The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.

Todos os procedimentos que envolvem animais foram realizados em conformidade com as recomendações contidas no Código de Prática australiano para o Cuidado e Utilização de animais para fins científicos. O protocolo deste estudo foi aprovado pelo Comitê Animal Care e Hospital de Ética da Royal North Shore. Feminino ratos Fischer 344 (F344, 150-200 g) foram mantidos no Centro de Kearns, Instituto Kolling em condições padrão (12 horas de luz / ciclos escuros e livre acesso a comida e água). Nota: Um diagrama de fluxo para todos os procedimentos experimentais é apresentada na Figura 1. 1. Preparação de células para Implantação <ol><li> Cultura do mesotelioma rato linha celular de II-45 (também conhecida como IL-45; derivados por introdução peritoneal de amianto crocidolite) em meio RPMI 1640 (RPMI) meio suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e crescer em condições padrão (37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2). Maintaem por passagens e sub-cultura, a cerca de 1:50 duas vezes por semana num frasco de 75 cm 2. </li><li> Preparar reagentes para cultura de células e as alíquotas quente a 37 ° C. Reagentes necessários incluem meios RPMI isento de soro (SFM), RPMI com FBS a 10%, solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 0,5% de tripsina-EDTA. </li><li> Células de cultura para a implantação, aproximadamente, 70-80% de confluência. Isto assegura que eles estão em fase de crescimento linear. </li><li> Células colheita descartando os meios de comunicação, lavando uma vez com 5 ml de PBS estéril e, em seguida, adição de 3 ml de 0,5% de tripsina-EDTA. </li><li> Retorno frascos à incubadora durante aproximadamente 5 min até que todas as células tornam-se não aderentes. </li><li> Uma vez que as células são não aderentes, adicionar 3 ml de meio RPMI com FBS a 10% para inactivar a tripsina. Coletar e centrifugar células a 300 xg por 3 min. </li><li> Lava-se a pelete de células em 10 ml de SFM e centrifugar novamente a 300 xg durante 3 min. </li><li> Lave o peletizado de células novamente com 10 ml de SFM e centrifugar como acima. </li><li> Ressuspender as células em 10 ml de SFM e executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro ou instrumentação semelhante. </li><li> Dilui-se as células de modo que de 100 ul contém a quantidade de células a serem implantadas. Nota: O crescimento do tumor foi demonstrada em uma dose tão baixa quanto 100 células em 100 ul, mas uma dose padrão é de 500.000 células em 100 ul. </li><li> Preparar células em meios suficientes para o número de ratos para ser implantado (por exemplo, 100 uL / rato) e de pelo menos 0,5 ml extra para compensar as perdas de priming e o volume morto da agulha. </li><li> Prepare suficiente SFM (sem células) a serem implantados em ratos de controlo (isto é, 100 ul / rato) e de pelo menos 0,5 ml adicional. Nota: As células e SFM agora está pronto para implantação. Eles devem ser mantidos a 37 o C e implantou dentro de 2 horas de colheita para manter a viabilidade. </li></ol> 2. Ensaios in vivo implantação de células<ol><li> Colocar o rato F344 (&gt; 13 semanas de idade) na câmara de indução e anestesiar usando 1,4% inalação de isoflurano (ou o método em uso na instalação). Uma vez que o rato parece ser jogada no sono-la da câmara para um cone de nariz (com 1,4% de isoflurano fluir), coloque-o em suas costas com o peito virado para cima (vista ventral). Isto permite que os órgãos internos para resolver distância da cavidade torácica. Verificar reflexos de acordo com protocolos institucionais para assegurar o rato é completamente anestesiados. </li><li> Raspar a área certa regio costalis (peito) para remover a pele. </li><li> Limpar a área rapada com 80% v / v de etanol. </li><li> Identificar o local da injecção: no lado direito, encontrar a segunda glândula começando craniana. O local de injecção é de 0,5 cm proximal a este, entre os dias 3 e 4 da nervura da extremidade caudal da caixa torácica. (Figura 2A). </li><li> Misture delicadamente as células II-45 para voltar a suspender. Desenhar lentamente a suspensão de células (ou SFM para ratos controle) para um 1 ml &amp;# 160; seringa sem agulha acoplada. Se uma agulha é ligado para a elaboração de células existe o potencial para as células a crescer ao longo da linha de injecção com agulhas. Anexar um 23G x 1 ¼ agulha. Primeiro a agulha e remover as bolhas de ar. </li><li> Uma vez que a seringa ea agulha estão prontos, coloque a 20 mm de comprimento e 5 mm de diâmetro espaçador sobre o eixo da agulha. Isto é utilizado para evitar que a agulha de penetrar muito profundamente na cavidade pleural durante a injecção. Aproximadamente 5 mm-12 mm de agulha exposta é suficiente para a penetração através das nervuras, sem danificar qualquer dos órgãos. </li><li> Insira lentamente a agulha entre as costelas, chamar de volta na seringa para garantir um vaso sanguíneo foi perfurado (o sangue não deve aparecer na seringa), em seguida, injectar 100 ul células ou SFM. (Figura 2B). </li><li> Remova a agulha e rolar suavemente o rato de lado a lado para espalhar células na cavidade torácica. </li><li> Coloque o rato em uma gaiola e verificar se há recuperação. ºe rato deve ser acordado dentro de 1 min e começando a se movimentar. </li><li> Repetir para cada rato, utilizando uma agulha nova. Reutilizar a mesma agulha vai resultar no crescimento celular ao longo da linha de injecção da agulha. </li><li> Monitorar o bem-estar dos animais diariamente. </li><li> Eutanásia dos animais nos pontos de extremidade eticamente definidos como regido pelo comitê de ética institucional animais. Os pontos finais para os ratos éticos nestas experiências foram perda de peso superior a 10% ou respiração ofegante. </li></ol> 3. Colheita de sangue da veia da cauda <ol><li> Se o sangue deve ser coletado imediatamente pós-implante de células, manter o rato anestesiado. Se a amostragem de sangue em outro ponto do tempo, anestesiar o rato usando 1,4% inalação de isoflurano. Verificar reflexos de acordo com protocolos institucionais para assegurar o rato é completamente anestesiados. </li><li> Colocar o rato para o lado e localizar uma veia lateral da cauda. </li><li> Esterilizar a cauda com etanol 80% e rotular um 0,5 ml EDTA ctubo ollection. </li><li> Para a coleta de sangue, sempre começar na extremidade caudal da cauda (cerca de um terço do caminho ao longo). Isto permite que novas tentativas mais perto da extremidade craniana da cauda no caso da primeira tentativa não for bem sucedida. Nunca resample caudal pois isso pode causar um coágulo de sangue. </li><li> Posicione um 23G x 1 ¼ agulha paralela à veia lateral e deslize-o para dentro da veia em um ângulo raso para que ele penetra aproximadamente 10 mm (Figura 3A). </li><li> Nota: Se a veia foi perfurado com sucesso sangue será visível na extremidade de fixação da agulha (Figura 3B). </li><li> Uma gota de sangue irá formar na cauda no local da punção. Recolha este sangue com uma pipeta e transferido para as rotulados 0,5 ml (ou menor) tubo de coleta de EDTA. Para o ensaio de células imunitárias 25 uL é suficiente. Aplique gaze com pressão para perfurar site até o sangramento parar. </li><li> Flick o tubo de sangue para misturar o sangue e EDTA a prcoagulação do evento. Manter o tempo entre a recolha de sangue e de mistura com o EDTA o mais curto possível para evitar a coagulação. </li><li> Quando recolha de sangue a partir de múltiplas lojas ratos amostras EDTA-sangue em um rack em temperatura ambiente, até a análise. Processo de sangue dentro de 2 horas da coleta. </li></ol> 4. Preparação de Amostras para Immune Profiling celular Usando o método baseado no Bead Nota: Este método baseia-se na plataforma única usando tubos de contagem absoluta disponível comercialmente que têm um número conhecido de grânulos para cada amostra. Estes tubos contêm grânulos liofilizado que se dissolvem durante a preparação da amostra, liberando as contas. Os grânulos são marcado por fluorescência e por gating na população de esferas, as contagens absolutas podem ser calculados. <ol><li> Verifique se o EDTA amostra de sangue total é bem misturado, colocando-o num misturador rotativo lento por vários minutos. Rotular um tubo de contagem absoluta para cada amostra. Uma pelete que contém as esferas deve ser visível por baixo tele titular talão de metal no fundo do tubo. </li><li> Transferir 25 uL de EDTA sangue completo num tubo de contagem absoluta marcado. O sedimento talão irá dissolver-se após a adição do sangue. </li><li> Para cada tubo de adicionar 20 ul de coquetel / B / Natural Killer (NK) de células T anti-rato, 10 ul de anti-rato CD8a PE, 10 ul de anti-rato CD4 (domínio 1) com FITC e 10 ul de anti-rato CD45 PE / Cy7 (Figura 4A). Os fluoróforos estão definidos na Tabela 1. </li><li> Centrifugar brevemente o tubo (300 xg) para assegurar que os anticorpos e as células estão no fundo do tubo e não preso ao lado do tubo. Vortex para misturar e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Para lisar as células vermelhas do sangue adicionar 400 ul de Tris 10 mM, tampão de cloreto de amónio 0,15 M (pH 7,5) e agitar com vortex para misturar. Lise é completa quando a amostra aparece translúcida e não nublado (Figuras 4B e C). A falha para lisar completamente a amostra irá conduzir a um aumentofundo d e conta falsamente elevados na análise por citometria de fluxo. </li></ol> 5. Citometria de Fluxo de Processamento de Amostras Nota: Executar em uma cor de 4 citômetro de fluxo. <ol><li> Abra o software em modo de aquisição e um novo modelo com 8 lotes conforme representado na Figura 5. </li><li> Ajustar as configurações do aparelho com os listados na Tabela 1 e configurar portão R1 (FITC [FL-1] versus APC [FL-4]), Figura 5AI) para contar as partículas fluorescentes. As outras portas não são tão importantes nesta fase de aquisição, mas vai ser necessário para análise. As contas de contagem absolutos utilizados neste protocolo contêm corantes fluorescentes e pode ser detectado em qualquer canal embora são mais fracos no canal de azul. </li><li> Usando uma amostra de sangue de controlo preparado, vortex e depois carregar no citômetro e correr a uma velocidade baixa (12 mL / min) no modo de configuração de modo portões de aquisição de dados pode ser ajustado. </li><li> Defina a aquisição derecolher 10.000 eventos no portão talão R1. </li><li> Configure uma pasta para gravar dados e definir o número de arquivos e arquivo de amostra etiqueta no menu de aquisição. </li><li> Carregar a amostra a ser analisada para a citómetro e ajustar a taxa de fluxo para o meio (35 ul / min). Executar cada amostra com a mesma taxa de fluxo. A taxa de fluxo pode necessitar de ser variado para baixo (12 ul / min) ou alta (60 ^ l / min), mas forma é geralmente apropriada. A este ritmo que leva cerca de 90 a 120 segundos para adquirir 10.000 eventos talão para cada amostra. </li><li> Uma vez que a amostra é carregado ver os gráficos de dispersão para garantir que os eventos estão aparecendo no portão talão R1. Inicialmente pode haver alguma instabilidade na pressão da amostra causando tração nos gráficos de dispersão. Aguarde por esta estabilize. </li><li> Uma vez estabilizado, clique em adquirir e permitir exemplo para executar. Uma vez que o citômetro terminou aquisição de 10.000 eventos de talão em R1 o citômetro vai parar de adquirir e guardar todos os dados. </li><li> Retirar a amostra e descartar fluir tuser. O citômetro agora está pronto para a próxima amostra. Executar todas as amostras e depois prosseguir para o modo de análise. </li></ol> 6. Análise de células imunitárias Nota: estratégias de propagação e álgebra booleana são usados ​​para definir cada população de células. Álgebra booleana é um método de análise lógica base que permite a várias operações em uma única definição. O software de análise de citometria de fluxo da (por exemplo, BD CELLQuest) permite a utilização de álgebra booleana. As equações são usadas para explicar activamente para a reactividade negativa significativa que auxilia a definir a célula para identificar mais especificamente cada população de células. &quot;Regiões&quot; são usados ​​para definir uma &quot;porta&quot;. Regiões definir um espaço tridimensional 2 Considerando portas pode ser composto por numerosas regiões ligadas por operadores algébricas (+, *, -, definidos na Tabela 2). <ol><li> Mude o modo de software para análise. Um modelo de análise deve ser gerada para corresponder <strong&gt; Figura 5 com as parcelas e portas mostrados. </li><li> Analise cada arquivo individual (ou seja, cada amostra individual) separadamente. Configure portas R1 a R9 e, em seguida, para configurar os algoritmos para cada tipo de célula, tal como definido na Tabela 2 (também mostrado na Figura 5). </li><li> Utilizar o contador para calcular as estatísticas de células de populações de células individuais definidas por portões e algoritmos (Tabela 2 e Figura 5). Os algoritmos irá ajustar automaticamente o número de células no contador de estatísticas de células. </li><li> Calcular subconjuntos de células com a seguinte equação: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53019/53019eq1.jpg" /> Nota: Número de eventos celulares contadas (por exemplo, eventos de células CD4 T) é enumerado usando a equação acima para dar o número de células por mL de sangue. Exemplos são mostrados na Figura 5. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Este artigo apresenta um método para a geração de um modelo de rato singeneico ortotópico de mesotelioma pleural e um método simples para monitorizar a progressão da doença através de amostragem de sangue longitudinal. O modelo II-45 foi desenvolvido expondo 344 ratos Fischer às fibras de amianto 13. Embora esta exposição representa a verdadeira dinâmica de interações do sistema-host-imune amianto para mesotelioma patogênese, tem um tempo de latência longo (levando...

Mesotelioma maligno (MM) é um tumor maligno agressivo que surge a partir de células transformadas, em que a membrana (mesotélio) que reveste o pulmão e cavidades abdominais, coração e órgãos reprodutivos internos, e é o tumor primário mais comum do pulmão ou cavidade pleura 1,2 . A exposição a fibras de amianto é responsável por 80% de todo o MM, e enquanto a proibição de utilização de amianto foram introduzidos há décadas na maioria dos países ocidentais, a sua utilização generalizada na comunidade deixou um legado mortal. A Organização Mundial de Saúde estima que 107.000 pessoas no mundo morrem anualmente de doenças relacionadas ao amianto, com taxas de mortalidade continuam a aumentar. Uma nova onda de incidência não-ocupacional também está surgindo e há pouca compreensão de quando, e em que nível este atingirá o pico 3. A maioria das pessoas com MM são diagnosticados tardiamente, quando a quimioterapia sistêmica representa uma das únicas opções viáveis ​​4. Maioria effective quimioterapia e &quot;padrão de cuidado&quot; atual (pemetrexed em combinação com cisplatina 5) foi identificado mais de 10 anos atrás. No entanto falha deste tratamento é inevitável e não há opções de segunda linha comprovadas, deixando os pacientes com um prognóstico sombrio e sobrevida média de apenas 12 meses 2. Portanto, existe uma necessidade não satisfeita urgente de tratamentos mais eficazes. Apesar do exame de uma série de novas terapias em ensaios clínicos nenhum resultou em mudanças na prática. Isto é devido, em parte, à baixa (5%) transferência dos resultados pré-clínicos, geralmente realizados em modelos de xenoenxerto de ratinho, para definir o clínico 6-8. Tais modelos não recapitular fielmente os aspectos complexos do microambiente do tumor que ocorre em locais não-fisiológicos, frequentemente, na ausência de um sistema imune funcional 9. Modelos ortotópicos singï¿½icos criar um ambiente de tumor significativamente mais realista do que o commonly usado modelos de xenotransplante subcutâneos como os tumores ocorrem no local fisiológica correta com um 10,11 sistema imunológico intacto. Quanto maior o tamanho do rato aumenta a sua utilização como um modelo de doença de roedores, especialmente em estudos de drogas onde o sangue de série empates são necessários para avaliar a resposta ao tratamento e toxicidade 12. Além disso, em modelos nos quais monitorar a progressão da doença é difícil, devido à localização dos tumores (tal como na cavidade pleural), a capacidade de monitorizar a progressão da doença utilizando factores encontrados na circulação é extremamente atraente. A geração de um modelo ortotópico singeneicos de mesotelioma pleural utilizando ratos imuno-competentes é descrito. Além disso, um método fácil e relativamente não invasivo para monitorizar a progressão da doença pleural medindo circulantes células do sistema imunológico, também é descrito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA Collection tube (0.5ml)</td>
			<td>Greiner Bio One GmbH</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat T/B/NK Cell cocktail</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>558509</td>
			<td>anti-Rat CD3&#160; APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RAT CD8a PE&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200608</td>
			<td>(IgG1vClone G28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>203406</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD45 PE/Cy7&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202214</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruCount&#8482; Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340334</td>
			<td>Box of 50 absolute counting tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Scientifix</td>
			<td>FBS500-S (lot# 010101-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago AB</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23Gx1&#188; Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fischer 344 Rat</td>
			<td>Animal Resources Centre, Perth Australia</td>
			<td>F344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.S.O (Isoflurane USP)</td>
			<td>Veterinary Companys Australia (VCA)&#160;</td>
			<td>B7058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II-45 Rat Mesothelioma line</td>
			<td>Zurich University</td>
			<td></td>
			<td>Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur&#8482; 4 colour</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>342975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Machine (The stinger)</td>
			<td>Advanced Anaesthesia specialists</td>
			<td>#00449</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic implantation and peripheral immune cell monitoring in the ii-45 syngeneic rat mesothelioma model

O enorme aumento do interesse em tratamentos de base imunológica para o cancro, tais como vacinas e inibidores de checkpoint imunes, e o aumento da compreensão do papel do microambiente do tumor, em resposta ao tratamento, apontar em conjunto para a necessidade de modelos ortotópicos imuno-competentes para testes pré-clínicos destas novas terapias. Este artigo demonstra como criar um modelo de rato imuno-competente orthotopic de mesotelioma maligno pleural. Monitorizar a progressão da doença em modelos ortotópicos é confundida com a localização interna dos tumores. Para monitorar a progressão da doença longitudinalmente e seu efeito sobre as células imunitárias, neste e noutros modelos de rato de cancro circulantes, fluir um único tubo de ensaio de citometria requerendo apenas 25 ul de sangue total é descrita. Isto proporciona a quantificação precisa de sete parâmetros imunológicos: linfócitos totais, neutrófilos e monócitos, bem como os subconjuntos de células T CD4 e CD8, as células B e as células assassinas naturais. Diferentes subsETS destes parâmetros são úteis em diferentes circunstâncias e modelos, com a proporção de linfócitos para neutrófilos com a maior utilidade para a monitorização progressão da doença no modelo de mesotelioma. Analisando os níveis de células imunológicas que usam este método único tubo pode também auxiliar no acompanhamento da resposta aos tratamentos de base imunológica e compreender os mecanismos subjacentes que levam ao sucesso ou fracasso do tratamento em circulação.

O método utilizado neste trabalho para a geração de um modelo ortotópico de mesotelioma pleural utilizando células II-45 resultou em animais sucumbindo ao mesotelioma em um prazo reprodutível e rápida, sem ratos morrendo devido ao método de implantação. A titulação do número de células implantadas determinado que 1x 10 3 células foi o número mínimo requerido para um modelo totalmente penetrante (100% enxerto). O número diferente de células implantadas nos ratos alterou o curso de tempo da d...

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Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model | Medicine | Video

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

A geração de um modelo de rato ortotópico de mesotelioma pleural maligno por implantação de II-45 células de mesotelioma na cavidade pleural de ratos imuno-competentes é apresentado. Um método de citometria de fluxo para analisar sete subconjuntos de células imunitárias em animais a partir destes uma amostra de sangue de 25 uL é também descrito.

Orthotopic Implantação e Acompanhamento Peripheral Imune celular no Modelo II-45 Rat Singênico mesotelioma

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

orthotopic-implantation-peripheral-immune-cell-monitoring-ii-45

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9.1K visualizações.  Royal North Shore Hospital, University of Sydney.  A geração de um modelo de rato ortotópico de mesotelioma pleural maligno por implantação de II-45 células de mesotelioma na cavidade pleural de ratos imuno-competentes é apresentado. Um método de citometria de fluxo para analisar sete subconjuntos de células imunitárias em animais a partir destes uma amostra de sangue de 25 uL é também descrito. 

Vídeo: Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Transplante ortotópico de aorta: um modelo de rato para estudar o desenvolvimento de vasculopatia crônica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Medicina

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

O álcool polivinílico implantação do modelo Esponja

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Procedimentos cirúrgicos para um modelo de rato de Transplante de Fígado parcial ortotópico com reconstrução arterial hepática

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation of human liver transplantation due to the absence of arterial reconnection. Described here is a modified transplantation procedure that includes the incorporation of hepatic artery (HA) reconnection, leading to a marked improvement in transplant outcomes. With a mean anhepatic time of 12 min and 14 s, HA reconnection results in improved perfusion of the transplanted liver and an increase in long-term recipient survival from 37.5% to 88.2%. This protocol includes the use of 3D-printed cuffs and holders to connect the portal vein and infrahepatic inferior vena cava. It can be implemented for studying multiple aspects of liver transplantation, from immune response and infection to technical aspects of the procedure. By incorporating a simple and practical method for arterial reconnection using a microvascular technique, this modified rat OLT protocol closely mimics aspects of human liver transplantation and will serve as a valuable and clinically relevant research model.

The goal of this study is to modify the rat orthotopic liver transplant model to better represent human liver transplantation and improve recipient survival. The presented method reestablishes hepatic arterial inflow by connecting the donor liver&#39;s common hepatic artery to the recipient liver&#39;s proper hepatic artery.

Complicações reduzidas após reconexão arterial em um modelo de rato de transplante de fígado ortotópico

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...