NGL foi apoiado pela Iniciativa Universidade Wayne State Perinatal em Saúde Materna, Perinatal e Saúde da Criança. Agradecemos Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) para sua leitura crítica do manuscrito.

Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética animal deve ser dada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local e os institucionais Review Boards. Ao trabalhar com sangue animal, células ou agentes perigosos, como mencionado neste protocolo, as ações de biossegurança e segurança laboratoriais adequadas devem ser seguidas. 1. Rato Manuseio e Recolha de Tecidos <ol><li> Prepara-se uma estação de trabalho estéreis e obter ferramentas estéreis para a recolha de tecido. Essas ferramentas incluem tesouras grandes e pequenas cirúrgicas, fórceps, e pinças de ponta fina. Incluem pequenas placas de Petri marcadas com os nomes apropriados de tecidos, cheio com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) (3-5 ml) equilibrada à temperatura ambiente (20-22 ° C). Também incluem uma grande placa de Petri, não marcado, encheu-se com solução de PBS 1x (10 - 15 mL). </li><li> Eutanásia um ratinho grávida (10,5-19,0 ​​dias pós-coitum (DPC) ou antes da entrega) utilizando dióxido de carbono (CO 2). Para garantir que o rato é sacrificado, use a técnica de deslocamento cervical. Nota: Antes de 10,5 dpc, é difícil separar manualmente os tecidos deciduais dos tecidos uterinos. Se o isolamento de leucócitos deciduais não é necessária, a partir de leucócitos nos tecidos uterinos dos ratos não grávidas ou aqueles de ratinhos a &lt;10,5 dpc pode também ser realizada seguindo este protocolo. </li><li> Utilizando um par de tesouras cirúrgicas esterilizadas, remover completamente a porção abdominal inferior da pele e do tecido muscular. Com uma pinça, afastar todos os outros órgãos até o útero e os ovários são visíveis. Com o útero ainda ligado, utilizar a pinça para se mover para fora da cavidade peritoneal (Figura 1A). </li><li> Localize os ovários distais à junção oviduto e uterotubal de cada corno uterino. Usando as pequenas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na junção uterotubal e separar os cornos uterinos do mesentério contendo os vasos uterinos; então,consumos específicos no colo do útero para separar os cornos uterinos da cavidade peritoneal (Figura 1B). </li><li> Com pequenas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão entre o colo do útero e o segmento inferior dos cornos uterinos. Deixar ligada uma porção do colo do útero durante este processo (Figura 1C) para evitar a abertura do corno uterino. </li><li> Mergulhar os cornos uterinos (incluindo colo do útero) num grande prato de Petri cheio com solução de PBS 1x (10 - 15 ml) para hidratar os locais de implantação. </li><li> Enquanto ainda imersos em solução de PBS 1x, aparar qualquer gordura dos cornos uterinos com as pequenas tesouras cirúrgicas. Manter os tecidos imersos em solução de PBS 1x toda a dissecção. </li><li> Segurando os cornos uterinos no lugar com a pinça, retire um dos locais de implantação do útero com um corte transversal através da região inter-implantação, utilizando as pequenas tesouras cirúrgicas (Figura 1D). O local da implantação contém o feto, rodeado pelamembrana corioalantï¿½ca, e uterina, decidual, e os tecidos placentários. </li><li> Usando fórceps, segure o local no lugar e fazer uma pequena incisão na parede uterina adjacente à placenta e tecidos deciduais (Figura 1E). Guarnição em torno do perímetro da placenta / decídua até que estas se separar tanto a parede uterina e da membrana corioalantóica que inclui o feto (Figura 1F). </li><li> Remover a placenta e tecidos deciduais ligados e coloque em solução PBS 1x (3-5 ml; veja o passo 1.12). </li><li> Inserir o feto rodeado pela membrana corioalantóica ligado aos tecidos uterinos em uma placa de Petri com solução de PBS 1x (3-5 mL). A hidratação destes tecidos vai facilitar a separação da membrana corioalantóica da parede uterina (ver passo 1.14). </li><li> Usando um par de pinças de ponta fina, delicadamente descascar o tecido decidual (camada branca-acinzentada) a partir da superfície placentária. Execute estapasso com cuidado para manter a integridade da placenta e tecidos deciduais (Figura 1G). </li><li> Coloque a placenta e tecidos deciduais em duas placas de Petri marcadas separadamente cheios com uma solução de PBS 1x (3-5 mL de cada). </li><li> Remova cuidadosamente a parede uterina da membrana corioalantï¿½ca com uma pinça de ponta fina. Estes são os tecidos uterinos. </li><li> Colocar os tecidos uterinos em uma placa de Petri com solução de PBS 1x (3-5 mL). </li><li> Repita os passos 1.8 a 1.15 até que todos os locais de implantação foram processadas. </li><li> Recolha diversos uterino, decidual, e tecidos da placenta para melhorar o rendimento das células durante a digestão enzimática. A quantidade de tecidos depende do tamanho da ninhada; no entanto, o isolamento de leucócitos requer&gt; 2 peças de tecido. Nota: Para informações mais detalhadas sobre a dissecação dos locais de implantação em diferentes dias gestacionais, visualizar as imagens encontradas no capítulo dois do Guia para investigatiem 42 de rato Gravidez. </li></ol> 2. uterina, Decidual, e Placentário dissociação Tissue <ol><li> Rotular vários estéreis 2 ml tubos cónicos com o nome do tecido adequado, e colocar num frasco com 1000 ml de solução enzimática em gelo. </li><li> A partir da placa de Petri com solução de PBS 1x, transferem dois pedaços (100-150 mg) de uterina, decidual, ou tecidos da placenta para um tubo de 2 ml rotulados cónica. </li><li> Adicione 500 ml de solução enzimática frio em cada 2 ml tubo cônico. </li><li> Com uma tesoura fina estéreis, começam a dissociar o tecido imerso na solução enzimática até que seja finamente picados. Ao longo do tempo, a suspensão irá desenvolver uma aparência leitosa. Este passo não deve ser superior a mais de 2 minutos para evitar o excesso de manipulação da amostra. </li><li> Uma vez que o tecido foi dissociado, adicionar um extra de 500 mL de solução enzimática frio para a 2 ml tubo cônico. </li><li> Colocar o tubo cónico de 2 ml em gelo. </li><li> Repita os passos 2.2 a 2.6 com todos os tecidos até que todos os tecidos foram processados. </li><li> Transferir todos os 2 ml de tubos cónicos com tecido homogeneizado (tecido moído + solução enzimática) amostras do gelo em uma incubadora a 37 ° C e realizar uma agitao orbital suave (80 rpm). Incubar durante 30 - 35 min. Certifique-se de que a temperatura da incubadora é estabilizado antes do início do tempo de incubação. </li><li> Após a incubação, remove os 2 ml de tubos cónicos com tecidos dissociada da incubadora e colocá-los em gelo para evitar mais digestão. </li><li> Rotular estéreis de 50 ml tubos cônicos de acordo com o tipo de tecido. Retire as tampas e substituí-los com um filtro de células estéril (100 tamanho de poro). </li><li> Pour os tecidos dissociados do 2 ml de tubos cónicos de células através do filtro, utilizando ~ 20 ml de solução de PBS 1x. Os fragmentos de tecido permanece no filtro de células e a suspensão de células passarão através dela. </li><li> Lava-se a ditecidos ssociated no filtro celular de 2 - 3 vezes com 20 ml de solução de 1x PBS utilizando uma pipeta de transferência. </li><li> Lave os vazios 2 ml tubos cônicos com solução PBS 1x (1 ml) e despeje o conteúdo através dos filtros celulares. </li><li> Retire os filtros celulares de 50 ml tubos cônicos e substituir as tampas. Centrifugar os tubos a 1250 xg durante 10 minutos a 4 ºC. </li><li> Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. O sedimento celular contém os leucócitos e células do estroma isoladas. </li><li> Re-suspender o sedimento de células em 1 ml de meio de cultura RPMI sem soro fetal bovino (FBS). Misture delicadamente. Não use vortex. </li><li> Adicionar 500 uL de SBF puro para um tubo de poliestireno de 5 ml de plástico e sobrepor-se lentamente a suspensão de células. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 1100 xg, sem o travão à TA para sedimentar as células viáveis ​​quando os restos celulares são retidos na interface PBS / FBS. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem tocar no sedimento celular. O cell pastilha contém principalmente células viáveis. </li><li> Opcionalmente: Para concentrar as células mononucleares, usar uma solução de polissacárido saturada de 20%, como descrito abaixo. <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 1000 uL de meio de cultura RPMI sem FBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de polissacárido saturada de 20% para um tubo de plástico de poliestireno de 5 ml e sobrepor-se lentamente a suspensão de células no topo desta solução, de acordo com as instruções do fabricante. Enquanto a disposição em camadas da amostra, evitar a mistura da solução de polissacárido saturada de 20% com a suspensão de células. </li><li> Centrifugar com um rotor basculante para fora a 500 xg durante 30 min à TA sem travão. É muito importante para desativar o freio para evitar misturar as células e perder o gradiente. As células mononucleares podem ser encontrados na interface entre a solução de polissacárido saturada a 20% e a solução de PBS 1x. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante. O sedimento de células contém principalmente células mononucleares. Nãote: Para realizar a coloração de viabilidade e coloração intracelular, consulte a etapa 3. Para realizar a imunofenotipagem, consulte a etapa 4. Para realizar a coloração de viabilidade e coloração extracelular somente, veja o passo 5. Para executar uma cultura de células de leucócitos isolados, consulte o passo 6. Para executar separação de células magnéticas, consulte a etapa 7. </li></ol></li></ol> 3. a coloração de viabilidade para Células fixável <ol><li> Ressuspender o sedimento de células em 1,100 ml de solução de PBS 1x. Misturar suavemente usando uma micro-pipeta. </li><li> Transferir 100 ul da suspensão de células para um tubo de plástico de 5 ml de poliestireno. Adicionar 400 ul da solução 1x PBS para o tubo de polistireno de 5 ml. Este tubo é um controlo de tecido auto-fluorescência. Armazenar a 4 ° C até o passo 3.5. </li><li> Transferir os restantes 1.000 ul da suspensão de células para um novo tubo de 5 ml de poliestireno plástico. Adicionar 1 mL do corante de viabilidade e homogeneizar suavemente. Incubar durante 30 minutos no escuro a 4 ºC. </li><li> Após a incubação, adicionar 1000 &amp; #181; l de solução de PBS 1x. Misture delicadamente com a mão. </li><li> Centrifugar ambos os tubos de poliestireno de 5 ml de plástico (as etapas 3.2 e 3.3) a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Nota: O sedimento de células (passo 3.3) vai ser usado no passo 4. O sedimento de células (passo 3.2) vai servir como um controlo para o tecido auto-fluorescência. </li></ol> 4. A imunofenotipagem <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 50 ul de anti-ratinho de CD16 / CD32 (diluído 1: 100 em tampão de SCAF [BSA a 0,1%, azida de sódio a 0,05%, solução de 1X PBS, pH 7,4]). Misturar suavemente a suspensão de células. Não use o vórtice. </li><li> Incubar a suspensão de células no tubo de polistireno de 5 ml no escuro a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Após a incubação, adicionar 50 ul de cada anticorpo monoclonal anti-leucócito reagir com os marcadores de superfície celular ou extracelular anticorpo de controlo de isotipo coincidente (diluições de anticorpos deve ser validado). Por exemplo, para analisar as sub-populações de leucócitos, usar anti-Moutilizar os anticorpos que reagem com os seguintes marcadores de superfície de células de leucócitos: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 e (Tabela 1). </li><li> Uma vez que os anticorpos contra marcadores extracelulares foram adicionados a 5 mL do tubo de poliestireno de plástico, mistura suavemente. Incubar no escuro durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Durante esta incubação, preparar e pré-aquecer a solução de tampão de fixação (diluída com água desionizada, 1: 5) a 37 ° C, se necessário. Mantenha o tampão a 37 ºC no escuro até que seu uso é necessário. </li><li> Após 30 min de incubação, adicionar 500 ul de tampão de FACS na 5 ml tubo plástico de poliestireno e misturar suavemente. Este passo é necessário para lavar as células e remover qualquer excesso de anticorpo não ligado. </li><li> Centrifugar as amostras a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Nota: Se a coloração intracelular não é necessário, ver passo 5. Se a coloração intracelular é necessário, efectuar a permeabilização e intracelularcoloração ular aqui, e então prosseguir com a fixação (passo 4.8). </li><li> Adicionar 500 ul da solução tampão de fixação pré-aquecido ao sedimento de células e incuba-se no escuro durante 10 min a 37 ºC. </li><li> Dispensar 500 ul de tampão de FACS na 5 ml tubo de poliestireno plástico. Misture delicadamente. </li><li> Centrifugar as amostras a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de FACS para cada amostra. Estas amostras podem agora ser analisadas por citometria de fluxo. Adquirir as amostras imediatamente para obter melhores resultados. </li></ol> 5. a coloração de viabilidade de células unfixable <ol><li> Depois de imunofenotipagem extracelular, ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão de FACS. </li><li> Adicionar 1 ml de 4 &#39;, dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, a 200 ng / ml) imediatamente antes de adquirir a amostra. </li><li> Visualizar as amostras dentro de 1-2 minutos após a adição de DAPI utilizando um citómetro de fluxo. </li></ol><ol><li> Prepare uma estação de trabalho sob uma coifa estéril. Pré-aquecer o meio de cultura RPMI a 37 ° C usando um banho de água. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1000 ul de tampão de FACS para contagem das células. </li><li> Contar o número de células viáveis ​​utilizando um contador de células automático ou hemocitómetro e solução de azul de tripano a 0,4%, seguindo as instruções do fabricante. Grave a contagem total de células vivas. </li><li> Centrifugar as células a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min para remover o tampão de SCAF. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de meio de cultura RPMI pré-aquecido por pipetagem suave de 2 a 3 vezes. </li><li> Placa o número desejado de células em um filtro estéril placa de 24 poços e incuba-se a 37 ° C. O tempo de incubação será determinada pela questão de pesquisa. </li></ol> 7. Magnetic Seleção celular <ol><li> Configurar uma estação de trabalho limpo, com os seguintes materiais: Colunas MS, separadores de células magnética, 15tubos cónicos de 30 ml uM filtros de pré-separação, e um multi-suporte. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão de MACS (0,5% de BSA, EDTA 2 mM, solução de 1x PBS, pH 7,2). </li><li> Usando um contador de células automático ou hemocitï¿½etro e 0,4% de solução de azul de tripano, contar e registrar a contagem total de células vivas. </li><li> Centrifugar as células a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Adicionar mais 500 ul de tampão MACS. </li><li> Avance para realizar a separação magnética seguindo as recomendações do fabricante. </li><li> Determinar a pureza por citometria de fluxo ou microscopia. </li></ol>

Os autores revelam que não há conflitos de interesse.

A coleta de dados consistentes que registra as características fenotípicas e abundância de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial para a compreensão da patogênese das complicações relacionadas com a gravidez. Foram descritas várias técnicas que facilitam o isolamento de leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal durante a gravidez 31,38,39,43-46. No entanto, cada técnica é diferente, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferente...

Tolerância imunológica em gestação é um período em que ocorrem alterações distintas dentro do sistema imunológico da mãe. Estas mudanças permitem que a mãe de tolerar o feto, um enxerto alogênico semi-1. O feto expressa complexo principal de histocompatibilidade paterna (MHC) 2, e as células fetais têm sido encontrados na circulação materna 3; Contudo, o feto não seja rejeitada 4,5. Este enigma não é totalmente compreendido. A hipótese mais recente indica que a tolerância materno-fetal é criado durante o coito e fecundação 6,7 e mantido para manter uma gravidez completa 8-10. A repartição deste tolerância materno-fetal é considerado um mecanismo de doença durante os estágios precoces e tardios da gravidez 10-16. Tolerância materno-fetal envolve a participação de várias sub-populações de leucócitos, incluindo células T (células T reguladoras, células Th1, as células Th2 e células Th17), macrophages, neutrófilos, células mastro, células NK e células NKT, células dendríticas e células B, que a mudança em densidade e localização ao longo da gravidez 15,17-19. Tolerância materno-fetal é enriquecido na interface materno-fetal 20 - o local anatómico em que o sistema imune da mãe interage com os antigénios fetais 20,21. A interface materno-fetal é criado durante a placentação quando as células dos trofoblastos fetais extravilosas invadir a mucosa uterina 22-24. No lado fetal desta interface, as membranas que envolvem o feto criar uma superfície epitelial especializado dentro da placenta, e as células de trofoblasto controlar a troca de nutrientes através do seu contacto directo com o sangue materno 22. No lado materno da interface, a decídua recruta uma piscina heterogénea de leucócitos nos ratinhos que respondem por 30% a 50% de todas as células deciduais. Além de sua participação na Materntolerância imunológica al, estas células são principais contribuintes para diferentes processos durante a gravidez, por exemplo., a proteção do trato reprodutivo de infecções, fecundação, implantação do embrião 7,25, angiogênese decidual 26, remodelação vascular 24,27, a invasão do trofoblasto 28, placentária desenvolvimento 24,25, e, em última análise, o trabalho de parto 15,17. Por conseguinte, o estudo dos leucócitos envolvidas na tolerância materno-fetal é essencial para a elucidação da patogénese de complicações relacionadas com a gravidez. Embora a utilização de imuno-histoquímica e imunofluorescência gerou dados para a visualização directa e localização de uterina, decidual, ou leucócitos da placenta 29,30, análise de citometria de fluxo revelou mais subconjuntos específicos de leucócitos em cada um destes tecidos 31,32. Além disso, citometria de fluxo foi utilizada para determinar a densidade e a proporção de maternal-fetal interface de leucócitos 33 e expressão níveis de proteínas extracelulares e intracelulares 8-10,34. Análise citométrica de fluxo de leucócitos na interface materno-fetal requer uma suspensão de célula única. A fim de isolar leucócitos infiltrantes do decidual, útero, placenta e tecidos, dois métodos de dissociação de tecidos têm sido usados: mecânica e enzimática. Os dois métodos permitem a separação de leucócitos infiltrados a partir da matriz extracelular (ECM) desses tecidos. Dissociação enzimática tecido é superior à dissociação mecânica do tecido, uma vez que permite uma maior produção de leucócitos associada com danos-cisalhamento-força inferior a 35. Consequentemente, a dissociação do tecido mecânico exige a agregação tecidos 36, que podem aumentar a variabilidade ea heterogeneidade das amostras. No entanto, a dissociação mecânica pode ser a escolha quando o antigénio de interesse pode ser alterada por dissociação enzimática ou quando a funcionalidade da célulaS de interesse devem ser preservados (por exemplo., a citotoxicidade de células NK) 35. O uso da proteólise com enzimas específicas para degradar a ECM elimina os rendimentos baixos observados com dissociação mecânica. Vários estudos têm relatado o uso de tripsina 32, colagenase 37, DNase 31, Dispase 38, e cocktails comerciais de várias enzimas 32,39. No entanto, a natureza e concentração de enzimas diferentes e a duração da digestão deve ser cuidadosamente definida e validada, a fim de garantir a manutenção da integridade dos epitopos antigénicos de superfície celular necessárias para a imunofenotipagem. As várias estruturas de superfície são diferencialmente sensíveis à destruição por enzimas diferentes, com algumas enzimas, como a tripsina, sendo notório para a decapagem de epitopos de superfície de leucócitos reconhecidos por muitos anticorpos monoclonais. Aqui introduzido é um método que utiliza um proteolytic e coquetel enzimático colagenolítica, chamado Accutase. Esta solução enzimática é suficientemente suave enquanto ainda eficaz na distinção entre tecidos murinos na interface materno-fetal, e não requer a adição de outros reagentes ou soro de dissociação para terminar a reacção de dissociação. Além disso, ela está pronta para uso imediato e, embora o tempo de dissociação deve ser validado, é mais robusta do que as enzimas acima mencionadas 40,41. A utilização de uma combinação de ambos os tipos de desagregação do tecido melhora a qualidade e quantidade de células obtidas; assim, vários estudos têm implementado o uso combinado de dissociação mecânica e enzimática com resultados satisfatórios 31,32,37. O protocolo aqui descrito foi estabelecido e validado no nosso laboratório; utiliza uma combinação de uma dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta. Este protocolo permite o estudo de isolamento e mais deos leucócitos que se infiltram nos tecidos murinos na interface materno-fetal (útero, decidua, e placenta). O protocolo seguinte também mantém a integridade dos marcadores da superfície das células e rendimentos de células viáveis ​​suficientes para aplicações a jusante, como demonstrado por análise de citometria de fluxo. Finalmente, este protocolo mantém a consistência da preparação de células para análise e comparação dos diferentes tecidos de murino que compõem a interface materno-fetal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Tolerância imunológica durante a gravidez requer que o sistema imunológico da mãe sofre alterações distintas, a fim de aceitar e nutrir o feto em desenvolvimento. Essa tolerância é iniciada durante o coito, estabelecida durante a fecundação e implantação, e mantida durante toda a gravidez. Mediadores celulares e moleculares activas de tolerância materno-fetal são enriquecidas no local de contacto entre os tecidos fetal e materno, conhecida como a interface materno-fetal, o que inclui a placenta e o útero e tecidos deciduais. Esta interface é composto de células do estroma e os leucócitos que se infiltram, e as suas características fenotípicas e abundância alterar no decorrer da gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal incluem neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células mastro, células T, células B, células NK, células NKT e que em conjunto, criam o micro-ambiente local que sustenta a gravidez. Um desequilíbrio entre essas células ou qualquer inappropriate alteração nos seus fenótipos é considerado um mecanismo de doença na gravidez. Portanto, o estudo de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial, a fim de elucidar os mecanismos imunológicos que levam a complicações relacionadas com a gravidez. Descreve-se aqui um protocolo que utiliza uma combinação de dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta com um cocktail enzimática proteolítica e colagenolítica para isolar os leucócitos que se infiltram nos tecidos de murino na interface materno-fetal. Este protocolo permite o isolamento de um elevado número de leucócitos viáveis ​​(&gt; 70%) com propriedades antigénicas e funcionais suficientemente conservadas. Os leucócitos isolados podem então ser analisados ​​por várias técnicas, incluindo imunofenotipagem, separação de células, imagiologia, immunoblotting, a expressão do mRNA, cultura de células, e em ensaios funcionais in vitro tais como reacções de leucócitos mistos, proliferação ou ensaios de citotoxicidade.

A dissecação de tecidos de murino a partir da interface materno-fetal é mostrado na Figura 1; este procedimento inclui a abertura da cavidade peritoneal (Figura 1A, B), cornos uterinos (Figura 1C), incluindo os locais de implantação (Figura 1D), e a recolha dos tecidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), e tecidos deciduais (Figura 1G) em 16,5 dpc. A Figura 2 mostra a morfo...

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Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K visualizações.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

Vídeo: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Imunologia e Infecção

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolamento e Transplante de diferentes envelhecidas murino tímicos enxertos.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...