Name: evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model
Uploaded: 2015-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
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이 작품은 보조금 R01-CA169354에 의해 지원되었다 &#160; 및 R01-047822 &#160; 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 보훈 (ECB)에서 우수상에서. RKP는 NIH T32 CA009287-30A1, ASCO 젊은 연구자 상, 캘리포니아 유방암 연구 프로젝트 원정대, 그리고 미국 암 협회 (American Cancer Society) 가르 연구 학술 그랜트에 의해 지원되었다; BAZ는 NIH 보조금 AI079320에 의해 지원되었다. JM은 NIH T-32 훈련 보조금 T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 및 미국 암 학회 (American Cancer Society) 박사후 PF-12-052-01-CSM에서 연구비에 의해 지원되었다.

참고 : 모든 동물 실험은 승인 스탠포드, 팔로 알토 VA HCS, 보건 기관 AnimalCare 및 사용위원회 지침 국립 연구소에 따라 실시 하였다. 1. 샘플 수집 및 처리를위한 준비 (소요 시간 : ~ 10 ~ 15 분) <ol><li> 이전 6 설명한 바와 같이 쥐 B16F0 흑색 종 세포 피하이나 여성 C57BL / 6 마우스의 복부의 중앙선 근처 (0.5 × 10 6) 접종. 대안 적으로, (예를 들면 측면, 유방 지방 패드 등)을 추가로 해부 부위에서 종양 세포를 접종. 주 : 종양의 임의의 수 (주입 또는 자발적인)이 프로토콜을 사용하여 평가할 수있다. 예를 들어, 다른 일반적 / 6 결장 선 MC38, 루이스 폐 암종 (LLC) 및 전립선 TRAMP-C2 선을 포함 C57BL 동계에서 종양을 사용 하였다. 면역 결핍 생쥐에 접종 인간 이종 이식편도 이러한 방식으로 평가 될 수 있지만, P는 것을 주목해야한다종양 침윤 백혈구 rofiles 반드시 호스트 마우스의 면역 결핍 상태에 따라서 변경 될 것이다. <ol><li> 전체 미디어 (예 : RPMI 10 % FBS 및 첨가제를 포함) 또는 다른 적절한 단백질 함유 버퍼 (예를 들어 HBSS 또는 PBS + 1 % FBS, 1 %의 BCS)를 사용합니다. 미디어를 진정 또는 이전 euthanization 4 ° C에 버퍼. </li></ol></li><li> 절제된 종양 수집 튜브 및 필터 설정; 얼음이 배치합니다. <ol><li> 종양 당 하나의 50 ML 원뿔 튜브를 사용하는 절제합니다. 각각의 40 ~ 70 μm의 세포 현탁액 필터를 삽입합니다. 또한, 금속 필터 메쉬 15 ML 원뿔 튜브를 사용합니다. 15ml의 튜브의 상단에 컵 형상의 필터를 생성하는 5 ㎖ 주사기 플런저 또는 두꺼운 펜을 사용한다. </li></ol></li><li> 절제 및 종양 처리를 위해 악기를 준비; 수술 집게와 절제하는 미세 가위 및 프로세스 종양을 사용합니다. 절제 / 종양 샘플 사이의 악기를 청소하는 70 % 에탄올을 사용합니다. 더 많은 수의 오의 경우샘플 F (예&gt; 10), 우리는 종양 샘플 사이의 처리 시간에서 상당한 차이를 방지하기 위해 여러 연구자들에 의해 표본의 동시 처리를 권장합니다. </li></ol> 2. 종양 절제술 (소요 시간 : ~ 5 분 / 종양) <ol><li> 개별적 이산화탄소 또는 기타 승인 된 방법을 사용하여 B16의 담암 마우스를 안락사. </li><li> 수술 단계에 마우스를 고정합니다. 70 % 에탄올로 종양 영역 스프레이 과잉 와이프 ​​오프; 이는 머리 존재의 확산을 방지하는 데 도움이됩니다. 필요에 따라 비 - 누드 마우스의 경우, 종래에 종양 절제 주위 피부 영역을 면도. </li><li> 집게와 가위를 사용하여 상부를 포함하고 주변 피부, 일괄하여 피하 종양 절제. 촬영 &quot;여유&quot;피부의 양은 변화하지만, 전형적으로 피부 종양 약 2-3 mm로 절제 될 수있다. <ol><li> 이 시점에서 절제된 종양 (+/- 주변 피부) 무게. (PL) 내에 고정 필터에 절제 피부 / 종양 섹션을 배치ASTIC 원뿔 튜브. </li></ol></li></ol> 3. 단일 세포 종양 서스펜션을 준비 (소요 시간 : ~ 5-7 분 / 종양) <ol><li> 사용 집게와 가위 종양 위에 놓여 / 주변 피부를 말하다. 조직의 모든 큰 부분 1 ~ 2 밀리미터 섹션으로 처리 될 때까지 가위를 사용하여 샘​​플을 말하다. 참고 : 일반적으로, 전체 종양이 처리; 대안으로, 더 큰 종양, 종양의 대표 섹션 다진 및 처리 할 수​​있다. </li><li> 일회용 5 또는 10 ㎖ 주사기의 플런저를 사용하여, 기계적으로 보호 된 필터에 대해 다진 종양 조직을 해리하는. </li><li> 피펫을 사용하여, 감기 미디어 또는 버퍼의 5 ~ 10 MLS으로 처리 된 종양 조직을 씻는다. 이 필터를 통해 단일 ​​세포를 세척한다. </li><li> 총 수 및 세척의 볼륨이 대략 비슷한 크기의 종양에 대해 동일 보장, 위의 두 단계를 여러 번 반복합니다. <ol><li> 처리 된 종양 조직을 세척 한 후, 관찰피부 및 / 또는 기타 결합 조직의 작은 조각은 필터에 남아있을 것이다. </li><li> 대안 적으로, 콜라게나 제 및 / 또는 다른 효소 단독 기계적 세분화가 충분하지 않을 종양, 소화 종래 닦지 절차로 수행 될 수있다. 이것은 더욱 철저한 단일 세포 현탁액을 허용합니다. 그러나 소화 프로토콜 표면 항원 식 (20)에 영향을 미칠 수 있으므로주의가 이러한 결과를 해석 수행되어야한다는 것을 알 수있다. </li></ol></li><li> 씻고 버퍼 / 미디어를 추가하고 5 분 동안 4 ° C 500 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛. </li></ol> 단일 세포 현탁액의 4 FACS 염색 (소요 시간 : ~ 30 ~ 60 분) <ol><li> 차가운 얼음 FACS 버퍼에 재현 탁 세포 (PBS + 1 % FBS). </li><li> 트리 판 블루와 hemacytometer, 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 볼륨 당 총 생균 수율을 결정합니다. 이 데이터를 외삽하는데 사용될 수있다FACS 데이타와 함께 종양 침윤 백혈구의 절대적 숫자. </li><li> 결정 세포 수와 염색은 FACS로 분석한다. 이것은 여러 가지 요인 (예 : 종양 조직 학적 유형, 연령, 종양 크기, 백혈구 침윤의 평균 백분율 등)에 의해 영향을받을 것이다. 주 : B16 흑색 종에서는 종양 침윤 백혈구 백분율 낮은 실측치 (TIL을 전형적으로 &lt;5 %) 종양 세포에 비해. 따라서, 적어도 1 × 106 총 종양 (종양 침윤 백혈구 +) 세포는 일반적으로 분석을 위해 FACS를 통해 수집 하였다. <ol><li> 트리 판 - 얼룩진 계수 데이터를 이용하여, 계산 된 셀의 체적에 대한 FACS 염색한다. TIL은 일반적으로 전체 종양 세포의 5 %를 구성하는 경우, 예를 들어 (종양 세포의 많은 트리 판 얼룩 죽은 것), 단일 종양 세포 현탁액의 총 개수의 요인이 염색한다. </li><li> 흔하지 백혈구 아형의 경우) + CCR9 예 : PDC (총 종양 세포를 더 많이 사용예 2-3에서는 단일 세포 현탁액 중의 이들 세포의 상대적인 저주파 주어진 FACS 염색 용) 10 X 6. </li></ol></li><li> FACS 용 단일 종양 세포 현탁액 얼룩. <ol><li> 라이브 / 죽은 차별를 들어, 고칠 얼룩 또는 비 고칠 얼룩 (예 : 프로피 디움 아이오다 이드) 사용할 수를 사용합니다. 셀 라이브 / 죽은 차별없이 염색하는 경우,주의 항체의 비 특이 적 결합의 가능성을 부여 통보해야합니다. </li><li> 표준 FACS 염색 프로토콜을 사용하여 특정 서브 세트에 대한 백혈구 세포 현탁액 얼룩. 블록 세포는 PBS / 1 % FBS 쥐 혈청의 Fc 블록 항원 - 특이 적 항체로 염색하기 전에 10 분 동안 (항 CD16 / 32)를 함유하여 비특이적 결합 된 항체를 감소시킨다. 염색 특정 확인하기 위해 올바른 이소 제어 항체를 포함합니다. </li><li> FACS 염색이 완료된 후이 시점에서, 4 % 포름 알데히드 또는 다른 유사한 고정 제와 함께 샘플을 고정한다. 다 4 ° C에서 보관 샘플RK 수집 및 분석의 시간이 될 때까지 (형광의 담금질을 피하기 위해). 주 : 오랜 시간 동안 고정 된 샘플을 저장하는 것은 형광 물질 (21)의 신호 강도의 변화가 발생할 수 있습니다. </li><li> 유량 계측기의 샘플을 수집합니다. 설정 사이토 최적의 흐름은 장비 및 레이저 / 검출기 설치 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 참고 : 또한, 심지어 같은 기계를 사용하는 경우 실험 사이에 변화가있을 수 있습니다. 따라서, FACS 수집 및 각 실험의 분석에 앞서 적절한 보정 설정을 보장하기 위해 (예 : 교정 구슬을 사용하여) 해당 기계 설치를 수행합니다. </li></ol></li><li> leukoctye 부분 집합의 분석 <ol><li> , FACS 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 라이브 / 죽은 얼룩의 경우, 죽은 세포를 게이팅에 의해 시작합니다. 살아있는 세포 내에서 백혈구를 식별하기 위해 백혈구 특정 마커 (예를 들면 항 CD45)에 대한 항체를 사용합니다. <ol><li> 이 후, 다양한 GATI를 사용NG 방식은 염색 프로토콜에 따라, 특정 서브 세트를 식별한다. 예를 들어, CD4 + T 세포를 식별 CD45 + 집단에서 SSC LO 영역을 선택하고 CD19-CD3 + 세포를 선택하는 단계; 이 CD4 + T 세포로부터 (22)를 식별 할 수있다. </li></ol></li><li> (즉, 서브 세트를 정량화 총 숫자, 백분율 또는 비율을 사용하는) 데이터를 분석하고 일관성을 보장 및 패턴 또는 트랜드를 식별하기 위해 다수의 다른 방법을 제시한다. 참고 : 예를 들어, 우리는 수집 된 총 종양 세포 (도 1)의 비율로 총 살아있는 CD45 + 세포 보았다. 또한, 우리는 백혈구 종양 내의 각 서브 세트 (예를 들어, CD4 + T 세포)의 백분율을 계산하고, 제어 및 시험 그룹 (도 3) 사이의 비율을 비교하여 이들. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

종양 미세 환경의 상세한 분석을 수행하는 메커니즘과 면역의 효과를 결정하는데 중요하다. 종양 침투 백혈구에 이러한 에이전트의 영향을 이해하는 인간의 임상 영역에서 immunotherapeutics의 증가 존재와 그들의 작용 메커니즘을 정의하는 필수가되고있다. 인간에서 종종 이와 주연 면역 반응의 분석을 획득하고 백혈구 서브셋 분석 종양 조직을 분석 및 임상 및 / 또는 로지스틱 어려움이 존재는 종...

종양의 성장 및 홍보 및 회귀 사이의 균형은, 부분적으로 미세 1, 2에 존재하는 프로와 항 종양 침투 백혈구의 균형에 따라 달라집니다. (TME)를 종양 미세 환경을 연구 구체적 침투성 백혈구 아 집단을 식별하기 위해, 우리는 쥐 종양 모델에서 피하 종양의 평가 방법을 개발 하였다. 종양 미세 환경 연구의 중요성은 잘 알려져 있으며, 문헌에지지된다. 많은 연구 프로 및 항 종양 면역 세포 침윤의 밸런스가 마우스에서뿐만 아니라, (3,4-에서 검토) 인간 결합 연구뿐만 아니라, 종양 성장의 결과에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다. 예를 들어, Curiel 등은. 난소 암 환자의 임상 결과는 종양 침윤 규제 CD4 + T 세포 (Tregs) (5)의 비율을 증가의 존재와 상관 관계가 있었다 악화 것으로 나타났다. 우리 자신의 작품 또한 아무런 효과를 보여 주었다또한, 상관 관계를 마우스 흑색 종 모델 6에 백혈구 아형의 비율 VEL 백혈구 화학 유인 물질은 종양 성장을 감소시켰다. 따라서, 종양 내의 백혈구의 서브 세트 상세한 분석은 더욱 광범위하게 인식되고 점차 중요. 백혈구 침투에 대한 종양 미세 환경을 평가하는 방법에는 여러 가지가 있습니다; 능력에 일부 - 예를 들어 그룹은 이미지 TME 7, 고전 면역 조직 화학 및 MRI, PET, 공 초점 현미경 9-11 등 다양한 이미징을 포함하여 보존 섹션 8의 면역을 위해 다양한 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 쥐를 설계했다 intravitally (10, 12) 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 나노 입자 (13)이나 신규 한 조영제 면역 세포에 라벨 (14) 등의 각종 분자 조영제로 사용될 수있다. 우리의 방법은 유동 세포 계측법 기반 접근법이며, 몇 가지 장점을 갖는다.우선, 전체 종양 미세 환경이 샘플링 될 수있다; 분석시에, 전체 주변 피하 종양 주변부 절제 수술로 처리된다. 이는 단일 종양 내의 잠재적 샘플링 바이어스를 제거하고, 전체적으로 더 많은 종양 &quot;글로벌&quot;분석을 제공한다. 둘째, 백혈구 서브 세트를 분석하는 다색 유동 세포 계측법을 사용하여보다 구체적으로 침윤하는 백혈구의 표현형을 측정 할 수있게 해준다. 사용 된 색의 개수에 따라, 매우 특정한 서브 세트가 식별 될 수있다. 심지어 일반적인 서브 타입 분류 - - 종양의 운명을 결정하는데 잠재적으로 중요한 의미를 다른 기능을 갖는 여러 특정 백혈구 세포 유형 내에서 서브 세트가 있기 때문에 중요하다. 예를 들어, 형질 수지상 세포 (PDC)은 항 종양 면역 (15)에 연루되어있다. 그러나, PDCS의 CCR9 + 서브 세트 tolerogenic 16로 도시 한 BA를 이동 한이러한 서브 세트의 랜스는 종양 성장에 영향을 미칠 수있다. 우리의 방법은 피하 또는 일괄하여 절제 할 수있는 다른 종양에 적절하고 있습니다. 우리의 손에, 종양 균일 안락사시 절제 하였다. 일부 연구에서 수행 된 바와 그러나 피하 종양이 완전히 따라서 동물의 추가 평가를 허용 생존 수술 (17)에서 주변의 피부 절제하여 고정 될 수 있음을, 생각할 수있다. 분석 후, 절제된 종양에 대해 수행된다. 따라서, 상기 결과는 종양의 발달에 단일 평가시기를 나타낸다. 이 미세 환경에 대한 자세한 모습을 수 있지만, 그것은 또한 의심의 여지 역동적 인 과정이 무엇인지의 정적 사진입니다. 그러나, 절연 백혈구 (예를 통해 자기 분리 또는 밀도 구배) previ 한 이래로 후, 종양 상피 및 간질 별도로 분석, 또는 상기 표현형을 정의하는 다른 기능 분석에 사용될 수있다ously 18을 설명했다. 이 방법은, 그 후, 자연 투병 기간의 설정에서, 또는 특정한 치료 학적 섭동 후인지, 소정의 시점에서 종양 미세 환경 내의 백혈구의 조성을 이해에 관심이있는 연구자에 유용 할 것이다. 우리가 수행되어 있지 않지만,이 절차의 변형, 잠재적으로 격리에서 종양의 특정 부분을 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 종양의 크기가 주어진 주변부 구역 (들)은 연구자에게 종양 미세 환경의 공간적 분리 더 파악할 수 있도록 거리의 중앙 종양, 괴사 가능성 코어 해부 될 수있다. 종양 면역학의 급성장 필드에 의심의 여지가 생쥐 종양 모델에서 새로운 면역 조절제를 평가하는 연구의 기하 급수적으로 증가 수 없을 것이다. 몇몇 보고서 주연 EN 대 종양 내의 특정 백혈구 기능의 차이를 강조vironment. 예를 들어, 쉐이퍼 - 버 외는.들은 종양 미세 환경 (19)에 트래픽이 일단 항원 - 특이 T의 효과기 CD8 + 세포는, 주변부에서 활성 상태, CD8 + T 억제 세포로 형질 전환 된 마우스 모델에서 나타났다. 이 TGFβ에 의한 부분이었다, 그러나 다른 요인은 가능성뿐만 아니라 참여하고 있습니다. 따라서, 백혈구 아형 평가 - 숫자 및 비율뿐만 아니라 기능적 상태 - 종양 자체 내 것은 종양 운명에 특정 면역의 효과에 대한보다 정확한 표현을 제공한다. 우리의 방법은 종양의 상세한 분석이 가능하고 연구원 더욱 가깝게 접근 이전보다 백혈구 개체수의 변화를 식별 할 수있는 기회를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro</td><td>10-040</td><td>http://cellgro.com; keep on ice</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>http://cellgro.com</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m filter</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>5 ml syringe</td><td>BD</td><td>14-823-35</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>surgical scissors/forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>roboz.com</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-030-CM</td><td>http://cellgro.com; keep on ice</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Cellgro</td><td>MT-25-900-CI</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>Hausser Scientifice&amp;nbsp;</td><td>02-671-54&amp;nbsp;</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>Live/Dead stain</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td>lieftechnologies.com</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>TreeStar, Inc</td><td></td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model

종양 미세 환경에 침투 특수 면역 세포는 종양의 성장 및 생존을 조절한다. 악성 세포는 회피 또는 생존하고 번영하기 위해 항 종양 면역 반응을 파괴해야합니다. 종양 tolerogenic DC 모집, 면역 조절 T 세포 (Tregs), 및 세포 독성 항암 반응을 억제하는 골수 유래 억제 세포 (MDSC)를 포함한 면역 상이한 메커니즘 번호 &quot;탈출&quot;활용. 종양 억제에 참여할 수있는 모든 면역 자극 수지상 세포, 선천성 항 종양 면역 항구 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포 : 반대로, 항암 효과기 면역 세포는 악성 종양 성장 및 팽창을 늦출 수있다. 프로와 항 종양 백혈구 사이의 균형은 궁극적으로 행동과 형질 전환 된 세포의 운명을 결정한다 인간의 임상 연구의 군중이를 부담했다. 백혈구 하위 집합 따라서, 상세한 분석 내종양 미세 환경은 점점 더 중요 해지고있다. 여기서 우리는 마우스 종양 모델에서 종양 미세 환경에 존재하는 백혈구 침투하는 서브 세트를 분석하기위한 방법을 설명한다. B16 마우스 흑색 종 종양 세포는 C57BL / 6 마​​우스에서 피하 접종 하였다. 지정된 시간에, 종양 주위의 피부는 일괄하여 절제 한 후 유동 세포 계측법 멀티 색상 염색 단일 세포 현탁액으로 처리됩니다. 백혈구 집합 마커의 다양한 사용하여, 우리는 제어 및 chemerin 발현 종양 사이의 백혈구 하위 집합을 침투의 상대적 비율을 비교할 수 있었다. 연구자들은 면역 종양 미세 환경에 존재하고 종양 성장의 전통적인 캘리퍼 크기 측정과 결합 될 때, 잠재적으로 그것들이 종양 성장에 면역 조성의 변화에​​ 미치는 영향을 규명 할 수 공부 이러한 도구를 사용할 수있다. 이러한 기술은 모든 종양 모델에 적용 할 수있는 종양 미세 환경과의 C이 절제되고 처리 될 수있다.

우리의 결과는 과발현 쥐 B16 종양에 chemerin의 강제 종양 침투 백혈구 (TILS)의 비율을 증가 것으로 나타났다. 또한 chemerin 발현과 연관된 종양 미세 환경 내에서 표시되는 백혈구 아형의 상대적인 비율의 변화가 확인되었다. Pachynski 등. (6) 허가를 다시 인쇄 할 수 있습니다. 도 1은 17 일 절제된 종양의 FACS 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 대조군과 비?...

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Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

20.0K 조회수.  Washington University School of Medicine. This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses. 

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Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

연구

암 연구학

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop better therapeutic strategies, understanding tumor microenvironmental factors that contribute to the treatment resistance is important. A major impediment to understanding disease mechanisms and improving therapy has been a lack of murine cell lines that resemble the aggressive and metastatic nature of human HNSCCs. Furthermore, a majority of murine models employ subcutaneous implantations of tumors which lack important physiological features of the head and neck region, including high vascular density, extensive lymphatic vasculature, and resident mucosal flora. The purpose of this study is to develop and characterize an orthotopic model of HNSCC. We employ two genetically distinct murine cell lines and established tumors in the buccal mucosa of mice. We optimize collagenase-based tumor digestion methods for the optimal recovery of single cells from established tumors. The data presented here show that mice develop highly vascularized tumors that metastasize to regional lymph nodes. Single-cell multiparametric mass cytometry analysis shows the presence of diverse immune populations with myeloid cells representing the majority of all immune cells. The model proposed in this study has applications in cancer biology, tumor immunology, and preclinical development of novel therapeutics. The resemblance of the orthotopic model to clinical features of human disease will provide a tool for enhanced translation and improved patient outcomes.

Here we present a reproducible method for developing an orthotopic murine model of head and neck squamous cell carcinoma. Tumors demonstrate clinically relevant histopathological features of the disease, including necrosis, poor differentiation, nodal metastases, and immune infiltration. Tumor-bearing mice develop clinically relevant symptoms including dysphagia, jaw displacement, and weight loss.

종양 면역 프로 파일링에 대 한 쥐 및 치료 반응 평가에 편평 세포 암 종 세포의 intramucosal 접종

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Functional Analysis of Tumor-Infiltrating Myeloid Cells by Flow Cytometry and Adoptive Transfer

The tumor-infiltrating myeloid cell compartment represents a heterogeneous population of broadly immunosuppressive cells that have been exploited by the tumor to support its growth. Their accumulation in tumor and secondary lymphoid tissue leads to the suppression of antitumor immune responses and is thus a target for therapeutic intervention. As it is known that the local cytokine milieu can dictate the functional programming of tumor-infiltrating myeloid cells, strategies have been devised to manipulate the tumor microenvironment (TME) to express a cytokine landscape more conducive to antitumor myeloid cell activity. To evaluate therapy-induced changes in tumor-infiltrating myeloid cells, this paper will outline the procedure to dissociate intradermal/subcutaneous tumor tissue from solid tumor-bearing mice in preparation for leukocyte recovery. Strategies for flow cytometric analysis will be provided to enable the identification of heterogeneous myeloid populations within isolated leukocytes and the characterization of unique myeloid phenotypes. Lastly, this paper will describe a means of purifying viable myeloid cells for functional assays and determining their therapeutic value in the context of adoptive transfer.

This protocol provides reliable methods of solid tumor dissociation and myeloid cell isolation in murine intradermal or subcutaneous tumor models. Flow cytometry allows for phenotypic characterization of heterogeneous myeloid populations within the tumor microenvironment and sorting will demonstrate their functionality in the context of adoptive transfer.

The tumor-infiltrating myeloid cell compartment represents a heterogeneous population of broadly immunosuppressive cells that have been exploited by the ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

면역학 및 감염병학

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been used in tumor vaccines to activate innate immunity and enhance antitumor responses. This protocol demonstrates a therapeutic model using cell-based tumor vaccine consisting of Flt3L-expressing B16-F10 melanoma cells along with phenotypic and functional analysis of immune cells in the tumor microenvironment (TME). Procedures for cultured tumor cell preparation, tumor implantation, cell irradiation, tumor size measurement, intratumoral immune cell isolation, and flow cytometry analysis are described. The overall goal of this protocol is to provide a preclinical solid tumor immunotherapy model, and a research platform to study the relationship between tumor cells and infiltrating immune cells. The immunotherapy protocol described here can be combined with other therapeutic modalities, such as immune checkpoint blockade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antibodies) or chemotherapy in order to improve the cancer therapeutic effect of melanoma.

The protocol presents a cancer immunotherapy model using cell-based tumor vaccination with Flt3L-expressing B16-F10 melanoma. This protocol demonstrates the procedures, including preparation of cultured tumor cells, tumor implantation, cell irradiation, measurement of tumor growth, isolation of intratumoral immune cells, and flow cytometry analysis.

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

생물학

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment response challenging. The ability to resolve the relative populations of immune cells present in and around the tumor tissue has been shown to be clinically-relevant to understanding response, but is limited by traditional techniques such as flow cytometry and immunohistochemistry (IHC), due the large amount of tissue required, lack of accurate cell type markers, and many technical and logistical hurdles. One assay (e.g., the ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overcomes these challenges by accommodating both small amounts of RNA and highly degraded RNA, common features of RNA extracted from clinically archived solid tumor tissue. The assay is accessed via a reagent kit and cloud-based informatics that provides an end-to-end quantitative, high-throughput immuno-profiling solution for Illumina sequencing platforms. Researchers start with as few as two sections of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue or 20-40 ng of total RNA (depending on sample quality), and the protocol generates an immune profile report quantifying eight immune cell types and ten immune escape genes, capturing a complete view of the tumor microenvironment. No additional bioinformatic analysis is required to make use of the resulting data. With the appropriate sample cohorts, the protocol may also be used to identify statistically significant biomarkers within a patient population of interest.

The use of an RNA-based approach to determine quantitative immune profiles of solid tumor tissues and leverage clinical cohorts for immune-oncology biomarker discovery is described through a molecular and informatics protocols.

고형 종양의 예측 면역 모델링

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...