This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

Procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de Thomas Jefferson University cuidados com os animais e uso institucional e conduzida em conformidade com a directiva Comunidades Europeias Conselho (2010/63 / UE, 86/609 / CEE e 87-848 / CEE), o Guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório, ea Sociedade de Políticas de Neurociência do Uso de Animais em Neuroscience Research. 1. potenciais de ação composto do músculo (MCs) <ol><li> Preparando o animal: <ol><li> Anestesiar o rato usando um inalante (isoflurano) em 1-2% entregue ao efeito ou por injecção (cetamina, xilazina, acepromazina). Dosagem de anestesia injectável é a seguinte: 95,0 mg / kg de cetamina, 10,0 mg / kg de xilazina, 0,075 mg / kg de acepromazina. NOTA: Nós usamos com sucesso tanto inalantes e anestésico injetável abordagens durante a realização deste protocolo gravação CMAP, sem preferência. </li><li> O animal deve ser mantida a um a apropriadoprofundidade nesthetic antes da cirurgia é iniciado, através da celebração de cirurgia, e até buprenorfina pós-operatório se tornar efectiva. Confirme anestesia adequada por breve pitada dedo do pé para determinar que uma resposta de retirada não é provocada. Além disso, teste do reflexo corneal com um cotonete. Durante todo o procedimento cirúrgico, determinar que a frequência cardíaca e respiratória não aumentaram, o que sugere que a profundidade da anestesia tornou-se muito clara. </li><li> Aplique uma pomada veterinário sobre os olhos do animal para evitar a secura sob anestesia. </li><li> O cirurgião deve lavar seu / suas mãos com um desinfetante (clorexidina esfoliação) antes de iniciar a cirurgia. O cirurgião deve usar luvas estéreis, máscara e bata ou jaleco limpo. Todos os instrumentos devem ser lavadas e autoclavada antes da cirurgia. Adicionar uma tira indicadora de esterilização dentro do kit instrumento antes da autoclavagem ao nível dos instrumentos para verificar que a esterilização é completa. O cirurgião deveverificar se toda a linha na faixa é preto antes de iniciar a cirurgia. Tape o exterior da caixa com fita de autoclave, indicando assim. Se a cirurgia é para ser executada em vários animais no mesmo dia, limpe os instrumentos entre cirurgias e esterilizar no esterilizador talão de vidro. Se necessário, esterilizar ambas as extremidades do instrumento no esterilizador esferas de vidro, colocando o punho do instrumento no esterilizador durante o tempo adequado, a remoção do instrumento com uma pinça hemostática estéril, resfriando-o em um campo estéril e em seguida, colocando a extremidade funcional de o instrumento para o esterilizador talão de vidro para o período de tempo apropriado. </li><li> Uma vez que animal é anestesiado, lugar a bordo cirúrgico com a superfície dorsal para baixo e abdômen virado para cima para que a fita pode ser usada para proteger os membros anteriores do animal a bordo cirúrgico. </li><li> Raspar caudalmente superfície ventral começando na base do crânio, e assegurar que a área em torno abdómen de cada lado da linha média é shaved dependendo do hemi-diafragma está a ser gravada. Aplicar povidona-iodo para a superfície da pele raspada. </li></ol></li><li> Preparação para gravações CMAP: <ol><li> Após a preparação animal, lugar eletrodo terra subcutaneamente em cauda (Figura 1). </li><li> Coloque o eletrodo de referência por via subcutânea na região abdominal inferior contralateral. </li><li> Coloque gel condutor na superfície tira auto-adesiva ou eletrodo de gravação de disco (dimensões do eletrodo tira superfície: 0,5 x 3 cm), e em seguida, coloque eletrodo de superfície transversalmente ao longo da margem costal unilateral. </li><li> Coloque eléctrodos de estimulação transcutânea 0,5 centímetros além laterais a traqueia e superiores à clavícula. Insira os eletrodos aproximadamente 1,0 cm de profundidade através da pele. Obtenha os eletrodos por mão de modo que sua localização não se move com estímulos subsequentes. NOTA: Ângulo de eléctrodos de estimulação de 90 ° em relação à pele no local de insertion. </li></ol></li><li> Potenciais de ação muscular composto (CMAP) gravações: <ol><li> Obter registos electrofisiolicos utilizando um estimulador / amplificador seguido de análise de dados assistida por computador. </li><li> Os parâmetros de estímulo de estimulação única tração deve ser de 0,5 ms, leguminosas supramaximais 1,0 Hz. A amplitude do estímulo deve situar-se entre 6,0 e 8,0 V (Figura 2A). NOTA: Dentro de um experimento, use uma intensidade do estímulo com a mesma amplitude através animais. O objectivo é o de maximizar a amplitude de resposta, utilizando a amplitude mínima de estimulação. É importante notar que a resposta inicial que ocorre no momento da estimulação é um artefacto de estimulação. Além disso, deve ser tomado cuidado para se obter uma resposta CMAP que é precedido por uma linha de base estável / plana depois de o artefacto de estimulação, que é seguida pela resposta rápida CMAP. A fim de se obter uma tal resposta, pode ser necessário para reposicionar a estimulação e / oueletrodos de registro. </li><li> Espere 30 segundos entre os estímulos, e repita 10 estimulações em uma fila para obter a resposta média (Figura 2B - C). Medir a amplitude de linha de base para o pico (Figura 2A). Realizar a estimulação do nervo frênico durante a fase de ciclo respiratório do animal quando o nervo frênico / diafragma não está ativado. O procedimento pode ser repetido no mesmo animal para o hemi-diafragma contralateral. </li><li> Após a sessão de gravação CMAP final, perfundir o animal se a coloração MNJ será conduzida. Realizar gravações CMAP repetidamente no mesmo animal, aproximadamente uma vez por semana (ou no intervalo de escolha). </li><li> Na sequência de sobrevivência gravações CMAP, permitir animal possa recuperar em uma almofada de aquecimento de água quente circulante e monitorar continuamente, durante a recuperação, até reclinada acordado e sternally. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. &lt;/ Li&gt; <li> Uma vez sternally reclinada, monitorar o animal a cada 12 horas para a primeira 48 horas (diariamente a partir daí). Se o animal parece ser desidratado (pele flácida, apatia), administrar fluidos (solução de Ringer com lactato; subcutaneamente; 1-2 ml por injeção, com os sites rodado, 2 vezes por dia) até peso pós-cirúrgico e perda de líquido se estabilize. Fornecer animais com comida amolecida em pequenos pratos durante o período pós-operatório agudo, se necessário, para incentivar comer se eles não podem alcançar o alimentador bar tampa fio. </li><li> Administrar a buprenorfina na dose de 0,05 mg / kg antes do final da cirurgia e, em seguida, em intervalos de 12 h durante as primeiras 24 horas (dependente e sinais de dor / estresse posteriormente) por injecção subcutânea (local rodado). Se os sinais de dor ou angústia são notados em seguida, tratar os animais com buprenorfina. Sinais indicativos de dor / sofrimento incluem a falta de atividade, vocalizações, a falta de comer ou beber (desidratação), perda excessiva de peso, guardando, excessive roer ou coçar no local da incisão. Os critérios adicionais utilizados na determinação dor e angústia incluem falta de resposta aos estímulos externos, vocalização transitória ou não provocado, respiração difícil ou anormal, secreção naso-ocular castanho-avermelhado persistente, piloereção marcado. Também acompanhar evidência de falta de higiene que sugeriria animais doentes. Se um animal continua a ser observado em perigo após 72 horas de tratamento (de acordo com os critérios de dor / pressões acima apresentadas, e depois de ter recebido o protocolo descrito acima analgésico) sacrificar o animal. </li></ol></li></ol> 2. Diafragma Junção Neuromuscular (MNJ) Análise <ol><li> Dissecação de animais: <ol><li> Administrar ao animal uma overdose de anestesia injectável (3 vezes a dose usada acima: cetamina em 285,0 mg / kg, xilazina, a 30,0 mg / kg, acepromazina em 0,225 mg / kg; administrado por via intraperitoneal). Após sobredosagem, todos os animais devem ter um segundo método de eutanásia (toracotomia) to garantir a morte. A morte deveria ser confirmada pela observação de parada cardíaca e respiratória e observando pupilas fixas e dilatadas do animal. </li><li> Realizar uma laparotomia com bisturi ou tesoura de dissecção estendendo-se a excisão do processo zyphoid caudalmente ao longo da linha média. Separe cuidadosamente pele e do tecido conjuntivo subjacente do músculo usando bisturi e pinças. </li><li> Enquanto puxa-se sobre o processo de zyphoid, usar tesouras de dissecação para remover o diafragma inteiro, garantindo que o diafragma permanece ligado ao osso circundante. Isto é importante uma vez que irá evitar danos no músculo do diafragma, irá permitir a dissecção de sucesso de todo o diafragma e vai ajudar na limpeza do músculo para a coloração subsequente. NOTA: neste momento, animal pode ser perfundido, se necessário. </li></ol></li><li> Limpeza e coloração do diafragma: <ol><li> Fixar para baixo todo dissecado o diafragma, de superfície superior voltada para cima, a borracha de silicone em um vidro de 100 milímetros placa de Petri em4% de paraformaldeído (1% feita em tampão fosfato salino - PBS) durante 20 min, utilizando um estereomicroscópio. Esticar o diafragma para torná-lo tenso, e utilizando os pinos de insectos, o pino para baixo o tecido circundante para evitar a fixação do próprio músculo do diafragma (Figura 3). </li><li> Limpar cuidadosamente o tecido conjuntivo a partir de apenas a superfície superior do músculo com # 5 fórceps e uma tesoura pequena. NOTA: Realizar todas as etapas subseqüentes deste protocolo de coloração de balanço lentamente à temperatura ambiente coberto de luz, a menos que especificado em contrário. Certifique-se de que o músculo diafragma é sempre completamente submerso no líquido para evitar ressecamento. </li><li> Antes da coloração, preparar todos os reagentes necessários: 1x PBS, 2% de albumina de soro bovino (BSA) / PBS, 0,1 M de glicina feitas em 2% de BSA / PBS, 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x, e 0,2% TBP (0,2 % de Triton X100 em 2% de BSA / PBS). Certifique-se de pré-cool metanol a -20 ° C. </li><li> Lavar 3x durante 10 minutos em PBS 1x. </li><li> Incubar em 0,1 M de glicina (apresentado em 2% De BSA / PBS) durante 30 min. </li><li> Incubar em solução RBTX (conjugada com rodamina α-bungarotoxina) durante 15 min. Solução para RBTX é como se segue: conjugada com rodamina bungarotoxina alfa 1: 400 de diluição em PBS 1x. NOTA: Neste protocolo, rodamina é usado, mas qualquer fluoróforo de escolha pode ser utilizado para a coloração. </li><li> Lavar 3x durante 10 minutos em PBS 1x. </li><li> Em -20 ° C congelador, incubar com MeOH durante 5 min. NOTA: Não adicionar MeOH antes de colocar muscular no congelador e retire imediatamente solução após o período de incubação. </li><li> Lavar 3x durante 10 minutos em PBS 1x. </li><li> Bloco em 0,2% TBP durante 1 h (0,2% de Triton feitas em 2% de BSA / PBS). </li><li> Incubar com solução de anticorpo primário (em 0,2% TBP) a 4 ° C durante a noite enquanto a sacudir. As diluições de anticorpos como se segue: SV2 (1:10) e SMI-312 (1: 1.000). </li><li> Lavar 3x durante 10 min com 0,2% TBP. </li><li> Incubar com anticorpo secundário usando diluição 1: 100 de anti-IgG de ratinho FGM1 (de cabra conjugado com FITC1; feita em 0,2% TBP) de balanço enquanto durante 1 h. NOTA: Ao abrigo da luz para o resto do protocolo para a coloração. </li><li> Lavar 3x durante 10 min com PBS 1x. </li><li> Re-limpo circundante tecido conjuntivo no superiores (ver acima) superfície de músculo antes da montagem e montagem de lâminas. NOTA: Recomenda-se limpar e, em seguida, montar amostra imediatamente após a coloração. No entanto, se necessário, a amostra pode ser coberta em 1x PBS, envoltos em parafilme para evitar a evaporação e armazenada a 4 ° C durante até 1 semana, com a mudança de PBS diariamente. </li><li> Após a montagem em lâmina de vidro, lamela com não-hardset Vectashield. Selar bordas da lamela com unha polonês claro para evitar a secagem para fora. Armazenar os slides que encontram-se apartamento em pastas de slides de papelão em -20 ° C para o longo prazo. </li></ol></li><li> Análise e confocal de imagem: <ol><li> Quantitativamente analisar a morfologia do manchada e montada hemi-diafragma sob 20X e 40X de ampliação usando uma epifluorescência verticalmicroscópio. Observação: Como o diafragma é manchado e analisados ​​de forma inteira de montagem, o músculo é muito grosso. Consequentemente, a maior parte da coloração por fluorescência é completamente fora de foco, quando uma imagem estática é feita utilizando microscopia confocal de fluorescência não. Por esta razão, é melhor para realizar a análise JNM em tempo real sobre o microscópio, pois isso permite focar constantemente &quot;para cima&quot; e &quot;para baixo&quot; através do músculo para identificar correctamente a morfologia de cada um dos NMJs individuais. Usando essa abordagem, pode-se facilmente seguir a trajetória de axônios motores individuais como eles se movem através do tecido em relação espacial com os clusters de receptores pós-sinápticos. </li><li> Medindo o comprimento ventral-a-dorsal do músculo, dividir o músculo em três secções separadas para análise com base em padrões de inervação topográficos de níveis medulares específicas (Figura 4H). </li><li> Começando na região ventral do músculo e moving dorsal, analisar todos en NMJs cara localizados em fibras musculares superfície. Não analise fibras musculares mais profundo do que os primeiros 3-4 fibras da superfície como a interpretação pode ser difícil devido à pobre penetração anticorpo (RBTX penetra muito mais profundo no músculo, devido ao pequeno tamanho da toxina em comparação com os anticorpos maiores usadas para rotular neurônios). </li><li> Identificar cada JNM como se intacta do axónio pré-terminal do neurónio é espessa em diâmetro e todas as regiões do terminal do nervo completamente sobrepõem com os receptores de acetilcolina muscular subjacente (AChRs). </li><li> Identificar cada MNJ como parcialmente desnervado se qualquer região dos AChRs musculares subjacentes está desocupada com correspondente terminal nervoso. </li><li> Identificar cada MNJ como completamente desnervado se os AChRs musculares não têm terminação nervosa correspondente (também é importante ter outros NMJs com neurónios marcados no mesmo campo de foco, para que se possa ter certeza da falta de terminal do nervo não é simplesmente devido à cocôr penetração anticorpo em que a região do músculo). </li><li> Identificar cada JNM como multiplicar inervado se houver mais do que uma pré-terminal axonal inervação um JNM indivíduo (isto indica que houve algum nível de desnervação e tentativas susceptíveis de reinnervation nesta junção). </li><li> Identificar cada MNJ tão fina inervados se o MNJ tem sobreposição completa entre o terminal do nervo e AChRs subjacentes, mas tem um axônio pré-terminal thin (isso também é indicativo de algum nível de denervação e tentativas de reinervação). </li><li> Realizar uma análise para cada uma das três regiões identificadas para todas as categorias acima JNM para cada animal. Calcular a média dos dados de cada animal, com os resultados de outros animais do mesmo grupo experimental. Aproximadamente 200-300 junções em ratos hemi-diafragma muscular e 150-200 no rato hemi-diafragma deve ser quantificada em pelo menos 3 (de preferência 5-6 ou mais) animais por grupo experimental. </li><li> Obter imagens de alta resolução confocal, usod para publicação, com um microscópio confocal. </li><li> Obter ácido Z-pilhas no tamanho 0,3 uM passo de 20-40 uM profundidades, e recolher secções ópticas adicionais acima e abaixo de cada junção para assegurar que todo o perfil sináptica está incluído. </li><li> Use um software de aquisição de reconstruir imagens z-série em projeções intensidade máxima. </li></ol></li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

Como a função respiratória é comprometida em ambos traumático SCI e ALS, desenvolver terapias que visem a respiração e, especificamente, a inervação do diafragma são clinicamente relevantes 5,6. A fim de estudar de forma abrangente função respiratória, deve ser utilizado um método de abordagem combinada. CMAPs medir o grau de inervação funcional do diafragma por meio da estimulação do nervo frênico externo, mas o impulso respiratório bulbospinal não endógeno 8. Além disso, es...

Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) é uma doença debilitante neurónio motor associado com a perda de ambos os neurónios motores superiores e inferiores e consequente paralisia muscular. Após o diagnóstico, a sobrevida do paciente é, em média, apenas 2-5 anos 1. Frênico perda do neurônio motor (PhMN) é um componente crítico da patogénese da ALS. Os pacientes morrem em última análise, devido à perda de PhMN inervação do diafragma, o músculo primário de inspiração 2,3. Traumática lesão medular (LM) é também um problema grave com dificuldades respiratórias associadas. Aproximadamente 12.000 novos casos de SCI ocorrem cada ano 4 devido a danos traumáticos à medula espinal. Apesar da heterogeneidade da doença no que diz respeito à localização, tipo e gravidade, a maioria dos casos de SCI envolver trauma da medula espinhal cervical, o que muitas vezes resulta em compromisso respiratório debilitante e persistente. Além de ALS e SCI, outra doenças do sistema nervoso central (SNC) pode ser associado wdisfunção respiratória diafragmática om 5,6. O nervo frênico é um nervo motor eferente que inerva o hemi-diafragma ipsilateral e que se origina a partir de corpos celulares PhMN localizados nos níveis de C3-C5 do ipsilateral medula espinhal cervical. PhMN saída é controlado pelo descendente de entrada bulbospinal do tronco cerebral em uma área conhecida como o grupo rostral ventral respiratória (rVRG) 7. O circuito rVRG-PhMN-diafragma é fundamental para o controle da respiração inspiratória, assim como outros comportamentos de diafragma não-ventilatórios. Vários ferimentos traumáticos e doenças neurodegenerativas que afectam este circuito pode levar a uma profunda diminuição da função respiratória e qualidade de vida do paciente. Descendente de entrada para PhMNs da sobrevivência rVRG, PhMN, a integridade do nervo frênico e inervação adequada na junção neuromuscular do diafragma (MNJ) são todos necessários para a função diafragma normal. Por conseguinte, é importante que empregam técnicaspode avaliar quantitativamente este circuito in vivo em modelos de roedores de ALS, SCI e outras doenças do SNC. Com este protocolo, o objetivo é descrever ferramentas experimentais para avaliar PhMN inervação do diafragma tanto no eletrofisiológico e níveis morfológicos. Potenciais de ação muscular composto (MCs) são registadas ao estimular todos os axônios do neurônio motor eferente de um determinado nervo motor e, em seguida, analisar a resposta despolarização elicitada dos myofibers alvo. Esta técnica pode ser utilizado in vivo em ratos anestesiados e ratos para quantificar inervação funcional da hemi-diafragma por PhMNs 8. Devido ao facto de CMAPs representam gravação simultânea de todos (ou pelo menos a maioria) de muitos / miofibras de todo o hemi-diafragma, que é também útil para analisar os fenótipos de axónios motores individuais e miofibras no MNJ diafragma, a fim de controlar a doença - e terapia relevantes alterações morfológicas, tais como parcial e complete desnervação, surgimento de regeneração e reinervação. Isto pode ser conseguido através de toda a montagem imuno-histoquímica (IHQ) do diafragma, seguido por avaliação morfológica detalhada de NMJs individuais em todo o músculo 9. Combinando CMAPs e análise MNJ fornece uma abordagem poderosa para estudar quantitativamente inervação do diafragma em modelos de roedores de doença do SNC e SNP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:273px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">T353-500</td>
			<td style="width:167px;">Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2% Bovine serum albumin (2% BSA)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A3059-100g</td>
			<td>Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T9284-100mL</td>
			<td>Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.1M Glycine</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G-7126</td>
			<td>Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#945;-bungarotoxin</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">T1175</td>
			<td>Concentration 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SMI-312&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Sternberger Monoclonals</td>
			<td style="width:131px;">SMI312</td>
			<td>Concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SV2</td>
			<td style="width:273px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">SV2-Supernatant</td>
			<td>Concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FITC goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:273px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">3117731001</td>
			<td>Concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Silicone rubber</td>
			<td style="width:273px;">Sylgard, Dow Corning</td>
			<td style="width:131px;">Part # 184</td>
			<td>Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Vectashield fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:273px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:131px;">H-1000</td>
			<td>This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Small Spring Scissors</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Software for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">Scope 3.5.6; ADI</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Disk surface electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-409000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Subdermal needle electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-453100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Conductive gel</td>
			<td style="width:273px;">Aquasonic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">122-73720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:332px;">Stimulator/recording system for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">ADI Powerlab 8SP stimulator&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amplifier for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">BioAMP</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Adulto ratos Sprague-Dawley receberam laminectomy somente (controle ileso) ou unilateral hemi-SCI contusão na medula espinhal nível C4 10-12. Ao fim de 5 semanas após a cirurgia, o pico de amplitude CMAP gravado a partir do hemi-diafragma ipsilateral ao local da laminectomia / lesão foi significativamente reduzida em ratos SCI (Figura 2C), em comparação com o controlo só de laminectomia (Figura 2B). Todos os NMJs no hemi-diafragma foi completamente intacta no controlo ...

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Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Funcional e morfológica de Avaliação de Diafragma Innervation por frênico Neurônios Motores

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

functional-morphological-assessment-diaphragm-innervation-phrenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K visualizações.  Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University. Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease. 

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Neurociência

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracelularmente Identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Rastreamento neuroanatômica retrógrado do frênico neurônios em ratos

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Avaliação morfológica e funcional de Axons e suas sinapses durante a morte de Axon em Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in hindlimb muscles (such as the medial gastrocnemius, soleus, or plantaris muscle) in experimental rats. A crucial element of the method is the application of electrical stimuli delivered to a motor axon isolated from the ventral root. The stimuli may be delivered at constant or variable inter-pulse intervals. This method is suitable for experiments on animals at varying stages of maturity (young, adult or old). Moreover, this protocol can be used in experiments studying variability and plasticity of motor units evoked by a large spectrum of interventions. The results of these experiments may both augment basic knowledge in muscle physiology and be translated into practical applications. This procedure focuses on the surgical preparation for the recording and stimulation of MUs, with an emphasis on the necessary steps to achieve preparation stability and reproducibility of results.

This method allows the recording of the force of twitch and tetanic contractions and action potentials in three types of motor units in the rat medial gastrocnemius muscle. The functional isolation of a single motor unit is induced by electrical stimulation of the axon.

Isolamento Funcional de Unidades Motoras Únicas do Músculo Gastrocnemius Medial de Rato

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...