DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram realizados sob as diretrizes estabelecidas pelo cuidado e uso comitê animal Institucional da Universidade de Louisville, aderindo às regulamentações federais. 1. Preparação de Baixo Ca 2+ e 2 Ca 2+ mM líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) perfusatos <ol><li> Prepare 2x baixo Ca2 + (0,1 mM) da tampão C, 2x Ca 2+ normais (2 mM) da Um tampão, tampão e 2x da B como descrito na Tabela 1. As soluções stock individuais permitem a modificação do conteúdo de iões (por exemplo, baixo ou zero Ca 2+) e pode ser armazenado a 4 ° C durante até um mês. </li><li> Para perfusão intracardíaca durante a dissecção, adicione 100 ml de 2x baixo Ca 2+ da C e 100 ml de 2x da B dentro de uma garrafa de plástico para fazer 1x baixo Ca 2+ aCSF. Misture e armazenar a noite a 4 ° C ou fazer fresco. </li><li> Para perfusão ex vivo medula espinhal durante imagção, adicionar 500 ml de 2x o normal de Ca2 + da A e 500 ml de 2x da B para um frasco de vidro de 1 L para gerar 1x ACSF. Misture e armazenar durante a noite a temperatura ambiente ou fazer fresco. </li><li> Ajustar o pH de 7,4 para buffers de aCSF. Mantendo o ACSF à temperatura ambiente, colocar a partir de Ca2 + aCSF em gelo e, em seguida, as duas soluções de bolha de gás com carbogénio (95% O2, 5% de CO 2) durante 30 min antes da utilização e durante a perfusão contínua. </li></ol> 2. Preparação de Ex Vivo Imagem Câmara <ol><li> Enrole um cobertor de aquecimento (sem desligamento automático) ao redor da garrafa aCSF e ajustar o calor para baixo configuração / médio. </li><li> Inserir uma linha dedicada de perfusão aCSF no frasco ligado a uma bomba de perfusão e aquecedor em linha que é controlada por uma sonda de temperatura bipolar controlador de temperatura e de feedback, como mostrado na Figura 1A. </li><li> Anexar um microscópio plana fase de inserção (152 x 102 mm) para o 2 fótons excitação / confocal fase microscópio equipado com um recipiente de derrame. </li><li> Coloque uma grande câmara de perfusão em banho aberto (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) para o recipiente de vazamento para acomodar e fornecer um fluxo contínuo de novo para ACSF oxigenado ex vivo da medula espinhal (ver Figura 1B para uma saída adequado vivo de imagens desenho da câmara). </li><li> Ligue a porta de saída de metal do aquecedor-line para a câmara de ex vivo de imagens usando tubulação adequada. Coloque uma almofada absorvente fina por baixo da câmara ex vivo para ajudar a manter a temperatura do tampão / tecido durante o exame. </li><li> Aderem a câmara ex vivo de imagens para o fundo da inserção recipiente derramamento / palco usando pegajoso removível. A maleabilidade do pegajoso permitirá a câmara para ser ajustado conforme necessário para garantir o percurso da luz do objectivo é perpendicular à superfície do tecido. Se necessário, use um nível alvo para ajustar a câmara. </li><li> Proteger umsonda em linha de retorno de aquecimento de temperatura perto da entrada de fluido e uma câmara de sucção do tubo de aço inoxidável ligado a uma linha de vácuo na saída da câmara. Titulares de suportes magnéticos e micropipeta adequado são úteis a este respeito. Ligue a fonte de vácuo. </li><li> Ligue a bomba de perfusão para começar a encher a câmara de imagem com aCSF oxigenado. Defina a bomba de perfusão para 1,5-2 ml por min. </li><li> Controlar o volume de aCSF no câmara de imagem, ajustando a linha de vácuo. É importante que haja suficiente ACSF na câmara de imagem para cobrir o segmento da espinal medula e permitir que a distância de trabalho suficiente entre um objectivo imersão de água e a superfície do tecido. A mielina e axônios podem ser prejudicados se o segmento de tecidos não está completamente submerso em fresco oxigenado aCSF levando artefatos induzidas experimentador. </li><li> Ajustar o controlador de temperatura do aquecedor em linha de modo a que a temperatura do perfusato na câmara de imagem é próxima da temperatura ambiente. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissecção do Adulto Murino Cervical Spinal Cord <ol><li> Eutanásia um adulto 6-10 semanas de idade Thy1 -YFP ratinho transgénico (estirpe uso apropriado que tem a expressão de proteína fluorescente em neurónios do gânglio da raiz dorsal) por injecção de uma overdose de pentobarbital a anestesia de sódio (200 mg / kg) via injecção intraperitoneal. </li><li> Uma vez sob o nível adequado de anestesia (por exemplo, nenhuma reação ao pitada toe e perda de reflexo de piscar), fazer a barba cuidadosamente a pele que recobre o cérebro ea medula espinhal com clippers cirúrgicos. Limpe a pele com betadine e 70% de etanol almofadas. </li><li> Spray de peito / área do abdômen com etanol 70%, em seguida, aspergir o assunto transcardially usando refrigerados, borbulhou-carbogen baixo Ca 2+ aCSF. (Veja a Figura 1C para sugeriu banco dissecção top configurada). </li><li> Como o fígado empalidece, fixe a agulha de perfusão para o coração usando um pequeno clip. Vire o assunto para poder ter acesso ao lado dorsal raspada deo assunto e limpe a área depilada com etanol 70%. </li><li> Fazer uma incisão na pele na linha média dorsal a partir do nariz até o quadril usando tesouras de dissecação para expor o cérebro e à coluna vertebral (Figura 2A). Fixe a preparação, colocando pinos no nariz e coxa. </li><li> Usando um microscópio de dissecção a partir deste ponto em diante, firmemente atravessam a superfície dorsal do crânio no nível dos bolbos olfactivos. Introduzir uma das pontas de tesoura para os bordos laterais da incisão e cortar ao longo das bordas da calota craniana bilateral até o cerebelo. NOTA: Não extirpar completamente a calota craniana, uma vez que é necessário mais tarde para levantar o tecido sobrejacente da medula espinhal em toda a dissecção (ver Figura 2B). </li><li> Levante a calota craniana para expor o cérebro. Com cuidado, cortar as extremidades esquerda e direita do osso interparietal (localizado no cerebelo) e puxá-lo para trás caudalmente para expor o tronco cerebral / espinal medula (Figura 2C </strong&gt;). </li><li> Utilize uma tesoura fina inclinados realizada num ângulo de 45 ° com a superfície da mesa e cortar as vértebras bilateralmente apenas inferiores aos das raízes nervosas posteriores. NOTA: Evite contato com as colunas dorsais brancas brilhantes. Estas fibras são as que irão ser espelhados (Figura 2D) e podem ser facilmente danificados. </li><li> Levantar a calota craniana e superfície dorsal da coluna vertebral com uma pinça de ponta fina, puxando o tecido sobreposta numa peça única como os cortes são feitos para expor a medula espinhal. Continuar a cortar vértebras ao nível torácico superior para isolar um segmento de 1-2 cm da coluna cervical para imagiologia subsequente (Figura 2E). </li><li> Utilize uma tesoura para cortar o tecido / osso paralela à coluna vertebral e tecido claro debaixo da coluna. Faça estes cortes o mais nivelado possível. É muito importante que o tecido encontra-se horizontalmente na câmara de modo que o cabo é para imagiologia de nível. </li><li> Use a # 11 bisturi para transecto do tronco cerebral (após oterminação das fibras fascículo grácil) e ao nível torácico superior para isolar o segmento cervical da medula espinhal (ver Figura 2F). Utilize uma tesoura para cortar o tecido / osso nestes mesmos dois pontos. O tecido isolado deve conter 2/3 da coluna vertebral, compreendendo o caudal do tronco cerebral, o alargamento do colo do útero, e na medula espinal torácica superior (Figura 2G). </li><li> Inserir a coluna vertebral isolado em uma placa de Petri de borbulhou-carbogénio, baixo Ca 2+ gelada ACSF. Se necessário, cortar o tecido embaixo da coluna vertebral até que ela fique totalmente no prato. </li><li> Transferir a coluna vertebral isolada para a câmara de imagiologia ex vivo, e aumentar gradualmente a temperatura do perfusato durante 1 hora a 36-37 ° C. Manter esta temperatura durante o exame. </li></ol> 4. Colocação de Ex Vivo Spinal Cord em Imagem Câmara e Mielina Marcando com Nile Red <ol><li> Garantir cuidadosamente a coluna vertebral na icâmara maging com uma fatia de montagem correspondente mantenha pressionado modificado com uma plataforma de rede vertical, que consiste tópicos Lycra finas (remover fios médios da plataforma de rede para permitir espaço para a medula espinhal; ver Figura 3A). </li><li> Descongelar uma aliquota de Vermelho do Nilo (5 mM em DMSO e 0,22 um filtrado; pode ser armazenada durante 1 mês a 4 ° C ou 6 meses a -20 ° C, no escuro). Assim, antes de adicionar Vermelho do Nilo para a câmara de imagiologia, reduzir o fluxo da bomba de perfusão e ajustar a linha de vácuo para garantir que o fluido na câmara de cobre sempre a medula espinhal. </li><li> Junte 5-10 ul solução estoque Vermelho do Nilo para a câmara de imagiologia perto da extremidade caudal da medula (Figura 3B). Usar uma pipeta de 1 ml para misturar suavemente Vermelho do Nilo ao longo da câmara. Permitir Nile Red para ficar em câmara para 1-2 min, em seguida, coloque linha de vácuo para trás e ajustar bomba de infusão, a 1,5-2 ml por min para perfundir continuamente a medula espinhal. </li><li> Levantar cuidadosamente o estágio do microscópioe alinhar o objectivo com o centro do segmento da espinal medula e medialmente sobre as colunas dorsais até a objectiva de imersão em água é de aproximadamente 10 mm a partir da superfície do aCSF na câmara. Use o microscópio roda foco nosepiece para trazer lentamente o objetivo para baixo até que gentilmente toca a superfície da aCSF. Use uma fonte de luz de epifluorescência para focar as colunas dorsais para o campo de visão (Figura 3C). </li></ol> 5. Ex vivo de imagens do Cordão do rato Spinal com TPLSM e induzida por laser Lesão Medular (Lisci) NOTA: A veia posterior fornece um marcador útil para centrar o tecido como as fibras fascículo grácil (originários de corpo celular de gânglios da raiz dorsal e ascender do T6 e abaixo ao longo da linha média da medula espinhal) correm em paralelo a este vaso sanguíneo. As mais grossas YFP + projeções de raiz dorsal cervical também fornecem um marcador útil como o Ascend fibras e descer lateralmente para a YPF + fascículo grácil fibras que são menores em diâmetro. <ol><li> Uma vez que o tecido da medula espinhal está alinhado de forma adequada, mude para o modo de varredura a laser realizar imagem de linha de base das fibras mielinizadas fascículo grácil ascendentes. Para excitar tanto YFP e Vermelho do Nilo, utilizar uma fonte de laser de dois fotões de comprimento de onda ajustado para 950 nm (~ 17 mW medido na saída de um 25X, 1,1 NA objectivo) e dicróicos apropriados (DM) e filtros de banda de passagem para isolar a emissão fluorescente dos fluoróforos (usamos 525/50 DM560, DM640 600/60, e 685/70, para separar YFP, Vermelho do Nilo e em amarelo-alaranjado, e canais vermelho estendidos, respectivamente). <ol><li> Se mais do que 3% dos axónios mostram esferóides axonais em imagiologia de linha de base (30-60 min), descartar a preparação devido a artefactos induzidos por experimentador. </li></ol></li><li> Induzir uma Lisci ampliando o campo de visão para 30.3X (para criar uma ablação ~ 20 um de diâmetro). Sintonizar o laser de 800 nm, e aumentar a potência do laser de 110 mW a ~a amostra. Permitir 5 campo completo de scans vista a laser para garantir fibras são completamente seccionado. </li><li> Confirme Lisci, alterando as configurações de laser de volta para as configurações de imagem (950 nm, 17 MW na amostra, 2.08X) e digitalizar o tecido para visualizar a ablação. Verificar o diâmetro da ablação e que os axónios extirpadas primárias são completamente seccionado (ver Figura 3D). Use as configurações de time-lapse no microscópio combinado com captura de z para gravar a resposta dinâmica dos axônios e mielina a lesão até 8-10 + hr após a lesão. NOTA: Se a ablação é incompleta (ie, transection incompleta de fibras), descarte a preparação, na determinação dos mecanismos de lesão primária e secundária será confundido. Além disso, isolados segmentos da medula espinhal podem ser visualizados até 24 horas pós-Lisci com apenas leve dano tecidual Lisci-independente a moderada. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks.">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li><li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+injury+to+axons+and+myelin.">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li><li>Matute, C., Ransom, B. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Descreve-se um método de imagiologia ex vivo da medula espinal axónios mielinizados (isto é, fascículo gracile) combinada com uma lesão da medula espinal induzida por laser para estudar a progressão dinâmica de ambos degeneração axonal mielinizados primário e secundário ao longo do tempo. Ex vivo de imagens da superfície de da medula espinal supera muitas das complicações associadas com a imagem in vivo, tais como artefactos de movimento e o potencial de hipoxia...

A degeneração de axônios é uma causa importante de morbidade abrangendo várias condições neurológicas, incluindo neurotrauma, acidente vascular cerebral, auto-imune, e doenças neurodegenerativas. Ao contrário do sistema nervoso periférico (SNP), sistema nervoso central (SNC) axónios têm uma capacidade limitada para se regenerar uma vez feridas devido a ambas as barreiras intrínsecos e extrínsecos (isto é, moléculas inibidoras do crescimento axonal produzido durante a formação de cicatriz e libertado durante a degeneração da mielina) 1 -7. Embora várias dessas barreiras foram amplamente exploradas, intervenções terapêuticas destinadas a prevenir a degeneração axonal CNS, promover a regeneração axonal robusta, e restaurar connectively funcional, permanecem limitados. Axónios uma vez separados do soma passam por um processo de degeneração estereotipada conhecida como degeneração Wallerina que é caracterizado pela presença de edema axonal, formação esferóide fragmentação e eventual (revistos em 8). Emcontraste, o coto proximal que permanece em continuidade com a soma de um axônio periférico seccionado, forma um inchaço no seu fim, morre de volta ao nó mais próximo de Ranvier, e pode, então, iniciar o crescimento do cone formação, um pré-requisito vital necessário para posterior regeneração axonal 9-11. Em contraste, as terminações axonais proximais dos axónios muitas centrais formam característicos &quot;endbulbs&quot; ou lâmpadas de retracção, não conseguem formar cones de crescimento, e em vez retrair para longe do local da lesão, onde permanecem durante meses após a lesão 12-15. Além da lesão axonal primária, axonal dano / perda adicional também pode ocorrer a axônios que foram em grande parte poupadas da lesão inicial. Esta perda axonal atrasado de axônios inicialmente poupado é referida à degeneração axonal como secundário. Esta resposta inerente de axônios do SNC a lesão torna a regeneração axonal funcional uma meta ainda mais difícil de conseguir no cérebro e na medula espinhal. Embora hallmarks de lesão axonal (por exemplo, a formação de esferóide, lâmpadas de retração) foram bem caracterizados a partir de tecido post-mortem e modelos experimentais de degeneração axonal, elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes a esses processos dinâmicos foi restringido. A maioria desses estudos se baseou em observações ponto final estático que, inerentemente, não conseguiu captar respostas axonal individuais ao longo do tempo. Embora exogenamente aplicado marcadores axonais ter sido útil para elucidar respostas axonal das seções estáticas e durante o exame ao vivo, a disponibilidade de marcadores axonais geneticamente codificados tem melhorado muito a nossa capacidade de visualizar os axônios em tempo real por meio de microscopia de fluorescência. De fato, um relatório seminal de Kerschensteiner e colegas fornecida primeira evidência direta de degeneração axonal e regeneração in vivo utilizando camundongos Thy1 -GFP-S que codificam a proteína verde fluorescente em subconjuntos de neurônios que enviam suas projeções nas colunas dorsais da medulacabo de 16. Imagens ao vivo abordagens por microscopia de varredura a laser photon dois (TPLSM) e rotulagem proteína fluorescente genético das células de interesse continua a fornecer evidências diretas e visão mecanicista em muitas e diversas processos dinâmicos como a degeneração axonal, Ca 2+ sinalização, a regeneração axonal, fisiologia astrócitos, fisiologia microglial, e resposta à lesão 17-25. Em contraste com os axónios, muito pouco se sabe sobre as respostas à lesão da mielina em tempo real. A mielina é um componente vital da matéria branca produzido e mantido por oligodendrócitos nas células do SNC e de Schwann no PNS. Mielina protege 99% da superfície de axônios e fazendo assim fornece uma alta resistência, revestimento protector baixa capacitância que suporta propagação do impulso saltatory rápida e eficiente, recentemente revisado por Buttermore et al. 26. Para capturar a resposta dinâmica da mielina a lesão usamos o solvatocrômico, lipofílicocorante fluorescente Vermelho de Nilo 27. As propriedades solvatocrômicos deste corante vital permitir mudanças de espectro de seu espectro de emissão que é dependente do ambiente físico-química 28,29. Estas propriedades são úteis para obter insights sobre os mecanismos de lesão axomyelinic e pode ser visualizada usando dichroics devidamente seleccionados, filtros de emissão ou resolvidos usando microscopia espectral 27. Por exemplo, o espectro de emissão do vermelho do Nilo é azul-deslocada em ambientes ricos em lípidos menos polares, tais como aqueles encontrados nos adipócitos e mielina do SNC normal (pico de emissão ~ 580-590 nm) 27. Em contraste, o espectro da emissão deste corante vital em ~ 625 nm em endbulbs formados como axônios passam por perecimento axonal 27. Embora os mecanismos precisos subjacentes a estas mudanças de espectro especificamente em endbulbs contra mielina normais permanecem obscuros, tais mudanças espectrais pode revelar alterações subjacentes na acumulação de proteínas ou desorganização levando aexposição de sítios de ligação hidrofóbicos 27. Enquanto a imagem in vivo é a métrica final para observar medula espinhal dinâmica lesão axonal em seu ambiente nativo, é tecnicamente desafiador e requer perícia cirúrgica substancial, e muitas vezes repetir cirurgias para expor a coluna dorsal que pode introduzir artefatos experimentais (por exemplo, inflamação e cicatriz formação). Além disso, o equipamento caro é muitas vezes necessário para permitir que a suspensão e o posicionamento de um animal intacto sob a lente objectiva de microscópio. Os animais devem ser cuidadosamente monitorados, bem como para garantir que eles permaneçam quentes, para garantir fluidos são reabastecidos, e para garantir que não há sinais de hipóxia por sessões de imagem anestesiados prolongados. Este último é extremamente importante como axónios e mielina requerem absolutamente constante de perfusão e os níveis de oxigénio adequados para permanecerem viáveis. No entanto, isso muitas vezes não é relatado ou monitorados em mais estudos in vivo paradata. Além disso, os artefatos de movimento, devido à freqüência cardíaca e respiração (anestesia inalatória adulto mouse: ~ 300-450 batimentos por minuto (BPM) é ideal para manter a 97-98% de saturação de oxigênio (normal taxa de ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respirações por min (taxa normal é de ~ 163 respirações por minuto), respectivamente)) 30 encontrados durante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de fluorescência alta resolução desafio, até mesmo as varreduras a laser mais rápidos inevitavelmente estão sujeitas a estes movimentos artefatos. Avanços na ultra-rápidos scanners de ressonância combinados com uma janela vertebral rígida implantável enquadrado pode permitir imaging da medula espinhal murino em animais acordados, mas os tempos mais rápidos de digitalização inevitavelmente reduzir a relação sinal-ruído qualidade de imagem degradante. Outras melhorias nas técnicas de imagem da medula espinhal como actualmente utilizados para exames de imagem cerebral pode superar muitos desses obstáculos e limitar os potenciais fatores de confusão introduzidas pela inaperfusão tecidual dequate, por exemplo, 31-33. Muito do que se sabe sobre a fisiologia da substância branca e mecanismos de lesão substância branca foi determinado utilizando in vitro ou ex vivo preparações de substância branca do nervo óptico, nervo periférico, e as tiras de medula espinhal substância branca 34-41. Estas preparações continuar a aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de lesão da substância branca como eles permitem variações dos fatores ambientais, a aplicação controlada de medicamentos e reagentes, avaliações funcionais usando eletrofisiologia, e observações diretas microscopia de fluorescência dos axônios e mielina em tecidos vivos controlada. No entanto, algumas abordagens anteriores para observar axônios de cordão espinhal tiras de coluna dorsal ou tiras de substância branca ventral inevitavelmente ferir axônios de superfície durante a fase de remoção que pode influenciar a resposta dos axônios de perto opostos. Para capitalizar sobre as manipulações experimentais acima e evitar danos ao vefibras ry sob investigação, utilizamos um modelo da medula espinhal cervical ex vivo em que evita o contato direto do aspecto dorsal da medula. Assim, a arquitetura da pia-máter e axônios da coluna dorsal superficial adjacentes permanecem viáveis ​​e imperturbável durante o isolamento. Aqui nós descrevemos uma abordagem relativamente simples, que permite a visualização direta de axônios mielinizados centrais como eles respondem dinamicamente a uma lesão focal em tempo real até 8 - 10+ horas após a lesão. A lesão medular modelo induzido por laser (Lisci) permite a diferenciação entre os mecanismos de lesão axonal primário e secundário como a lesão primária (local de ablação) permanece espacialmente restritos ao longo do tempo. A câmara de imagem-banho aberto é acessível a intervenção terapêutica, de fornecimento de reagentes, e manipulações ambientais. Agentes protetores axomyelinic putativos pode ser rapidamente avaliado em tempo real através de observações diretas contra experiências longas e custosas que envolvam processo tecidoing, seccionamento, immunostaining, captura de imagem, e análise e, portanto, fornece um modelo substituto útil para avaliar as respostas agudas e manipulações de proteção antes de testar os agentes experimentais em animais vivos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="968">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large bath chamber with slice supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Slice Supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SS-3</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-27LP/10</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">ST-1L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution In-line heater/cooler</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SC-20</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CL-100</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Liquid Cooling System</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">LCS-1</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CC-28</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">TS-70B</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Magnetic holder with suction tubing</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH-S</td>
			<td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Adjustable holder</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH</td>
			<td>To hold the temperature probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">clear silicone sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">superglue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">thin plexiglass strips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">nile red</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td>N-1142</td>
			<td>For labeling myelin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Axónios do SNC lesionados e não conseguem regenerar frequentemente retrair para longe do local da lesão. Os axônios poupados da lesão inicial pode depois sofrer degeneração axonal secundária. A falta de formação do cone de crescimento, regeneração, e a perda de projecções axonais mielinizadas adicionais no interior da medula espinal limita grandemente a recuperação neurológica após lesão. Para avaliar como centro de axônios mielinizados da medula espinhal responder a lesão, foi desenvolvido um modelo ex vivo vivendo medular utilizando camundongos transgênicos que expressam a proteína fluorescente amarela em axônios e um focal e altamente reprodutível induzida por laser lesão medular para documentar o destino de axônios e mielina (corante fluorescente lipofílico Nile Red) ao longo do tempo, através de microscopia de excitação de lapso de tempo de dois fótons. Processos dinâmicos como a lesão axonal aguda, retração axonal, e mielina degeneração são melhor estudadas em tempo real. No entanto, a natureza não-focal de lesões à base de contusão e artefatos de movimento encontradodurante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de alta resolução desafiador. O modelo ex vivo medula espinhal descrito aqui imita vários aspectos da contusão / induzida por compressão patologias axonal clinicamente relevantes, incluindo inchaço axonal, formação esferóide, transection axonal e peri-axonal inchaço fornecer um modelo útil para estudar esses processos dinâmicos em tempo real. As principais vantagens deste modelo são excelente resolução espaço-temporal que permite a diferenciação entre o insulto primário que fere diretamente os axônios e mecanismos de lesão secundária; perfusão controlada de reagentes directamente para o banho de perfusato o cabo; alterações precisas do meio ambiente (por exemplo, cálcio, íons de sódio, os contribuintes conhecidos lesão axonal, mas quase impossível de manipular in vivo); e modelos murinos também oferecem uma vantagem uma vez que proporcionam uma oportunidade de visualizar emanipular geneticamente populações celulares identificadas e estruturas subcelulares. Aqui, descrevemos como isolar e imagem da medula espinhal de ratos vivendo para capturar a dinâmica de lesão axonal aguda.

Detalhes de um laboratório adequado configurar necessário para isolar, manter a viabilidade, e da imagem do ex vivo medula espinhal é mostrado na Figura 1. O microscópio deve ser equipado com um laser ajustável pulsado femtosegundo, dicroics apropriados e filtros de emissão, e uma água mergulhando lente objetiva com uma alta abertura numérica (≥1.0). Para assegurar a viabilidade da medula espinhal durante a dissecção, o procedimento deve ser realizado na presença de Ca2 +</sup...

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K visualizações.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Vídeo: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Percussão Fluid lateral: Modelo de Lesão em Ratos

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Neurociência

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-rotulagem de neurônios DRG para estudar em uma ramificação axonal Preparação Monte Whole of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Um Vivo em Método de dupla-cor de imagem dinâmica Vascular após lesão da medula espinhal Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Treinamento baseado em atividade em uma esteira com medula espinhal ferido de ratos Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Indução da lesão da medula espinhal tipo transssecção completa em camundongos

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...