nossa capacidade de visualizar os axônios em tempo real por meio de microscopia de fluorescência. De fato, um relatório seminal de Kerschensteiner e colegas fornecida primeira evidência direta de degeneração axonal e regeneração in vivo utilizando camundongos Thy1 -GFP-S que codificam a proteína verde fluorescente em subconjuntos de neurônios que enviam suas projeções nas colunas dorsais da medulacabo de 16. Imagens ao vivo abordagens por microscopia de varredura a laser photon dois (TPLSM) e rotulagem proteína fluorescente genético das células de interesse continua a fornecer evidências diretas e visão mecanicista em muitas e diversas processos dinâmicos como a degeneração axonal, Ca 2+ sinalização, a regeneração axonal, fisiologia astrócitos, fisiologia microglial, e resposta à lesão 17-25. Em contraste com os axónios, muito pouco se sabe sobre as respostas à lesão da mielina em tempo real. A mielina é um componente vital da matéria branca produzido e mantido por oligodendrócitos nas células do SNC e de Schwann no PNS. Mielina protege 99% da superfície de axônios e fazendo assim fornece uma alta resistência, revestimento protector baixa capacitância que suporta propagação do impulso saltatory rápida e eficiente, recentemente revisado por Buttermore et al. 26. Para capturar a resposta dinâmica da mielina a lesão usamos o solvatocrômico, lipofílicocorante fluorescente Vermelho de Nilo 27. As propriedades solvatocrômicos deste corante vital permitir mudanças de espectro de seu espectro de emissão que é dependente do ambiente físico-química 28,29. Estas propriedades são úteis para obter insights sobre os mecanismos de lesão axomyelinic e pode ser visualizada usando dichroics devidamente seleccionados, filtros de emissão ou resolvidos usando microscopia espectral 27. Por exemplo, o espectro de emissão do vermelho do Nilo é azul-deslocada em ambientes ricos em lípidos menos polares, tais como aqueles encontrados nos adipócitos e mielina do SNC normal (pico de emissão ~ 580-590 nm) 27. Em contraste, o espectro da emissão deste corante vital em ~ 625 nm em endbulbs formados como axônios passam por perecimento axonal 27. Embora os mecanismos precisos subjacentes a estas mudanças de espectro especificamente em endbulbs contra mielina normais permanecem obscuros, tais mudanças espectrais pode revelar alterações subjacentes na acumulação de proteínas ou desorganização levando aexposição de sítios de ligação hidrofóbicos 27. Enquanto a imagem in vivo é a métrica final para observar medula espinhal dinâmica lesão axonal em seu ambiente nativo, é tecnicamente desafiador e requer perícia cirúrgica substancial, e muitas vezes repetir cirurgias para expor a coluna dorsal que pode introduzir artefatos experimentais (por exemplo, inflamação e cicatriz formação). Além disso, o equipamento caro é muitas vezes necessário para permitir que a suspensão e o posicionamento de um animal intacto sob a lente objectiva de microscópio. Os animais devem ser cuidadosamente monitorados, bem como para garantir que eles permaneçam quentes, para garantir fluidos são reabastecidos, e para garantir que não há sinais de hipóxia por sessões de imagem anestesiados prolongados. Este último é extremamente importante como axónios e mielina requerem absolutamente constante de perfusão e os níveis de oxigénio adequados para permanecerem viáveis. No entanto, isso muitas vezes não é relatado ou monitorados em mais estudos in vivo paradata. Além disso, os artefatos de movimento, devido à freqüência cardíaca e respiração (anestesia inalatória adulto mouse: ~ 300-450 batimentos por minuto (BPM) é ideal para manter a 97-98% de saturação de oxigênio (normal taxa de ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respirações por min (taxa normal é de ~ 163 respirações por minuto), respectivamente)) 30 encontrados durante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de fluorescência alta resolução desafio, até mesmo as varreduras a laser mais rápidos inevitavelmente estão sujeitas a estes movimentos artefatos. Avanços na ultra-rápidos scanners de ressonância combinados com uma janela vertebral rígida implantável enquadrado pode permitir imaging da medula espinhal murino em animais acordados, mas os tempos mais rápidos de digitalização inevitavelmente reduzir a relação sinal-ruído qualidade de imagem degradante. Outras melhorias nas técnicas de imagem da medula espinhal como actualmente utilizados para exames de imagem cerebral pode superar muitos desses obstáculos e limitar os potenciais fatores de confusão introduzidas pela inaperfusão tecidual dequate, por exemplo, 31-33. Muito do que se sabe sobre a fisiologia da substância branca e mecanismos de lesão substância branca foi determinado utilizando in vitro ou ex vivo preparações de substância branca do nervo óptico, nervo periférico, e as tiras de medula espinhal substância branca 34-41. Estas preparações continuar a aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de lesão da substância branca como eles permitem variações dos fatores ambientais, a aplicação controlada de medicamentos e reagentes, avaliações funcionais usando eletrofisiologia, e observações diretas microscopia de fluorescência dos axônios e mielina em tecidos vivos controlada. No entanto, algumas abordagens anteriores para observar axônios de cordão espinhal tiras de coluna dorsal ou tiras de substância branca ventral inevitavelmente ferir axônios de superfície durante a fase de remoção que pode influenciar a resposta dos axônios de perto opostos. Para capitalizar sobre as manipulações experimentais acima e evitar danos ao vefibras ry sob investigação, utilizamos um modelo da medula espinhal cervical ex vivo em que evita o contato direto do aspecto dorsal da medula. Assim, a arquitetura da pia-máter e axônios da coluna dorsal superficial adjacentes permanecem viáveis ​​e imperturbável durante o isolamento. Aqui nós descrevemos uma abordagem relativamente simples, que permite a visualização direta de axônios mielinizados centrais como eles respondem dinamicamente a uma lesão focal em tempo real até 8 - 10+ horas após a lesão. A lesão medular modelo induzido por laser (Lisci) permite a diferenciação entre os mecanismos de lesão axonal primário e secundário como a lesão primária (local de ablação) permanece espacialmente restritos ao longo do tempo. A câmara de imagem-banho aberto é acessível a intervenção terapêutica, de fornecimento de reagentes, e manipulações ambientais. Agentes protetores axomyelinic putativos pode ser rapidamente avaliado em tempo real através de observações diretas contra experiências longas e custosas que envolvam processo tecidoing, seccionamento, immunostaining, captura de imagem, e análise e, portanto, fornece um modelo substituto útil para avaliar as respostas agudas e manipulações de proteção antes de testar os agentes experimentais em animais vivos.

<table><tbody><tr><td>Large bath chamber with slice supports</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Standard Slice Supports</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Solution In-line heater/cooler</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Liquid Cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Cable assembly for heater controllers</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Magnetic holder with suction tubing</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH-S</td><td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adjustable holder</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH</td><td>To hold the temperature probe</td></tr><tr><td>clear silicone sealant</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>superglue</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>thin plexiglass strips</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>nile red</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>For labeling myelin</td></tr></tbody></table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Axónios do SNC lesionados e não conseguem regenerar frequentemente retrair para longe do local da lesão. Os axônios poupados da lesão inicial pode depois sofrer degeneração axonal secundária. A falta de formação do cone de crescimento, regeneração, e a perda de projecções axonais mielinizadas adicionais no interior da medula espinal limita grandemente a recuperação neurológica após lesão. Para avaliar como centro de axônios mielinizados da medula espinhal responder a lesão, foi desenvolvido um modelo ex vivo vivendo medular utilizando camundongos transgênicos que expressam a proteína fluorescente amarela em axônios e um focal e altamente reprodutível induzida por laser lesão medular para documentar o destino de axônios e mielina (corante fluorescente lipofílico Nile Red) ao longo do tempo, através de microscopia de excitação de lapso de tempo de dois fótons. Processos dinâmicos como a lesão axonal aguda, retração axonal, e mielina degeneração são melhor estudadas em tempo real. No entanto, a natureza não-focal de lesões à base de contusão e artefatos de movimento encontradodurante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de alta resolução desafiador. O modelo ex vivo medula espinhal descrito aqui imita vários aspectos da contusão / induzida por compressão patologias axonal clinicamente relevantes, incluindo inchaço axonal, formação esferóide, transection axonal e peri-axonal inchaço fornecer um modelo útil para estudar esses processos dinâmicos em tempo real. As principais vantagens deste modelo são excelente resolução espaço-temporal que permite a diferenciação entre o insulto primário que fere diretamente os axônios e mecanismos de lesão secundária; perfusão controlada de reagentes directamente para o banho de perfusato o cabo; alterações precisas do meio ambiente (por exemplo, cálcio, íons de sódio, os contribuintes conhecidos lesão axonal, mas quase impossível de manipular in vivo); e modelos murinos também oferecem uma vantagem uma vez que proporcionam uma oportunidade de visualizar emanipular geneticamente populações celulares identificadas e estruturas subcelulares. Aqui, descrevemos como isolar e imagem da medula espinhal de ratos vivendo para capturar a dinâmica de lesão axonal aguda.

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K visualizações.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neurociência

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirurgia de cerebelo axônios<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imagem Intravital de axonais Interações com Microglia e macrófagos em um mouse Dorsal Coluna lesão por esmagamento

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Fototrombose induzida por isquemia focal como um Modelo de Lesão Medular em Ratos

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Medicina

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Um Vivo em Método de dupla-cor de imagem dinâmica Vascular após lesão da medula espinhal Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

Avaliação em tempo real da microperfusão da medula espinhal em um modelo suíno de isquemia/reperfusão

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

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