Bu çalışma hibe R01-CA169354 tarafından desteklenen &#160; ve R01-047822 &#160; Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Gazi İşleri Bakanlığı (ECB) bir Liyakat Ödülü. RKP NIH T32 CA009287-30A1, bir ASCO Genç Araştırmacı Ödülü, Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Projesi Bursu ve bir Amerikan Kanser Derneği Mentored Araştırmacı Grant tarafından desteklenmiştir; BAZ NIH hibe AI079320 tarafından desteklenmiştir. JM NIH T-32 eğitim bursu T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 ve Amerikan Kanser Derneği doktora sonrası burs PF-12-052-01-CSM burs tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm hayvan deneyleri onaylı Stanford, Palo Alto, VA HCS ve Sağlık Kurumsal AnimalCare ve Kullanım Komitesi kurallar National Institutes göre yapılmıştır. 1. Örnek Toplama ve İşleme Hazırlanma (Zaman Gerekli: ~ 10-15 dk) <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 6 faregiller B16F0 melanoma hücrelerinin deri altından ya da dişi C57BL / 6 farelerinde karın orta hattı yakınında (0.5-1 x 10 6) inoküle. Seçenek olarak ise, (örneğin, yan, meme yağ pedi, vs) ilave anatomik bölgelerde tümör hücrelerini aşılamak. NOT: tümörlerin Herhangi bir sayıda (implante veya spontan) Bu protokolü kullanarak kullanılan ve değerlendirilebilir. Örneğin, diğer yaygın / 6 kolon hattı MC38, Lewis Akciğer Karsinomu (LLC), ve prostat TRAMP-C2 hattı dahil C57BL singenik tümörleri kullanılır. Bağışıklık yetersizliği olan farelere aşılandı insan ksenogrefleri da bu şekilde değerlendirilebilir iken, s unutulmamalıdırTümör infiltre lökositlerin rofiles mutlaka ev sahibi fare bağışıklık eksikliği durumuna göre değişmiş olacaktır. <ol><li> Tam bir ortam (örneğin, RPMI,% 10 FBS ve katkı maddeleri ihtiva eden) ya da diğer uygun bir protein içeren bir tampon (örneğin, HBSS ve PBS +% 1 FBS ve% 1 BCS) kullanın. Ortam soğuk ya da önceden euthanization 4 ° C&#39;ye kadar tampon. </li></ol></li><li> Rezeksiyon tümörler için toplama tüpleri ve filtreler ayarlayın; Buz üzerinde, bu yerleştirin. <ol><li> Tümör başına bir 50 ml konik tüp kullanın rezeke edilecek. Her birinde bir 40-70 mikron hücre süspansiyonu filtre takın. Alternatif olarak, metal filtre örgü ile 15 ml konik tüpler kullanın. 15 ml tüp en az bir kupa şekilli filtre oluşturmak için 5 ml&#39;lik bir şırınga pistonu veya kalın kalem kullanın. </li></ol></li><li> Rezeksiyon ve tümör işleme aletleri hazırlayın; Cerrahi forseps ve rezeke ince makas ve süreç tümörleri kullanın. Rezeksiyon / tümör örneklerinin arasında aletleri temizlemek için% 70 etanol kullanın. Daha fazla sayıda o içinf örnekleri (örneğin&gt; 10), biz tümör örnekleri arasındaki işlem süresi önemli farklılıklar önlemek için birden araştırmacılar tarafından örneklerin aynı anda işleme öneririz. </li></ol> 2. Tümör Rezeksiyon (Gerekli Zaman: ~ 5 dk / tümör) <ol><li> Ayrı ayrı karbon dioksit ya da başka uygun yöntem kullanılarak, B16 tümör taşıyan fareler öldürülür. </li><li> Bir cerrahi sahnede fareyi sabitleyin. % 70 etanol ile tümör alanı Sprey ve aşırı kapalı silin; Bu herhangi bir saç mevcut yayılmasını önlemeye yardımcı olur. Gerektiği gibi olmayan çıplak fareler için, rezeksiyon öncesi tümör çevresindeki deri alanını tıraş. </li><li> Forseps ve makas kullanarak, üstünde uzanan dahil ve cilt çevreleyen, en blok deri altı tümör rezeksiyonu. alınan &quot;margin&quot; deri miktarı değişiyordu, ama genellikle tümörün çevresindeki derinin 2-3 mm rezeke edilebilir. <ol><li> Bu noktada rezeke tümörleri (+/- çevreleyen deri) tartılır. Pl içinde güvenli filtre rezeke cilt / tümör bölümünü yerleştirinastic konik boru. </li></ol></li></ol> 3. Tek Hücreli Tümör Süspansiyon Hazırlamak (Gerekli Zaman: ~ 5-7 dak / tümör) <ol><li> Kullanım forseps ve makas tümör ve örten / çevreleyen deriyi kıymaya. Doku tüm büyük bölümleri 1-2 mm&#39;lik bölüme işlenir kadar makas kullanarak örnek kıyma. NOT: Genellikle, bütün tümörler işlenir; Seçenek olarak ise, daha büyük tümörler için tümör temsili bölümleri kıyılmış ve işlenebilir. </li><li> Bir tek 5 veya 10 ml şırınga bir dalgıç kullanarak, mekanik güvenli filtre karşı kıyılmış tümör dokusu parçalara ayırma. </li><li> Bir pipet kullanarak, soğuk ortam veya tampon 5-10 ml ile işlenmiş tümör dokusu yıkayın. Bu filtre sayesinde tek hücre floş olacaktır. </li><li> Toplam sayısı ve yıkama hacimleri yaklaşık benzer büyüklükteki tümörlerde aynı olmasını sağlayarak, yukarıdaki iki adımları birkaç kez tekrarlayın. <ol><li> Işlenmiş tümör dokusu yıkadıktan sonra, gözlemlemekderi ve / veya bunlarla ilgili başka dokuların küçük fragmanları filtrede kalan edilmelidir. </li><li> Seçenek olarak ise, kolajenaz ve / veya diğer enzimler ile sadece mekanik parçalanma yeterli olmayabilir tümörler, sindirim için önceden kıyma edilen prosedüre göre gerçekleştirilebilir. Bu, daha ayrıntılı bir tek hücre süspansiyonu için izin verir. Bununla birlikte, bu sindirim protokolleri yüzey antijeni ifade 20 etkiler, böylece dikkatli bu sonuçlara alınması gerektiği not edilmelidir. </li></ol></li><li> Yıkama ve tampon / ortam ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 500 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li></ol> Tek Hücre Süspansiyon 4. FACS Boyama (Gerekli Zaman: ~ 30-60 dak) <ol><li> Buz gibi soğuk FACS tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücreleri (PBS +% 1 FBS). </li><li> Tripan mavisi ve Hemasitometre, ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak canlı hücreleri saymak. </li><li> Hacim başına toplam canlı hücre verimi belirleyin. Bu veriler, tahmin etmek için kullanılabilirFACS verileri ile birlikte tümör süzücü lökositlerin mutlak sayıları. </li><li> Belirlemek hücre sayısı, lekeli ve FACS ile analiz edilmesi. Bu, çeşitli faktörlere (örneğin, histoloji tipi, tümör yaşı ve boyutu, infiltre eden lökositlerin ortalama yüzdesi, vs.) tarafından etkilenir. Not: B 16 melanoma olarak, tümör infiltre eden lökositlerin düşük bir yüzde bulunan (TIL tipik olarak &lt;% 5), tümör hücreleri ile karşılaştırıldığında. Bu nedenle, en az 1 x 10 6, toplam tümör (tümör + infıltre edici lökositler) hücreleri, tipik olarak analiz için FACS ile toplanmıştır. <ol><li> Tripan-lekeli sayım verilerini kullanarak, hücrelerin hesaplanan hacmi FACS için lekeli edilecek. TIL tipik olarak toplam tümör hücrelerinin% 5&#39;i, örneğin, (tümör hücrelerinin çok tripan leke üzerinde ölecek), tümör, tek bir hücre süspansiyonunun sayısı faktörünün bu lekelenmesine. </li><li> Daha az yaygın lökosit alt grupları için) CCR9 + pDC örneğin (toplam tümör hücrelerinin daha çok sayıda kullanınörneğin 2-3, tek bir hücre süspansiyonu bu hücrelerin görece alçak frekans göz önüne alındığında, FACS boyaması için), 10 6 x. </li></ol></li><li> FACS için tümör tek bir hücre süspansiyonu Leke. <ol><li> Canlı / ölü ayrımcılık için, bir düzeltilebilir leke veya non-düzeltilebilir leke (örn propidium iyodür) kullanılabilir kullanın. Hücre canlı / ölü ayrım olmaksızın lekeli ise, dikkatli antikorların spesifik olmayan bağlanma potansiyeli verilen haber verildi gerekmektedir. </li><li> Standart FACS boyama protokolü kullanarak belirli lökosit alt grupları için hücre süspansiyonu Leke. Blok hücreler, PBS /% 1 FBS sıçan serumu ve Fc blok antijene özgü antikorlar ile lekelenmeden önce 10 dakika süre ile (Anti-CD16 / 32) içeren ve spesifik olmayan bir antikor azaltır. Boyama özgü sağlamak için doğru izotip kontrol antikorları içerir. </li><li> FACS boyama işlemi tamamlandıktan sonra, bu noktada,% 4 formaldehit ya da diğer benzer tespit edici bir madde ile örnekleri saptamak. Dekara 4 ° C&#39;de saklayın örneklerirk toplama ve analiz zamanına kadar (fluorophores söndürme önlemek için). Not: uzun süre sabit örnekleri saklanması fluorophores 21 sinyali ve yoğunluğunda bir değişiklik ile sonuçlanabilir. </li><li> Bir akış sitometresindeki örnekleri toplayın. Ayarları sitometrede Optimum akış enstrüman ve lazer / dedektör kurulum tipine bağlı olarak değişir. NOT: Ayrıca, hatta aynı makineyi kullanan eğer deneyler arasında değişkenlik olabilir. Böylece, FACS toplama ve her deney analizi öncesinde uygun tazminat ayarını sağlamak için (örneğin kalibrasyon boncuk kullanarak) uygun makine kurulumu gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Leukoctye alt kümelerinin analizi, <ol><li> FACS veri analiz yazılımı kullanarak veri analiz etmek. Canlı / ölü leke için, ölü hücreleri yolluk başlayın. Canlı hücreler içinde lökosit tanımlamak için bir lökosit özel işaretleyici (örn anti-CD45) karşı antikor kullanın. <ol><li> Bundan sonra, farklı Gati kullanımıng düzenleri boyama protokolüne bağlı olarak, belirli alt kümelerini tanımlamak için. Örneğin, CD4 + T hücreleri tespit CD45 + nüfustan SSC lo bölgeyi seçmek ve CD19-CD3 + hücreleri seçmek için; Bu CD4 + T hücrelerinden 22 tespit edilebilir. </li></ol></li><li> (Yani alt kümelerini ölçmek için toplam sayılar, yüzdeler, oranlar veya kullanmak) verileri analiz ve tutarlılığı sağlamak ve desen veya eğilimleri belirlemek için farklı şekillerde bir dizi sunmak. Not: Örneğin, toplanan toplam tümör hücreleri (Şekil 1) bir yüzdesi olarak, toplam canlı CD45 + hücre görünüyordu. Buna ek olarak, daha sonra tümörün içinde her lökosit alt-grup (örneğin, CD4 + T hücreleri) yüzdesi hesaplanır ve kontrol ve test grupları (Şekil 3) arasındaki oranı olarak bu karşılaştırıldı. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mantovani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+the+recruitment+and+shaping+of+the+leukocyte+infiltrate+of+tumors.">Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors.</a> Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).</li><li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+despite+immunosurveillance:+immunoselection+and+immunosubversion.">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).</li><li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival.">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li><li>Pachynski, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemoattractant+chemerin+suppresses+melanoma+by+recruiting+natural+killer+cell+antitumor+defenses.">The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses.</a> J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+nude+mice+ubiquitously+expressing+fluorescent+proteins+for+color-coded+imaging+of+the+tumor+microenvironment.">Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+cancer+immunology:phenotyping+immune+cell+subsets+in+situ+in+FFPE+tissue+sections.">Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections.</a> MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).</li><li>Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+angiogenesis,+inflammation,+and+metastasis+in+the+tumor+microenvironment+with+magnetic+resonance+imaging.">Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging.</a> Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).</li><li>Schietinger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+confocal+microscopy+imaging+of+solid+tumor+destruction+following+adoptive+T+cell+transfer.">Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer.</a> Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).</li><li>Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=imaging+of+the+immune+system:+immune+monitoring+at+the+whole+body+level.">imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level.</a> Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+immunofluorescence+for+visualizing+the+microcirculatory+and+immune+microenvironments+in+the+mouse+ear+dermis.">Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis.</a> PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).</li><li>Habibollahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticle+imaging+allows+noninvasive+evaluation+of+immune+cell+modulation+in+esophageal+dysplasia.">Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia.</a> Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).</li><li>Balducci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+probe+for+the+non-invasive+detection+of+tumor-associated+inflammation.">A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation.</a> Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+induce+NK+cell-dependent,+tumor+antigen-specific+T+cell+cross-priming+and+tumor+regression+in+mice.">Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice.</a> J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).</li><li>Hadeiba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR9+expression+defines+tolerogenic+plasmacytoid+dendritic+cells+able+to+suppress+acute+graft-versus-host+disease.">CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease.</a> Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).</li><li>McLean, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BALB/c+murine+lung+alveolar+carcinoma+used+to+establish+a+surgical+spontaneous+metastasis+model.">A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model.</a> Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immune+cells+from+primary+tumors.">Isolation of immune cells from primary tumors.</a> J Vis Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Shafer-Weaver, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+Tumor-specific+CD8++T+cells+infiltrating+prostatic+tumors+are+induced+to+become+suppressor+cells.">Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells.</a> J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).</li><li>Hackstein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+and+lymphocyte+populations+in+inbred+mouse+strains.">Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains.</a> Respir Res. 13, 94 (2012).</li><li>Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells:+more+mechanisms+for+inhibiting+antitumor+immunity.">Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).</li><li>Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+and+CTLA-4+combination+blockade+expands+infiltrating+T+cells+and+reduces+regulatory+T+and+myeloid+cells+within+B16+melanoma+tumors.">PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).</li><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+integrating+immunity's+roles+in+cancer+suppression+and+promotion.">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Tümör mikroçevresinin ayrıntılı analizini gerçekleştirme mekanizmaları ve immünomodülasyon etkilerini belirlemede önemlidir. Tümör infiltre lökositler bu ajanların etkisini anlamak insan klinik alanda Immunotherapeutics artan varlığı ile etki mekanizmalarını tanımlarken koşul haline gelmektedir. İnsanlarda, çoğu zaman bu şekilde çevresel bağışıklık tepkisinin analizi elde edilmesi ve lökosit alt-küme analizi için tümör dokusu analiz ve klinik ve / veya lojistik zorlukları da bulunm...

tümör büyümesi ve teşvik ve regresyon arasındaki denge, kısmen, mikro-1,2 bulunan pro- ve anti-tümör infiltre eden lökositlerin dengesine bağlıdır. (TME) tümör mikro çalışma ve özellikle infiltratif lökosit alt-popülasyonunu tespit etmek amacıyla, bir fare tümör modelinde deri altı tümörleri değerlendirilmesi için bir yöntem geliştirdi. tümör mikro okuyan önemi de bilinen ve literatürde desteklenmemektedir. Çok sayıda çalışma, pro- ve anti-tümör infiltre eden bağışıklık hücrelerinin dengesini farede değil, aynı zamanda (3,4 gözden) insan üzerinde çalışmalar sadece tümör büyüme sonuçlarını etkileyebilir göstermiştir. Örneğin, Curiel ve diğ., Yumurtalık kanseri hastalarında klinik sonuçlar, tümör-süzücü düzenleyici CD4 + T hücreleri (Tregs) 5 oranları artırmak varlığı ile korelasyon kötüleştiğini göstermiştir. Kendi çalışmaları da bir hiçbir yerde etkisini gösterdiAyrıca korelasyon fare melanom modelinde 6, lökosit alt grupları oranına vel lökosit kemoatraktan tümör büyümesini azalmıştır. Böylece, bir tümör içindeki lökosit alt gruplarının detaylı analizler artık daha geniş tanınır ve giderek daha önemli. Lökositler infiltratif tümör mikroçevresinin değerlendirmek için birçok yolu vardır; yeteneği ile bazı - örneğin gruplar görüntünün TME 7, klasik immünohistokimyasal ve MR, PET, konfokal mikroskopi 9-11 gibi çeşitli görüntüleme yöntemleri de dahil olmak üzere korunmuş bölümlerin 8, immünofloresan amacıyla çeşitli floresan proteinleri ifade transgenik fareler tasarladık intravitally 10,12 monitör. Bu tür nano partiküller 13 veya yeni kontrast maddeler, bağışıklık hücreleri etiketlemek 14 gibi çeşitli moleküler görüntüleme maddeleri ile birlikte de kullanılabilir. Önerilen yöntem, bir akış sitometrisi dayalı bir yaklaşım ve birçok avantajı vardır.İlk olarak, tüm tümör mikro örnek olabilir; analiz sırasında, tüm deri altı tümör ve çevresindeki çevre cerrahi işlem için rezeke edilir. Bu, tek bir tümör içinde herhangi bir potansiyel örnekleme yanlılığı ortadan kaldırır ve bir bütün olarak tümörün bir daha &quot;küresel&quot; analizi verir. İkincisi, lökosit alt kümelerini analiz etmek sitometri renkli akışını kullanarak daha özel infiltre lökositlerin fenotip ölçmek için bize izin verir. Renklerin sayısına bağlı olarak, çok özel alt-gruplar belirlenebilir. Hatta genel alt tipi sınıflandırma - - tümör kaderini belirlemede potansiyel olarak önemli olan farklı işlevlere sahip birkaç lökosit belirli bir hücre türü içinde alt kümeleri olarak orada bu önemlidir. Örneğin, plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) anti-tümör bağışıklık 15 implike edilmiştir. Ancak, pDC&#39;lerde ve CCR9 + alt kümesi tolerojenik 16 olduğu gösterilmiştir, ve ba değişen olmuşturBöyle bir alt kümesi mızrak tümör büyümesi üzerinde bir etkisi olabilir. Bizim yöntem subkutan veya en blok rezeksiyon edilebilecek diğer tümörler için uygundur. Bizim ellerde, tümörler eşit ötenazi sırasında rezeke edildi. Bazı çalışmalarda yapılmıştır Ancak, bu, deri altı tümör tam böylece hayvan ek olarak değerlendirilmesine imkan veren, bir hayatta kalma cerrahi 17 çevreleyen derinin kapatılması ile çıkarıldı olabilir ki, düşünülebilir. Analize daha sonra kesilen tümörün gerçekleştirilir. Böylece, sonuç tümörün gelişiminde tek bir zaman noktası temsil eder. Bu mikro içine ayrıntılı bir görünüm sağlar, aynı zamanda şüphesiz dinamik bir süreçtir ne statik resim. Bununla birlikte, izole edilmiş bir lökosit (örneğin bir manyetik ayırma veya yoğunluk gradyanı) PREVI olduğu gibi, daha sonra tümör epitel ve stromadan ayrı ayrı analiz, ya da daha da fenotipi belirlemek için diğer işlevsel tahlillerde kullanılabilirously 18 tanımladı. Bu yöntem, daha sonra, doğal hastalık tabii ortamda veya belirli bir terapötik bozulduktan sonra olsun, belirli bir zaman noktasında tümörün mikro olan lökositlerin bileşimin anlamaya yönelik bir araştırmacı için yararlı olacaktır. Tarafımızdan yapılan olmasa da, bu prosedürün varyasyonları da potansiyel olarak izole bir tümör spesifik kısımları analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, tümörün büyüklüğü göz önüne alındığında, periferik zon (ler) araştırmacıya tümör mikro bir daha uzamsal ayrılmış bir görünüm vermek için uzak tümörün merkez, muhtemelen nekrotik çekirdek disseke edilebilir. Tümör immünoloji alanında gelişen, hiç şüphesiz fare tümör modellerinde yeni bağışıklık maddeleri değerlendiren çalışmaların bir katlanarak artan sayıda olacak. Çeşitli raporlar, periferik tr karşı tümörün içinde belirli lökosit fonksiyon farklılıkları sermiştirçevre ve do¤a. Örneğin, Shafer-Weaver ve ark., Tümör mikro-19 kaçırılan sonra antijene spesifik efektör T CD8 + hücreleri, çevre aktif iken, CD8 + T baskılayıcı hücrelerine transforme edildi, bir fare modelinde saptandı. Bu TGFβ nedeniyle kısmen oldu, ama diğer faktörler muhtemelen de katılıyor. Böylece, lökosit alt kümelerini değerlendirilmesi - sayılar ve oranlar, yanı sıra fonksiyonel durumunu - tümörün kendisi içinde tümör kaderi belirli bir immünomodülasyon etkisinin daha doğru bir temsilini verecek. Bizim teknik tümörün detaylı analiz sağlar ve araştırmacıya daha yakından önceki yaklaşımlara göre lökosit popülasyonlarının değişiklikleri tanımlamak için bir fırsat sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:229px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-040</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>http://cellgro.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 micron filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-35</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical scissors/forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>roboz.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-030-CM</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientifice&#160;</td>
			<td>02-671-54&#160;</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td>lieftechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo software</td>
			<td>TreeStar, Inc</td>
			<td></td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model

Tümör mikro sızmak İhtisas bağışıklık hücreleri neoplazi büyümesini ve hayatta kalmasını düzenler. Malign hücreler sıyrılmak veya hayatta ve gelişmek için anti-tümör immün yanıtları yıkmak gerekir. Tümörler tolerojenik DC işe, immunsupresif düzenleyici T hücreleri (Tregs), ve sitotoksik anti-tümör yanıtları inhibe miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (MDSC) gibi bağışıklık farklı mekanizmaları bir dizi &quot;kaçış&quot; yararlanmak. Tümör baskılamasında katılabilir bütün immünostimülatör dendritik hücreler, doğal bir anti-tümör bağışıklık liman doğal katil hücreler ve sitotoksik T hücreleri: Bunun aksine, anti-tümör efektör bağışıklık hücreleri habis büyüme ve genişleme yavaşlatabilir. pro- ve anti-tümör lökositlerin arasındaki denge sonuçta davranış ve transforme edilmiş hücrelerin kaderini belirler; insan klinik çalışmalarda çok sayıda bu karşılanır var. Lökosit alt kümelerinin Böylece, detaylı analiz içindetümör mikro giderek daha önemli hale gelmiştir. Burada, bir fare tümör modelinde tümör mikro-ortamında mevcut infiltratif lökosit subsetleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare B 16 melanoma tümör hücreleri, C57BL / 6 farelerine deri altından aşılandı. Belirli bir zamanda, tümörler ve çevredeki cilt blok halinde çıkarıldı ve daha sonra akış sitometrisi çok renkli boyandı tek hücre süspansiyonları içine işlenir. Lökosit alt kümesi belirteçleri çeşitli kullanarak, kontrol ve chemerin-ifade tümörler arasında lökosit alt kümelerini infiltre göreli yüzdelerini karşılaştırmak başardık. Araştırmacılar, bağışıklık tümörün mikro-ortamı varlığı ve tümör büyümesinin geleneksel kalınlığı boyutu ölçümleri ile bir araya getirildiğinde, potansiyel olarak bunları, tümör büyümesi üzerinde immün bileşim içinde değişikliklerin etkisini açıklamak sağlayacak çalışma için böyle bir araç kullanılabilir. Böyle bir teknik, herhangi bir tümör modeli tatbik edilebilir olduğu tümör ve mikro-ortam CBir rezeke ve işlenebilir.

Sonuçlarımız, fazla sentezlenme murin B 16 tümörlerinde chemerin zorunlu tümör infiltre eden lökositlerin (TILS) yüzdesi artar göstermiştir. Ayrıca, chemerin ifadesi ile ilişkili tümör mikroçevresinin içinde temsil lökosit alt gruplarının nispi oranı değiştiği tespit edilmiştir. Pachynski ark. 6 izni ile yeniden yazdırın. Şekil 1, rezeke 17. günde tümör FACS analizi ile tespit edildiği üzere, kontrol grubu ile karşılaştı...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model at JoVE.com

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses. 