Este protocolo fornece modelos reprodutíveis e imunocompetentes de ADP in vivo, adequados para estudos de genótipo, fenótipo e resposta a drogas. A principal vantagem desta técnica é sua capacidade de ajudar a investigar a progressão tumoral com um microambiente biológico singênico do tumor, mantendo a reprodutibilidade do experimento. Quem demonstrará o procedimento serão Stefanie Barthel e Chiara Falcomata, ambas do nosso laboratório.
Iniciar a preparação das células tumorais lavando o adenocarcinoma ductal pancreático, ou células PDAC, cultivadas em um frasco de cultura T75 com solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tripsina por cinco a 10 minutos para se desprender do frasco. Ressuspender as células destacadas em 10 mililitros de DMEM com 10% de soro fetal bovino, ou FBS, e 0,1% de estreptomicina de penicilina antes de transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros.
Centrifugar a suspensão celular a 200G por cinco minutos e aspirar o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em DMEM sem aditivos, com base na concentração final necessária das células para injeção. Conte as células em 10 microlitros de suspensão celular, utilizando a Câmara de Neubauer e calcule o número de células disponíveis.
Transfira um mililitro da suspensão diluída, de acordo com a concentração final requerida, para um tubo de 1,5 mililitro. Colocar o tubo em um rotador até o implante para evitar a agregação celular. Para a implantação ortotópica de células PDAC, aplique creme para os olhos no rato analgosedated enquanto o rato está a dormir.
Verifique a analgosedação suficiente antes de raspar o flanco abdominal lateral esquerdo do camundongo analgosedado. Coloque o rato, deitado do lado direito, sobre um tapete de aquecimento estéril e tape as pernas à superfície. Use luvas novas e desinfete-as.
Com tesoura cirúrgica, cortar cerca de um centímetro da pele e tecido adiposo subcutâneo longitudinalmente no flanco esquerdo, onde se projeta o baço. Com tesoura e pinça, separe a pele do peritônio para facilitar o acesso ao peritônio. Troque a tesoura antes de abrir o peritônio no local do baço com um corte longitudinal de um centímetro.
Ao mobilizar o baço e o pâncreas anexado usando pinças rombas e de ponta fina, certifique-se de que os órgãos não estejam ligados a outros tecidos. Verifique também os vasos sanguíneos fornecedores para evitar ferir os vasos ou o tecido circundante ao manusear o pâncreas. Puxe cuidadosamente o pâncreas para fora da incisão para permitir um acesso mais fácil à cauda do órgão e observe o baço seguindo o pâncreas.
Certifique-se de que o órgão não é dobrado durante a injeção e a cápsula do órgão é mantida sob tensão no local de penetração da agulha para evitar derramamento. Procure um pedaço de tecido pancreático entre os vasos sanguíneos visíveis para minimizar o risco de punção ou injeção do vaso. Usando a mão dominante, penetre cuidadosamente na cápsula do órgão com uma cânula de calibre 27 e seringa de 50 microlitros seguindo o eixo longitudinal do órgão.
Depois de injetar os 20 microlitros de suspensão contendo 2.500 células na área da cauda do pâncreas, mantenha o pâncreas e a seringa inserida imóvel por aproximadamente um minuto para evitar derramamento das células tumorais. Em seguida, remova a agulha do local de injeção. Em seguida, reorganize cuidadosamente os órgãos dentro do abdômen sem ferir o tecido para evitar derramar as células.
Evite a adesão de órgãos despejando um mililitro de cloreto de sódio a 0,9% sobre os órgãos. Após a sutura do peritônio pela técnica de sutura simples interrompida, fechar a pele com dois a três clipes de aço inoxidável de nove milímetros. Em seguida, antagonize a analgosedação com midazolam, medetomadina e fentanil, ou MMF, com uma injeção subcutânea de AFN de acordo com o peso corporal do camundongo.
Uma vez feito, coloque o rato numa câmara aquecida de 37 graus Celsius até que esteja acordado e completamente ativo. Coloque o mouse ativo de volta em sua gaiola original e monitore o estado de saúde do mouse verificando o pelo, a cor da pele e a atividade, e repita de três a quatro horas após a cirurgia. Na RM de camundongos implantados, o enxerto de células PDAC foi palpado abdominalmente mais precocemente, aproximadamente sete dias após a cirurgia, dependendo do número de células injetadas e das características de agressividade e crescimento da linhagem celular inoculada.
A sobrevivência dos camundongos implantados variou dependendo das características intrínsecas das células tumorais das linhagens celulares. Injeções intrapancreáticas bem-sucedidas levaram a tumores completos no pâncreas de camundongos. Em contraste, implantes malsucedidos resultaram na ausência de tumores pancreáticos devido à injeção de células inviáveis, rejeição das células implantadas ou injeção de um número insuficiente de células.
Lembre-se de prestar atenção para não derramar nenhuma célula durante as injeções e não ferir nenhum tecido circundante para evitar que as células se espalhem dentro do abdômen. Após esse procedimento, estudos in vivo, como estudos pré-clínicos de resposta a drogas, podem ser realizados em camundongos imunocompetentes, seguidos, por exemplo, de fatos, sequenciamento ou análise histológica para investigar interações do hospedeiro tumoral.
