This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

NOTA: As informações fornecedor para todos os reagentes utilizados neste protocolo foi listado na Tabela 1 e Lista de Materiais. Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células têm de ser estéreis e técnica asséptica deve ser utilizado em conformidade. Executar todas as incubações de cultura numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2, a menos que especificado de outra forma. Neste protocolo, todas as diferenças são realizadas em placas de 6 poços, em que os hiPSCs são semeadas. Seguindo diferenciação e purificação, as células podem ser dissociadas e plaqueadas novamente para uso a jusante. 1. Preparação Médio <ol><li> Para a forma E8, fazer uma solução estoque de cada componente de suporte (NaHCO3, ácido L-ascórbico 2-fosfato, selenito de sódio, transferrina, insulina, FGF2, TGFB1) e armazenar as soluções a -20 ° C. Adicionar uma quantidade adequada de soluções de ações para a garrafa de DMEM / F12 e filtrar para esterilizar. A solução concentrção e configuração de reação para os componentes de ações e médio E8 podem ser encontrados na Tabela 1. </li><li> Para a solução de matriz extracelular, descongelar a matriz da membrana basal (geralmente fornecido a 10 mg / ml) a 4 ° CO / N. Matrigel é vulgarmente utilizado para a cultura de células estaminais pluripotentes porque as células estaminais pluripotentes humanas podem aderir bem a esse material, utilizando a alfa-6-beta-1 integrina 9. Uma vez descongelado, fazer 2,25 mg (250 ul) alíquotas em gelo usando pontas de pipetas de gelo frio e os tubos e armazenar as alíquotas a -80 ° C. <ol><li> Quando pré-revestimento de placas com ECMS, descongelar e Alíquota da solução matriz extracelular (ECMS) em gelo. Misture a ECMS e meio DMEM / F12 com gelo numa proporção de 1: 200 em gelo. Manter a calma para evitar a solidificação prematura ECMS. </li></ol></li><li> Para o RPMI / B27 sem meio de insulina, adicione 10 ml de B27 Minus Insulina em 500 ml de meio RPMI. </li><li> Para o RPMI / B27 (com insulina) médio, adicione 10 ml de B27 Supplement (com insulin) e 5 ml de antibiótico Pen-strep em 500 ml de meio RPMI. </li><li> Para o médio glicose baixa, adicione 10 ml de B27 Supplement e 5 ml de antibiótico Pen-strep em 500 ml de meio RPMI livre de glicose. </li><li> Para a forma / a criopreservação de congelação, mistura de soro fetal bovino, juntamente com dimetilsulfóxido (DMSO) a uma proporção de 9: 1. O meio de congelação podem ser armazenadas até 1 mês a 4 ° C. NOTA: Todos os meios devem ser filtrado e armazenado a 4 ° C e utilizadas dentro de 2 semanas a menos que especificado de outra forma. Todos os volumes de reagente / solução usados ​​abaixo destinam-se a um único poço em uma placa de 6 poços, salvo indicação em contrário. </li></ol> 2. Pré-revestimento de placas de 6 poços com ECMS <ol><li> Adicione ECMS misturando matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel) com meio DMEM / F12 com gelo numa proporção de 1: 200, em seguida, aplicam-se 2 ml de ECMS acabado de fazer a cada poço para uma placa de 6 poços. Cada poço de uma placa de 6 poços receberá aproximadamente 90 mg ECMS. </li><li> Incubar a ECMS placas revestidas durante 1 hora a 37 ° C. Imediatamente antes do plaqueamento das células, aspirado de solução DMEM / F12 de cada poço. As placas então estará pronta para receber células. </li></ol> 3. o descongelamento das hiPSCs congelados NOTA: Intimamente seguir este procedimento, uma vez que pode levar a cultura ideal e diferenciação jusante da hiPSCs em hiPSC-CMs seguindo o ciclo de congelamento / descongelamento. <ol><li> Descongelar um frasco de hiPSCs para cada poço de uma placa de 6 poços. Prepare um tubo de 15 ml com 9 ml de meio frio E8 com inibidor ROCHA (10 mM) para cada frasco. Inibidor ROCHA melhora hiPSCs sobrevivência após a criopreservação 10. Manter os frascos em 37 ° C banho de água para descongelar as células até um aproximadamente 5 mm de diâmetro de cristais de gelo é deixado. </li><li> Pulverizar o exterior dos frascos com etanol a 70%. Limpe os frascos com papel de seda antes de movê-los para a capa laminar estéril. </li><li> Transferem-se as células para dentro do tubo cónico preparado. Enxágüe tele frasco uma vez com 500 ul de meio E8 e transferir o meio contendo as células descongeladas para o mesmo tubo cónico. Centrifuga-se a TA, durante 4 minutos a 200 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender cuidadosamente a pelete de células com 2 ml de meio E8 com inibidor ROCHA (10 uM). Transferem-se as células em suspensão para um poço de uma placa de 6 poços pré-revestidos com ECMS. </li><li> Substitua o meio com meio E8 sem inibidor ROCHA após 24 horas de cultivo. As células devem ter aderido a essa altura. </li></ol> 4. Passaging de hiPSCs <ol><li> Tipicamente, hiPSCs passagem depois de atingir 75% -80% de confluência numa placa de 6 poços. Aspirar o meio de cultura. Lavar rapidamente poços com 1 ml de solução estéril, RT PBS. Aspirar PBS. <ol><li> Adicionar 500 ul de EDTA 0,5 mM ou solução 1x separação celular (por exemplo, Accutase) e incubar durante 1-7 minutos à temperatura ambiente. Momento adequado para EDTA de incubação varia de acordo com a linha hiPSC. Esperar para ver o visível ondulaçãor espessamento de colónias em torno das bordas, como isto indicará que a solução de EDTA ou separação celular está pronto para ser removido. </li></ol></li><li> Aspirar o EDTA ou o desprendimento de células solução. Adicionar 1 ml de meio suplementado com 10 E8 uM inibidor ROCHA. Deslocar colônias hiPSC no poço pipetando repetidamente cima e para baixo e pulverização colônias fora com uma pipeta P1000. Colônias deve ser dividido em 10/05 aglomerados de células após a conclusão. </li><li> Transferem-se as colónias que são suspensos em 1 ml de meio com E8 inibidor ROCHA em um tubo de 15 ml. </li><li> Disrupt os grandes aglomerados de células em pequenos aglomerados no meio E8. Adicionar um volume adequado de meios E8 com inibidor para a suspensão de células para diluir as células. O volume do meio para adicionar para diluição depende da densidade celular e o número de poços para ser semeada. Idealmente, uma única, 80% confluentes poço de hiPSCs devem ser diluídas 1:12. <ol><li> Adicionar 11 ml de meio E8 com inibidor de pedra para o 1 ml existentes de cell solução acima mencionado em 15 ml de tubo cónica para obter uma diluição de 1:12. </li></ol></li><li> Além disso triturar os aglomerados de células em fragmentos de células pequenas (cerca de 50-200 células em cada fragmento é melhor). Evite o excesso de trituração, pois isso reduz a sobrevivência da célula. </li><li> Aspirar ECMS das placas pré-revestidas e adicionar 2 ml de células ressuspensas em cada poço. Cerca de 100.000 células por poço de uma placa de 6 poços é ideal. Destinam-se a distribuir as células uniformemente em torno do poço para evitar a aglomeração de células no centro do poço. </li><li> Após 24 h de cultura, substituir o meio com meio E8 sem inibidor ROCK. Alterar o meio de cultura a cada 24 horas até que as células tornam-se 80% confluentes. Em seguida, as células estão prontas para passagem de novo. Ele normalmente leva 3-6 dias entre as passagens para chegar a 80% de confluência. </li></ol> 5. hiPSCs Congelamento NOTA: Intimamente seguir este procedimento, uma vez que pode levar a cultura ideal e diferenciação jusante do quadrilSCs em hiPSC-CMs seguindo o ciclo de congelamento / descongelamento. <ol><li> Rotular tubos criogênicos com o nome da linha celular, tipo de célula, número de passagens, e data de congelamento. Como orientação geral, utilizar um frasco para cada poço de uma placa de 6 poços. Preparar um tubo de 15 ml cheio com 9 ml de meio E8 com inibidor ROCHA (10 uM). Prepare meio com FBS a 90% e DMSO a 10% frio, e manter o meio a 4 ° C até estar pronto para usar. </li><li> Aspirar o meio de cultura, adicionar 500 ul de EDTA 0,5 mM, solução ou separação celular 1x e incubar durante 2-7 minutos à temperatura ambiente. A duração da exposição à solução de EDTA ou desprendimento de células varia de linha celular para linha celular. </li><li> Aspirar solução de EDTA ou separação celular. Adicionar 1 ml de meio E8. </li><li> Deslocar colônias hiPSC no bem por pipetagem cima e para baixo e pulverização colônias fora com uma pipeta P1000. Colônias não deve ser quebrado em menor que 100 aglomerados de células. Transfira as células em suspensão para o tubo cônico preparado contendo E8. Centrifugar a RT durante 4 minutos a 200 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante e adicionar 500 uL de meio de congelação frio ao sedimento. Ressuspender o sedimento por pipetagem de uma a duas vezes. A sobrevivência celular é melhorado mantendo as células em grandes aglomerados. </li><li> Transferem-se as células ressuspensas para um tubo criogénico marcado. Mover-se rapidamente os frascos num recipiente de congelamento contendo isopropanol, o que vai permitir o resfriamento gradual. Manter o recipiente com as células a -80 ° C durante 24 hr, em seguida, transferir as células em azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol> 6. Cardiac Diferenciação de iPSC Humano NOTA: Todos os meios devem ser, pelo menos em RT quando adicionado. <ol><li> Depois de dissociação com solução descolamento EDTA ou 1x celular, sementes aproximadamente 100.000 iPSCs humanos na ECMS revestidas placas de cultura de 6 poços de diferenciação (mesmos passos como procedimentos Passaging celular). Quando as células chegar a 85% de confluência, mudar o meio de RPMI / B27 sem meio de insulina com 6? M CHIR99021 inibidor GSK3-beta (CHIR) e manter durante 48 horas. </li><li> Após 48 horas, substituir o meio de cultura contendo CHIR- com RPMI / B27 sem meio de insulina e deixar sozinho por 24 horas (até dia 3). </li><li> No dia 3, alterar a mídia para RPMI / B27 sem insulina com 5 ï¿½ Wnt inibidor IWR1 e manter durante 48 horas (até o dia 5). NOTA: Wnt inibição também pode ser tentada com outros compostos de moléculas pequenas, tal como descrito em estudos anteriores 11. IWR1 foi seleccionado para outros inibidores de moléculas pequenas de Wnt, devido ao aumento da gama em que se tem demonstrado ser eficaz na inibição da sinalização de Wnt 11. </li><li> No dia 5, mudar o meio de volta para RPMI / B27 sem meio de insulina e deixe por 48 horas (até dia 7). </li><li> No dia 7, substituir o meio com meio RPMI / B27 (com insulina) e substituir meio a cada 3 dias depois com a mesma forma. Surra espontânea de cardiomiócitos deve ser a primeira visível aproximadamente no dia 8 ao dia10. </li></ol> 7. Purificação de Cardiomyocytes Humanos por inanição Glucose <ol><li> No dia 10 pós-diferenciação, alterar o meio em cada poço da placa de 6 poços a 2 ml de meio de baixo teor de glucose e manter as células neste meio durante 3 dias (até ao dia 13). </li><li> No dia 13, o retorno células de meio RPMI / B27 (com insulina). </li><li> Opcionalmente, replate cardiomiócitos antes da segunda rodada de fome glucose para ajudar a soltar os não-cardiomiócitos da placa de cultura, permitindo a fácil dissociação dos não-cardiomiócitos durante a inanição glucose. <ol><li> No dia 13, o meio aspirado, lavar uma vez com PBS, e dissociar as células em células individuais utilizando 500 ul da enzima de dissociação de células durante 5 min a 37 ° C. Especificamente, após 5 min de tratamento com enzima, utilizar uma pipeta de 1000 ul de dissociar cardiomiócitos manualmente a partir da placa de 6 poços, puxando-se repetidamente a enzima dissociação celular e pulverizando-a contra o cardiomyomonocamada cyte. Até 30 repetições de pipetagem pode ser necessária para dissociar os cardiomiócitos em células individuais. </li><li> Depois as células são dissociadas e estão na forma de uma única célula, recolher todas as células num tubo de 15 ml cheia com 5 ml de meio RPMI / B27 com insulina para diluir a enzima dissociação celular e centrifugar durante 4 minutos a 200 x g. Aspirar e desprezar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender as células com 2 ml de RPMI / meio B27 e placa para um novo ECMS-revestido placa de 6 poços. Normalmente, maior confluência de cardiomiócitos ajuda com a sobrevivência das células durante repique. Destinam-se a replate 2 milhões de células por nova 6 poços prato para a sobrevivência ideal durante repique. </li></ol></li><li> No dia 14, mudar o meio de volta para 2 ml de meio de baixo teor de glucose para um segundo ciclo de privação de glicose. Cultura as células neste estado glicose baixa para mais de 3 dias. A maioria dos cardiomiócitos não vai morrer nesta condição cultura pobre em glucose. </li><li> No dia 17, para alterar a forma de R 2 mlMédio PMI / B27 com insulina. As células remanescentes serão cardiomiócitos altamente purificadas. Estes cardiomiócitos pode ser usado para a análise da expressão do gene, o rastreio de drogas, análise metabólica, e vários outros ensaios a jusante. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

A obtenção de uma grande quantidade de derivados de cardiomiócitos hiPSC altamente purificadas é crítica para a investigação básica cardíaca, bem como aplicações clínicas e translacionais. Protocolos de diferenciação cardíacos tenham sido submetidos a enormes melhorias nos últimos anos, a transição de métodos baseados em corpo embriï¿½des utilizando crescimento cardiogênico fatores 2, a matriz métodos sanduíche 12 e, finalmente, para as pequenas métodos baseados monocamada...

Cardiomiócitos primários humanos são difíceis de obter devido à exigência de biópsias cardíacas invasivos, dificuldade em se dissociar para células individuais, e por causa da sobrevivência celular a longo prazo pobre em cultura. Devido a esta falta de cardiomiócitos humanos primários, induzida pelo homem-tronco pluripotentes cardiomiócitos derivados de células específicas do paciente tecnologia (hiPSC-CM) tem sido considerado como uma fonte de cardiomiócitos alternativa poderosa para a pesquisa básica, bem como as aplicações clínicas e translacionais como modelagem de doença e drogas descoberta 1. Os esforços iniciais em diferenciação de células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos empregues protocolos de diferenciação, usando corpos embrióides (EBS), mas este método é ineficiente porque em cardiomiócitos que produzem muitas vezes menos do que 25% de células em um EB são batendo cardiomiócitos 2,3. Comparativamente, um protocolo de diferenciação com base em monocamada utilizando as citocinas activina A e BMP4 exibida uma maior eficiência do que as EBs, maseste protocolo ainda é relativamente ineficiente, requer fatores de crescimento caros, e só funciona em um número limitado de pluripotentes humanas linhas de células estaminais 4. Recentemente, um protocolo de diferenciação de cardiomiócitos com base em monocamada hiPSC altamente eficiente foi desenvolvido pela modulação da sinalização de Wnt / β-catenina 5. Estes hiPSC-CMs expressar troponina T cardíaca e alfa actinina, duas proteínas sarcoméricas que são marcadores padrão de cardiomiócitos 6. O protocolo de descrever aqui é uma adaptação deste pequeno-base molécula, alimentador de célula livre, diferenciação monocamada método 5,7. Nós somos capazes de obter bater cardiomiócitos de hiPSCs após 7-10 dias (Figura 1). No entanto, seguindo uma diferenciação de cardiomiócitos resultando em 50% de células batendo, de forma consistente imunomarcação mostra a existência de uma população de cardiomiócitos que não são negativas para os marcadores específicos de cardiomiócitos, tais como a troponina T cardíaca específica e alfa-actinina. Para further purificar cardiomiócitos e eliminar não-cardiomiócitos, populações heterogéneas de células diferenciadas foram submetidos a jejum de glucose, tratando-os com um meio extremamente baixo de glucose para a cultura de vários dias (Figura 2). Este tratamento elimina selectivamente não-cardiomiócitos, devido à capacidade de cardiomiócitos, mas não não-cardiomiócitos, para metabolizar lactato como fonte de energia primária, a fim de sobreviver em um ambiente de baixa glicose 8. Após esta fase de purificação, é observado um aumento de 40% na proporção de cardiomiócitos para não-cardiomiócitos, (Figura 3, Figura 4) e estas células podem ser utilizadas para análise da expressão do gene a jusante, modelagem doença, e ensaios de rastreio de drogas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

-Tronco pluripotentes derivadas de células cardiomiócitos Humanos induzida (hiPSC-CMS) tornaram-se uma importante fonte de células para suprir a falta de cardiomiócitos primários disponíveis para aplicações de pesquisa básica e translacional. Para diferenciar hiPSCs em cardiomiócitos, vários protocolos, incluindo corpo embryoid (EB) diferenciação baseada e indução do fator de crescimento têm sido desenvolvidos. No entanto, estes protocolos são ineficientes e altamente variáveis ​​na sua capacidade para gerar cardiomiócitos purificadas. Recentemente, uma pequena protocolo utilizando modulação baseada molécula de sinalização Wnt / β-catenina foi mostrado para promover a diferenciação cardíaca com alta eficiência. Com este protocolo, superior a 50% -60% de células diferenciadas foram cardiomiócitos troponina positiva cardíacos foram observados de forma consistente. Para aumentar ainda mais a pureza de cardiomiócitos, as células diferenciadas foram sujeitas a inanição glicose para eliminar especificamente não-cardiomiócitos com base na diferença metabólicas entre cardiomiócitos e não-cardiomiócitos. Utilizando esta estratégia de selecção, que, consistentemente, obtido um aumento superior a 30% na proporção de cardiomiócitos a não cardiomiócitos em uma população de células diferenciadas. Estes cardiomiócitos altamente purificadas deverão aumentar a confiabilidade dos resultados de humano com base em estudos de modelagem em iPSC doença in vitro e testes de rastreio de drogas.

As alterações morfológicas durante a diferenciação hiPSC. O hiPSC cultivadas em placas de livre-de alimentação cresceu como planas, colônias bidimensionais. Ao atingir cerca de 85% de confluência, hiPSCs foram tratados com 6 uM CHIR para diferenciação (Figura 1A). Quantidades substanciais de morte celular, um fenômeno normal e comum, foram observados após 24 horas de tratamento CHIR. Depois de dois dias de tratamento com CHIR, os hiPSCs continua...

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Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.4K visualizações.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

Vídeo: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Biologia do Desenvolvimento

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.