Este trabalho foi financiado por doações R01-CA169354 &#160; e R01-047822 &#160; dos Institutos Nacionais de Saúde e um Prémio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos (BCE). RKP foi financiado pelo NIH T32 CA009287-30A1, um Investigator Award ASCO Young, California Breast Cancer Research Projeto Fellowship, e um American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant; BAZ foi financiado pelo NIH concessão AI079320. JM foi apoiado por bolsas do NIH T-32 bolsa de formação T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 e American Cancer Society bolsa de pós-doutorado PF-12-052-01-CSM.

NOTA: Todas as experiências com animais foram conduzidos de acordo com aprovou Stanford, Palo Alto VA HCS, e os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes AnimalCare Institucional e Comitê de Uso. 1. Preparação para Coleta e Processamento (Tempo necessário: ~ 10-15 min) <ol><li> Inoculação das células de melanoma B16F0 murino (0,5-1 x 10 6) subcutaneamente na ou perto da linha média do abdómen na fêmea C57BL / 6, como previamente descrito 6. Alternativamente, inocular células tumorais em locais anatômicos adicionais (por exemplo, flanco, almofada de gordura mamária, etc). NOTA: Qualquer número de tumores (implantado ou espontânea) pode ser utilizado e analisadas usando este protocolo. Por exemplo, a outra utilizada em tumores singeneicos C57BL / 6 incluem a linha MC38 cólon, carcinoma do pulmão de Lewis (LLC), e a linha de próstata TRAMP-C2. Enquanto xenoenxertos humanos inoculados em ratinhos imunodeficientes também pode ser avaliado desta maneira, deve notar-se que a profiles dos leucócitos infiltrantes tumorais irá necessariamente ser alterados de acordo com o estado de imunodeficiência do rato hospedeiro. <ol><li> Use meio completo (por exemplo, meio RPMI contendo 10% de FBS e aditivos) ou um outro tampão contendo proteína apropriado (por exemplo, HBSS ou PBS + FBS a 1% ou 1% de BCS). Refrigere media ou tampão a 4 ° C antes da eutanásia. </li></ol></li><li> Configure tubos de coleta e filtros para tumores ressecados; colocá-los em gelo. <ol><li> Use um tubo de 50 ml por tumor a ser retirado. Inserir um filtro de 40-70 mm de suspensão celular em cada um. Como alternativa, use 15 ml tubos cônicos com malha de filtro de metal. Usar um êmbolo de seringa de 5 ml ou caneta de espessura para criar um filtro em forma de taça na parte superior do tubo de 15 ml. </li></ol></li><li> Prepare instrumentos para ressecção do tumor e de transformação; utilize uma pinça cirúrgica e uma tesoura fina para ressecar e tumores do processo. Use 70% de etanol para limpar instrumentos entre as amostras ressecções / tumorais. Para o maior númeroamostras de F (por exemplo,&gt; 10), recomendamos o processamento simultâneo de amostras por vários pesquisadores para evitar diferenças significativas no tempo de processamento entre as amostras tumorais. </li></ol> 2. ressecção de tumor (Tempo necessário: ~ 5 min / tumor) <ol><li> Eutanásia B16 ratinhos portadores de tumor individualmente utilizando dióxido de carbono ou outro método aprovado. </li><li> Prenda o mouse em uma fase cirúrgica. Pulverizar a área do tumor, com 70% de etanol e limpe o excesso de fora; isso ajuda a evitar a propagação de qualquer cabelo presente. Para os ratos não-nu, raspar a área da pele em torno do tumor antes da ressecção, conforme necessário. </li><li> Utilizando uma pinça e tesouras, ressecção do tumor subcutâneo em bloco, incluindo sobreposta e pele circundante. A quantidade de &quot;margem&quot; da pele pode ser feita variar, mas tipicamente 2-3 mm de ressecar a pele em torno do tumor. <ol><li> Pesar tumores ressecados (+/- pele circundante) neste momento. Coloque a parte da pele / tumor ressecado no filtro assegurada na pltubo cônico astic. </li></ol></li></ol> 3. preparação de uma suspensão Tumor celular Individual (Tempo necessário: ~ 5-7 min / tumor) <ol><li> Use uma pinça e tesouras para picar tumor e sobreposta / pele circundante. Picar a amostra usando uma tesoura até que todos os grandes cortes de tecido são transformados em seções 1-2 mm. NOTA: Normalmente, os tumores inteiros são transformados; alternativamente, para tumores maiores, secções representativas de tumores pode ser triturada e processado. </li><li> Utilizando um êmbolo de um descartável de 5 ou 10 ml da seringa, desagregar mecanicamente o tecido tumor fragmentado em relação ao filtro segura. </li><li> Usando um pipetador, lavar o tecido de tumor transformadas com 5-10 ml de meio ou tampão frio. Isto irá liberar as células individuais através do filtro. </li><li> Repetir os dois passos acima várias vezes, assegurando que o número total e volumes de lavagens são aproximadamente as mesmas para os tumores de tamanho semelhante. <ol><li> Depois de lavar o tecido tumoral processado, observarpequenos fragmentos de pele e / ou outro tecido conjuntivo deve ser deixada para trás no filtro. </li><li> Alternativamente, para tumores onde a desagregação mecânica por si só pode não ser suficiente, a digestão com colagenase e / ou outras enzimas pode ser realizada antes do processo de trituração. Isto permitirá uma suspensão de células individuais mais minuciosa. No entanto, deve notar-se que tais protocolos de digestão podem afectar a expressão do antigénio de superfície 20, de modo que é preciso ter cuidado na interpretação destes resultados. </li></ol></li><li> Lavar e peletizar as células por adição de mídia / tampão e centrifugação a 4 ° C a 500 xg durante 5 min. </li></ol> 4. FACS Coloração de suspensão de células individuais (Tempo necessário: ~ 30-60 min) <ol><li> Ressuspender as células em tampão FACS gelo frio (PBS + 1% FBS). </li><li> Contagem de células viáveis ​​utilizando azul de tripan e um hemocitômetro, ou contador de células automatizado. </li><li> Determinação do rendimento de células viáveis ​​total por volume. Estes dados podem ser utilizados para extrapolarnúmeros absolutos de leucócitos infiltrantes tumorais em combinação com os dados de FACS. </li><li> Determinar o número de células a serem coradas e analisadas por FACS. Isto será influenciado por vários factores (por exemplo, tipo de histologia do tumor, a idade e tamanho do tumor, percentagem média de leucócitos infiltrantes, etc.). NOTA: Em melanoma B16, encontramos uma baixa porcentagem de tumor infiltrando leucócitos (TIL, normalmente &lt;5%) em comparação com as células tumorais. Assim, pelo menos 1 x 10 6 tumoral total (leucócitos infiltrantes tumorais +), as células foram recolhidas tipicamente através de FACS para análise. <ol><li> Utilizando os dados de contagem de tripano-coradas, volume calculado de células a serem coradas para FACS. Por exemplo, se TIL constituem tipicamente 5% do total de células tumorais (muitas das células tumorais serão mortos em mancha de tripano), factor este para o número total de suspensão de células individuais do tumor a ser corado. </li><li> Para subconjuntos de leucócitos, por exemplo, menos comuns CCR9 + pDC) usar um maior número de células tumorais totais (por exemplo, de 2-3 x 10 6) para a coloração de FACS, tendo em conta a baixa frequência relativa destas células na suspensão de células individuais. </li></ol></li><li> Manchar a única suspensão de células tumorais por FACS. <ol><li> Para vivo / morto discriminação, use uma mancha solucionáveis ​​ou uma mancha não-solucionáveis ​​(por exemplo, iodeto de propídio) pode ser usado. Se a célula estão manchadas sem vivo / morto a discriminação, o cuidado deve ser aconselhado dado o potencial de ligação não específica de anticorpos. </li><li> Manchar a suspensão de células para subconjuntos de leucócitos específicos que utilizam um protocolo padrão de coloração de FACS. As células de bloco para reduzir não específica de anticorpos de ligação com PBS / FBS contendo 1% de soro de rato e Fc bloco (anti-CD16 / 32) durante 10 min antes da coloração com anticorpos específicos para o antigénio. Incluem os anticorpos do isotipo de controlo para assegurar a correcção de coloração específica. </li><li> Neste momento, após a coloração de FACS é completa, fixar as amostras com 4% de formaldeído ou outro agente fixador semelhante. Armazene as amostras a 4 ° C no dark (como para evitar extinção de fluoróforos) até o momento da coleta e análise. NOTA: Armazenar amostras fixadas por longos períodos de tempo podem resultar em alterações no sinal e a intensidade dos fluoróforos 21. </li><li> Coletar as amostras em um citômetro de fluxo. Fluxo Optimal citômetro configurações irá variar dependendo do tipo de instrumento e configuração do laser / detector. NOTA: Para além disso, pode haver variabilidade entre experiências, mesmo utilizando a mesma máquina. Assim, realizar a configuração da máquina adequada (por exemplo, usando esferas de calibração) para garantir a definição de compensação adequada antes da coleta e análise de cada experimento FACS. </li></ol></li><li> Análise de subconjuntos leukoctye <ol><li> Utilizando um software de análise de dados de FACS, para analisar os dados. Para a / morto mancha ao vivo, comece por gating fora células mortas. Use anticorpo contra um marcador específico de leucócitos (por exemplo, anti-CD45) para identificar leucócitos dentro das células vivas. <ol><li> Após isso, use várias gatiesquemas ng para identificar subconjuntos específicos, dependendo do protocolo de coloração. Por exemplo, para identificar as células T CD4 +, selecione a região do SSC lo a partir da população CD45 + e selecione as células CD19-CD3 +; a partir destas células T CD4 + podem ser identificados 22. </li></ol></li><li> Analisar dados e apresentá-lo em uma série de maneiras diferentes para garantir a consistência e identificar padrões ou tendências (ou seja, usar números totais, percentagens, ou razões para quantificar subconjuntos). NOTA: Por exemplo, nós olhamos CD45 vivo total + células como uma percentagem de células tumorais totais recolhidos (Figura 1). Além disso, nós então calculada a porcentagem de cada subconjunto de leucócitos (por exemplo, as células T CD4 +) dentro do tumor, comparando-os como razões entre os grupos controle e de teste (Figura 3). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Realizando análise detalhada do microambiente do tumor é crítica na determinação dos mecanismos e efeitos de imunomodulação. Com o aumento da presença de immunotherapeutics no reino clínico humano, a compreensão do impacto desses agentes sobre os leucócitos tumor infiltrando está se tornando indispensável na definição de seu mecanismo de ação. Nos seres humanos, há muitas vezes existem dificuldades clínicos e / ou de logística na obtenção e análise de tecidos de tumor para a análise de leucócito...

O equilíbrio entre o crescimento do tumor e de promoção de regressão é, em parte, dependente do balanço de leucócitos tumor infiltrando pró e anti-presentes no microambiente 1,2. A fim de estudar o microambiente tumoral (TME) e especificamente identificar as subpopulações de leucócitos infiltrantes, foi desenvolvido um método para a avaliação dos tumores subcutâneos em um modelo de tumor de murino. A importância de se estudar o microambiente do tumor é bem conhecido e apoiado na literatura. Numerosos estudos têm mostrado que o equilíbrio de pro- e anti-tumorais infiltrado de células imunitárias pode ter impacto nos resultados do crescimento do tumor, não só no rato, mas também estudos com seres humanos (revisto em 3,4). Por exemplo, Curiel et ai. Mostraram que pioraram os resultados clínicos em pacientes com cancro do ovário foram correlacionados com a presença de percentagens crescentes de células infiltrantes tumorais reguladoras T CD4 + (Tregs) 5. O nosso próprio trabalho também mostrou o efeito de um nãovel de leucócitos quimioatraente da proporção de subconjuntos de leucócitos no rato um modelo de melanoma 6, que também se correlacionou com a diminuição do crescimento do tumor. Assim, as análises detalhadas dos subconjuntos de leucócitos dentro de um tumor é agora mais amplamente reconhecida e cada vez mais importante. Há muitas maneiras de avaliar o microambiente do tumor para leucócitos de infiltração; por exemplo, grupos de engenharia camundongos transgênicos para expressar diferentes proteínas fluorescentes, a fim de imagem do TME 7, imunohistoquímica clássica e imunofluorescência de secções preservadas 8, incluindo diversas modalidades de imagem, como ressonância magnética, PET, microscopia confocal 11/09 - alguns com a capacidade de monitorar intravitally 10,12. Estes podem ser usados ​​com vários agentes de imagiologia molecular, tais como as nanopartículas 13 ou 14 novos agentes de contraste que marcar células imunitárias. O nosso método é uma abordagem baseada em citometria de fluxo e tem várias vantagens.Em primeiro lugar, todo o microambiente do tumor pode ser amostrado; no momento da análise, a totalidade da periferia do tumor subcutâneo circundante e é ressecada cirurgicamente para processamento. Isso elimina qualquer tendência potencialmente amostragem dentro de um único tumor e dá uma análise mais &quot;global&quot; do tumor como um todo. Em segundo lugar, utilizando citometria de fluxo multicolor para analisar os subconjuntos de leucócitos nos permite avaliar mais especificamente o fenótipo de leucócitos infiltrantes. Dependendo do número de cores utilizadas, subconjuntos muito específicas podem ser identificadas. Isto é importante uma vez que existem vários subconjuntos de leucócitos dentro de um determinado tipo de célula - ou mesmo subtipo de uma classificação geral - que têm funções diferentes que são potencialmente importante na determinação do destino do tumor. Por exemplo, as células dendríticas plasmocitoides (PDC) têm sido implicados na imunidade anti-tumor de 15. No entanto, o subconjunto de CCR9 + de pDCs tem sido mostrado para ser tolerogénico 16, e mudando o balança de um tal subconjunto pode ter um impacto sobre o crescimento do tumor. O nosso método é adequado para administração subcutânea ou outros tumores que possam ser ressecados em bloco. Na nossa experiência, os tumores foram ressecados uniformemente na altura da eutanásia. No entanto, é concebível, como tem sido feito em alguns estudos, que um tumor subcutâneo pode ser completamente ressecada com fechamento da pele circundante em uma cirurgia de sobrevivência de 17, permitindo assim uma avaliação adicional do animal. A análise é, então, realizada sobre o tumor ressecado. Assim, os resultados representam um único ponto de tempo no desenvolvimento do tumor. Enquanto isso permite uma visão detalhada no microambiente, é também uma imagem estática do que é, sem dúvida, um processo dinâmico. No entanto, os leucócitos isolados (por exemplo através de separação magnética ou de gradiente de densidade) pode, então, ser analisados ​​separadamente a partir do epitélio e estroma tumoral, ou utilizado em outros ensaios funcionais, para definir ainda o seu fenótipo, tal como foi previously descrita 18. Este método, então, seria útil para qualquer investigadores interessados ​​em compreender a composição dos leucócitos dentro do microambiente do tumor num dado ponto de tempo, quer sob a regulação do curso natural da doença, ou após uma perturbação terapêutica específica. Embora não seja feito por nós, variações deste procedimento pode também potencialmente ser utilizada para analisar porções específicas de um tumor em isolamento. Por exemplo, dado o tamanho do tumor, a zona periférica (s) podem ser dissecados para fora do núcleo central, possivelmente necróticas do tumor para dar o pesquisador uma visão mais espacialmente segregado do microambiente do tumor. No florescente campo da imunologia tumor, não será sem dúvida um número exponencialmente crescente de estudos que avaliam novos agentes imunomoduladores em modelos de tumores de ratinho. Vários estudos têm destacado as diferenças em função leucocitária específica dentro do tumor em relação ao periférico enbiente. Por exemplo, Shafer-Weaver et al., Mostraram, num modelo de rato que as células T específicas do antigénio efectoras CD8 +, enquanto activa na periferia, foram transformados em células supressoras CD8 +, uma vez que de tráfico para o microambiente do tumor 19. Isso foi em parte devido a TGF, mas outros fatores provavelmente estão envolvidos também. Assim, avaliar subconjuntos de leucócitos - números e as proporções, bem como o estado funcional - dentro do próprio tumor vai dar uma representação mais precisa do efeito de uma imunomodulação especial sobre o destino do tumor. A nossa técnica permite a análise detalhada do tumor e permite ao pesquisador a oportunidade de identificar mais de perto as alterações em populações de leucócitos do que as abordagens anteriores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:229px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-040</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>http://cellgro.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 micron filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-35</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical scissors/forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>roboz.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-030-CM</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientifice&#160;</td>
			<td>02-671-54&#160;</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td>lieftechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo software</td>
			<td>TreeStar, Inc</td>
			<td></td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model

Células imunitárias especializadas que se infiltram no microambiente tumoral regulam o crescimento e sobrevivência de neoplasia. As células malignas deve iludir ou subverter as respostas imunes anti-tumorais, a fim de sobreviver e prosperar. Tumores tirar vantagem de uma série de diferentes mecanismos de imune &quot;fuga&quot;, incluindo o recrutamento de tolerogénico DC, as células T reguladoras imunossupressores (Tregs), e células supressoras derivadas de mielóides (MDSC) que inibem as respostas anti-tumorais citotóxicos. Por outro lado, as células efectoras imunes anti-tumor pode retardar o crescimento e expansão de tumores malignos: células dendríticas imunoestimulantes, células natural killer, que abrigam a imunidade anti-tumoral inato, e células T citotóxicas todos podem participar na supressão tumoral. O equilíbrio entre pró e anti-tumorais leucócitos última análise, determina o comportamento e destino das células transformadas; uma série de estudos clínicos humanos deram isso. Assim, a análise detalhada de subconjuntos de leucócitos dentroo microambiente do tumor tornou-se cada vez mais importante. Aqui, nós descrevemos um método para a análise de subconjuntos de leucócitos que se infiltram presentes no microambiente tumoral num modelo de tumor de rato. Células tumorais de melanoma B16 de rato foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos C57BL / 6. Em um determinado momento, tumores e pele circundante foram ressecados em bloco e transformadas em suspensões de células individuais, que foram então coradas para multi-color citometria de fluxo. Usando uma variedade de marcadores de leucócitos subconjunto, fomos capazes de comparar as percentagens relativas de se infiltrar em subconjuntos de leucócitos entre controle e tumores que expressam chemerin. Os investigadores podem usar essa ferramenta para estudar a presença imune no microambiente do tumor e quando combinado com medidas de tamanho calibre tradicionais de crescimento do tumor, irá potencialmente permitir-lhes para elucidar o impacto das mudanças na composição imune no crescimento do tumor. Uma tal técnica pode ser aplicada a qualquer modelo de tumor em que o tumor e o seu microambiente cum ser ressecado e processado.

Os nossos resultados mostram que a sobre-expressão forçada de chemerin em tumores murinos B16 aumentada a percentagem de leucócitos de infiltração de tumores (TIL). Além disso, foram identificadas alterações na proporção relativa de subconjuntos de leucócitos representados dentro do microambiente do tumor associado a expressão chemerin. Re-imprimir com a permissão de Pachynski et al. 6. A Figura 1 mostra que houve um aumento significativo no n?...

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Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Avaliação do tumor infiltrantes Leucócitos Subconjuntos em um modelo de tumor subcutâneo

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K visualizações.  Washington University School of Medicine. This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses. 

Vídeo: Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Medicina

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Um modelo de tumor de bexiga ortotópico e Avaliação de Tratamento de sarna intravesical

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Renal Capsule xeno e subcutânea Pellet Implantação de Avaliação de próstata Carcinogênese e hiperplasia benigna da próstata

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

Subcutânea perfusão de angiotensina II usando osmótica Bombas Induz aneurismas da aorta em ratos

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

Avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...