The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.

1. Limpeza celular Sonifier Sistema <ol><li> Limpe a união entre o chifre e conversor usando clorofórmio e um cotonete de algodão. Aplique um óleo leve ou óleo mineral para os fios do chifre e um conversor para remover ainda mais acúmulo de aparas de metal, ferrugem ou oxidação. </li><li> Use clorofórmio para remover o óleo e outros contaminantes a partir da união depois de limpar as roscas com óleo. </li></ol> 2. Remontagem do celular Sonifier e Configuração do Sistema <ol><li> Volte a colocar a buzina para o conversor. Ao torque adequadamente o sistema, remover o conversor montado e chifre do conjunto do copo, puxando o chifre fora da parte inferior do copo (Figura 2A). Inserir uma chave de fenda dentro de uma das três pequenos furos perto da parte superior do conversor (Figura 2B). Em seguida, posicione um torque-chave equipado com um pé-de-galinha ½ polegada por parte fenda da buzina (Figura 2B). Aperte em standard direcção dos ponteiros do relógio até que o medidor de binário lê N 54,23. M (Figura 2C), o binário recomendado pelo fabricante 16. Montar o conversor apertados e chifre de volta no copo, e montar o chifre e um conversor a um stand anel na posição vertical. Volte a colocar o conversor para a fonte de alimentação antes de definir o sistema de dosagem de pulso experimental. </li><li> Defina o sistema de dosagem de pulso usando 1 seg de sonicação com 1 segundo entre os pulsos. Diferentes modelos de dosagem pode ser utilizado para outras condições experimentais. Muitas variáveis, tais como volume de água e diâmetro chifre seria potencialmente exigir alterações a esta dosagem. Utilizando os tipos acima mencionados da amostra de células, o volume e concentração, os dados de observação empírica e levaram à formulação deste regime de dosagem. </li><li> Ajustar o sistema com a amplitude desejada. Neste protocolo, utilizar 33% e 50% da amplitude de evitar a destruição da célula completa, o que tornaria a eficácia de sonosensitizers difíceis ou impossíveis de avaliar. NOTA: Neste estudo as amplitudes são comparados. </li></ol> 3. avaliar a intensidade do sistema e Função <ol><li> Segurar o aparelho de cavitação de 1,5 cm, que é o nível de sonicação a amostra. Observe as leituras para avaliar se o sistema está funcionando em uma intensidade esperada. Usando os níveis do sistema de água e atuais, esperar entre 100-110 W / cm 2 para 33% da amplitude e 115-125 W / cm 2 para 50% da amplitude. Observe as leituras do medidor de cavitação do visor do medidor que representa a energia cavitação em W / cm2 diretamente. Aqui estas leituras na superfície da água, e garantir que não existem bolhas na face da sonda metros. NOTA: É importante notar que estes procedimentos são feitos sem a tampa de acesso acima da buzina. Eles não necessitam de ser repetidos depois de cada sonicação. Pelo contrário, devem ser realizados somente após a limpeza, voltar a montar, e configurar o sistema. </li&gt; <li> Inserir o hidrofone em um frasco de amostra contendo 12,5 ml de água, a fim de imergir completamente o sensor do hidrofone. Suspender o hidrofone usando o suporte de anel. </li><li> Fixar o hidrofone para a entrada do osciloscópio, de modo a avaliar as características de forma de onda. Examine o osciloscópio para uma onda senoidal clara, como ondas aberrantes pode alterar a freqüência do sistema a partir das especificações do fabricante. Tanto o medidor de cavitação e osciloscópio dar uma leitura de frequência, mas apenas o osciloscópio mostrará ondas aberrantes, que são indicativas de um sistema defeituoso ou montagem incorrecta. </li></ol> 4. Preparação de células e meio <ol><li> Prepara-se o meio usando 240 ml de Iscove Modified Meio de Dubecco (IMDM) e 50 ml de soro fetal de bovino. Não descongelar soro fetal bovino em um banho de água quente, como o rápido aumento de temperatura pode levar a um compromisso em termos de estabilidade no soro. Combinar 240 mL de gentamicina 50 mg / ml e 5 ml de penicilina/ Estreptomicina 100x num frasco de cultura padrão, e adicionar ao meio. Armazenar o meio a 4 ° C. </li><li> As células U937 em Semente ~ 4 x 10 4 culas / ml num frasco de 25cm 2 usando o meio preparado. Avaliar células para concentração e viabilidade utilizando um contador de células TC 20 e de exclusão de azul de tripano, colocando 15-20 ul de células e 15-20 ul de tripano azul para um tubo de micro-centrifugadora e misturando o conteúdo. Pipette15-20 ul desta mistura numa lâmina de amostragem TC20, e iniciar a contagem, colocando a lâmina para o contador de células TC 20. </li><li> Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2, e vá para a viabilidade celular utilizando a exclusão de azul de tripano e o contador de células TC 20. Quando as células estão numa concentração apropriada e / ou foram tratados com sonosensitizers para um período de tempo apropriado, a transferência de 3 ml de células a partir do frasco de cultura para um frasco de cintilação de 20 ml de vidro. Neste protocolo, crescer células U937 durante 48 horas, e em seguida, tratar com 0,5, 1,MeβCD ou 5 mM durante 30 min a esgotar suficientemente o colesterol de células antes da sonicação. </li></ol> 5. celular Sonication <ol><li> Desgaseifica desionizada, água destilada usando um frasco de vácuo e de Buchner. Transferir a água para o copo de chifre, e enche-se a um nível de 15 mm acima da parte superior da trompa. O processo de ultra-sons provoca ainda mais a desgaseificação da água por um período de alguns minutos, e pode levar a inconsistências no decurso da experiência, se o sistema não é executado antes de experimentar sonicação. Portanto, executar o sistema para ~ 7 min antes de provar sonicação. </li><li> Fixar o frasco de cintilação contendo as células para o dispositivo de retenção. Em seguida, fixar o dispositivo de suporte para o topo do copo de chifre e definida para uma altura de 15 mm a partir do topo da trompa (na superfície da água, utilizando o mecanismo de deslizamento). </li><li> As células são tipicamente sonicada usando três pulsos de 1 seg de ultra-sons, com um segundo espaçamento entre cada um desses impulsos. Para issoprotocolo, sonicar as células em 33% e 50% da amplitude de pulso utilizando o doseamento acima referido. </li></ol> 6. Avaliação de Danos As células para Pós-sonicação <ol><li> Avaliar as células suspensas por danos e viabilidade utilizando azul de tripano e contador de células TC20. Além disso, analisar a amostra utilizando um contador de Z2. Para a análise contador Z2, pipetar uma suspensão de células de 100 ul em 20 ml de solução salina isotónica (200: 1 ratio). Antes da análise, lave a abertura do analisador de partículas Z2 pelo menos duas vezes, utilizando solução salina isotónica. Colocar a amostra no porta-Z2 balcão, e eleve a plataforma para a abertura antes de iniciar a contagem. </li><li> Adquirir os dados provenientes dos contadores TC20 e Z2 usando o software fornecido pelo fabricante. Analisar esses dados para o dano celular, viabilidade, e a criação de debris celulares de ultra-sons. </li></ol> 7. XTT Ensaio para determinar a viabilidade celular e mitocondrial Atividade de U937 tratadas e THP1 Células <ol><li> Prior para os ensaios de XTT, crescer células U937 e células THP1 sob as mesmas condições. Pré-tratamento de células com o mesmo intervalo de concentração de MeβCD durante 30 min antes da sonicação. Use os mesmos parâmetros de ultra-sons como anteriormente, excepto que as células são agora sonicada usando um intervalo de 1-3 um pulsos sec espaçadas uma seg além de desenvolver um intervalo de danos para o kit XTT para avaliar. Nota: Muitas destas medidas são tomadas diretamente do manual do kit XTT e só são repetidos para a conveniência dos laboratórios interessados. </li><li> Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 10 min. Ressuspender o sedimento de células em meio de crescimento descrito anteriormente. Ressuspender as células em 1 x 10 ~ 5 células / mL. As células U937 de sementes em 100 ul por poço em uma placa de fundo plano microtitulação de 96 poços em triplicado e repita para THP1 células usando uma placa de 96 poços separado. Incluem três poços de controlo contendo 100 ul de meio de crescimento completo sozinho como em branco leituras de absorvância. Em seguida, incubar as placas inoculadas durante 24 hr. </li><li> Descongelar duas alíquotas da reagente XTT e o reagente de activação a 37 ° C antes de usar. Alíquotas do redemoinho delicadamente até que são obtidas soluções claras. Adicionar 0,1 ml de reagente de activação e 5,0 ml de reagente XTT, o qual forma o suficiente solução de XTT activado por um ensaio de 96 poços de placas de microtitulação. Repetir o processo para a outra placa. </li><li> Adicionar 50 ul da solução de XTT-activada a cada poço. E volta da placa de cultura de células para a incubadora de CO2 durante 2 horas. Agitar suavemente a placa a seguir ao período de incubação, para distribuir uniformemente a cor laranja nas cavidades positivas. Medir a absorvância dos poços de teste, contendo as células e os poços de controlo em branco no fundo de um comprimento de onda entre 450-500 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação. </li><li> Ou zero o leitor de placas de microtitulação utilizando os poços de controlo em branco ou subtrair o seu valor médio a partir dos resultados específicos. Medir a absorvância de todos os poços de teste novamente a uma wavelength entre 630-690 nm e subtrair os valores dos 450-500 nm valores obtidos. Nota: Esta segunda determinação absorvância ajuda a eliminar as leituras não específicas a partir dos resultados do ensaio. O ensaio XTT foi repetido quatro vezes para ambas as linhas celulares. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Para alcançar melhores resultados, deve-se tomar cuidado especial para posicionar cuidadosamente a amostra e limpar a união conversor de-chifre. A colocação da amostra no corno é importante para se obter a destruição de células consistentes, como a mudança da distância do chifre irá alterar os focos acústico, e, por conseguinte, alterar a energia a amostra está exposta. A energia acústica dentro do chifre copo pode ser mapeada usando o medidor de cavitação para encontrar a posição de máxima cavitação. Além disso, o medidor de cavitação, junto com o osciloscópio são vitais para a determinação da intensidade sonora as células estão a ser expostos, assim como a homogeneidade da forma de onda. Portanto, estes instrumentos devem ser utilizados para detectar problemas com o sistema, e ajudar a determinar a resolução de problemas que podem ser necessárias para corrigir a instabilidade do sistema. Como mencionado anteriormente, o sistema de baixa frequência pode actuar para mais desgaseificar a água ao longo da experiência não se correr paravários minutos antes da amostra sonicação. Este prazo inicial deve ser realizada para produzir um meio de ultra-sons relativamente desgaseificado e resultados assim consistentes durante as experiências. Além disso, as células não devem ser sonicada a ou perto da amplitude máxima quando se avalia a eficácia das sonosensitizers, como a verdadeira medida da sensibilização seria difícil de avaliar. Usando 33% amplitude no sistema kHz 40 é um cenário ideal, uma vez que produz danos notáveis, mas fornece sonosensitizers amplo espaço para demonstrar a sua eficácia, como ficou demonstrado com MeβCD contra U937 e células THP1 (Figura 7). Estes dados também confirmam que sensibiliza MeβCD várias linhas de leucemia a partir de ultra-sons de frequência de um modo dependente da dose. Tem havido um grande número de experiências feitas com maior frequência na gama de 0,75 MHz a 8 MHz mostrando evidência de bolhas de cavitação intramembranar ser gerado através de ultra-sons 17-19. No entanto, questioNS ainda permanecem no que diz respeito ao mecanismo exato de induzida por ultra-som lise celular 18. Nós têm mostrado uma ligação entre o citoesqueleto fluidificação e aumento da sensibilidade sonora usando o ultra-som de baixa freqüência de 15, um fenômeno demonstrado por outros laboratórios 20, 21. Além disso, verificou-se que os agentes de perturbação microfilamentosas como citocalasina B potenciar a sensibilidade ultra-som na leucemia múltiplo linhas, mas não hHSCs ou leucócitos 22, sugerindo que a inibição da polimerização da actina podem ser um mecanismo de sonosensitizing de particular interesse. Observamos, também, que a vincristina, um agente de interrupção dos microtúbulos, que inibe a polimerização da tubulina de 23, 24, aumenta significativamente a sensibilidade de ultra-sons de diferentes tipos de leucemia in vitro, incluindo a leucemia mieloide aguda, leucemia mielóide crónica e leucemia linfóide aguda. Por contraste, agentes dirigida ao citoesqueleto que estabilizam os componentes do citoesqueleto (paclitaxel umd jasplaquinolida) parecem tornar as células resistentes a ultra-sons, refletida por baixas taxas de lise celular 22. Tomados em conjunto, estes dados suportam a hipótese de que os componentes do citoesqueleto de fluidização de células neoplásicas é de facto um factor importante para aumentar a eficácia do SDT 25. O presente estudo também demonstra que a depleção de colesterol pode ser um outro método que permite potenciar ainda mais a sensibilidade de ultra-sons de células neoplásicas, tal como células U937 tratadas com MeβCD são marcadamente sensibilizados a 40 kHz de ultra-som. Enquanto os nossos protocolos de sonicação têm demonstrado actividade antineoplásica significativa in vitro, a metodologia corrente é limitada para trabalhar em modelos de cultura de vertebrados e pequena, que são capazes de encaixar nos frascos utilizados para a sonicação. Mostrámos que peixe-zebra pode ser ultra-sons pulsada com segurança usando ultra-som de baixa frequência (20 kHz), e que a tolerância aos agentes quimioterapêuticos é quantitativamente comparáveis ​​aosDoses toleradas por modelos murinos 26, sugerindo que a peixe-zebra que possui o tumor pode ser usado em investigações preliminares para avaliar a actividade anti-neoplásica in vivo destes protocolos. No entanto, a administração de agentes quimioterapêuticos antes da sonicação de modelos de mamíferos tem sido relatado na gama de 1 MHz, e tais protocolos pode provavelmente ser estendido para incorporar baixa frequência do ultra-som, bem como o colesterol de empobrecimento e agentes dirigida ao citoesqueleto. Potenciais aplicações clínicas desta forma de SDT pode envolver sonicação sangue extracorporal em que os agentes antineoplásicos são administrados por via intravenosa (iv) antes de o sangue a ser removido por ultra-sons 25. Esse método remove barreiras de som potenciais colocados pela anatomia humana, e pode ser uma maneira eficaz para danificar blastos leucêmicos, assim como metástases de tumores sólidos. É também possível que o colesterol de empobrecimento e agentes dirigida-citoesqueleto poderiaser utilizado em protocolos de HIFU que já estão a ser examinadas na clínica, numa tentativa de melhorar a eficácia deste tipo de tratamento. Os métodos descritos no presente estudo são capazes de avaliar o valor de potenciais sonosensitizers e aperfeiçoamento do sistema pode melhorar este utilitário. No entanto, há muitas variáveis ​​a serem consideradas ao usar esses legados de ultra-som, incluindo a qualidade da fonte de alimentação, focos acústico, e variação individual entre os conversores. Portanto, futuras pesquisas incidirá sobre visualizando as ondas sonoras e entender sua influência nos resultados. SDT tem mostrado melhorar a lise celular in vitro, e podem vir a ser clinicamente viável se mais dados in vivo em modelos de mamíferos são adquiridas. Experiências examinando outras características de potencial risco de células malignas, bem como várias modalidades combinadas envolvendo múltiplos agentes de ultra-sons e continuar no nosso laboratório.

O ultra-som refere-se a qualquer onda de pressão acústica com uma frequência de oscilação maior do que o limite superior das capacidades auditivas humanas (~ 20 kHz) 1. Ultra-som de baixa frequência na gama de 20-60 kHz foi utilizada no laboratório como um meio de produção de emulsões, preparando amostras celulares para a extracção de ácido nucleico, por rompimento do tecido, e para uma variedade de outros testes. O utilitário de ultra-som de baixa freqüência também foi estendido para o ambiente industrial para soldagem, limpeza diversos materiais, e no processamento de materiais. Comercialmente geradores de ultrassons disponíveis vêm em freqüências que variam 18-60 kHz, e em grande escala de potências 100-1,200 W. Apesar do ultra-som tem sido muito utilizado na prática clínica para a imagiologia de diagnóstico, que tem sido aplicada como uma modalidade terapêutica apenas recentemente. Ultrasound ≥1 MHz é capaz de perturbar de forma segura cálculos urinários (pedras nos rins) e cálculos biliares (pedras em the vesícula biliar ou no fígado) em pacientes para reduzir os sintomas 2,3. Esta abordagem conhecida como litotripsia extracorpórea por ondas de choque (LECO) é hoje amplamente aplicada na clínica (mais de um milhão de pacientes são tratados anualmente com LECO nos Estados Unidos sozinho 4), e oferece uma modalidade pela qual a não-invasiva quebrar cálculos com danos colaterais mínimos, através da utilização de impulsos acústicos aplicados externamente, centrada, de alta intensidade 2-4. Devido às forças directas originais de cisalhamento, bem como bolhas de cavitação ultra-sons gerados por alta intensidade, estas metodologias foram examinados em terapia do cancro para o tratamento de carcinoma da próstata resistente à castração e adenocarcinoma pancreático em uma abordagem conhecida como concentrado de alta intensidade ultra-som (HIFU ) 8/5. De um modo muito semelhante ao LECO, HIFU utiliza múltiplos feixes de ultra-som e concentra-los numa área focal seleccionada para gerar temperaturas de 60 ° C ou hig-a através da utilização de energia acústica, induzir necrose coagulativa no tecido alvo 5. Embora outras modalidades de ablação térmica existem atualmente (ablação por radiofreqüência e ablação por microondas), HIFU oferece uma vantagem distinta sobre esses métodos em que é a única modalidade hyperthermic não-invasivo 5. HIFU tem alcançado resultados mistos na clínica e está atualmente disponível apenas em ensaios clínicos 11/08. No entanto, o sucesso limitado que alcançou, eo muito promissor dados in vivo adquiridos a partir de modelos pré-clínicos de mamíferos têm demonstrado o potencial do ultra-som na terapia do cancro. Num esforço para melhorar HIFU, os investigadores tentaram combinar com agentes antineoplásicos de ultra-sons apropriadas para gerar uma forma de sonochemotherapy. Terapia Sonodynamic (SDT) é uma modalidade de tratamento novo promissor que tem demonstrado actividade antineoplásica em impressionante tanto in vitro como <em&gt; Estudos in vivo um. Tem sido demonstrado que o ultra-som preferencialmente danos células malignas baseados no diferencial de tamanho entre essas células e os da histologia normal 1,5. SDT incorpora agentes especializadas conhecidas como sonosensitizers para aumentar a extensão do dano preferencial exercida por ultra-sons contra células neoplásicas. Enquanto as aplicações terapêuticas da SDT foram previamente examinados, sistemas ultra-sônicos utilizados normalmente empregam mais elevado de ultra-som de frequência (≥1 MHz), e os efeitos do ultra-som de baixa frequência kHz ainda não foi totalmente explorado. Menores freqüências de ultra-som são muitas vezes mais eficientes na produção de cavitação inercial, um fenômeno que resulta na destruição das células devido ao rápido colapso de microbolhas, induzindo dano físico 12-14. Esta diferença na geração de cavitação inercial entre MHz baixo e ultra-som kHz tem sido atribuída ao facto de as frequências de onda inferiores permitir microbolhass mais tempo para crescer por difusão corrigida no meio ciclo de expansão, consequentemente, a produção de colapsos mais violentos durante o meio ciclo seguinte de compressão 12. Nós já demonstrado que as células monocíticas humanas U937 de leucemia são sensíveis à ultra-som de baixa frequência (23,5 kHz), e que esta sensibilidade pode ser significativamente aumentada através da aplicação de agentes anti-neoplásicos que perturbam o citoesqueleto 15. Além disso, demonstrámos que as células são preferencialmente danificado com base no tamanho, com células maiores que apresentam uma sensibilidade mais elevada de ultra-sons. Além disso, as células normais humanas estaminais hematopoiéticas (hHSCs) e leucócitos em tamanhos de células comparáveis ​​são muito mais resistentes a sonicação do que os seus homólogos neoplásicas 15, que poderá sugerir que o ultra-som de baixa frequência pode ser utilizado para danificar as células malignas, preferencialmente, na presença de tecido normal. Para examinar ainda mais a prop exclusivoerties de ultra-som de baixa frequência para o potencial uso terapêutico, desenvolvemos procedimentos de limpeza e estabilização para aumentar a eficácia ea confiabilidade de um de nossos sistemas de sonicação atuais, a 150 W Branson Modelo SLPE, 40 kHz Disrupter celular, equipado com um chifre de 20 milímetros equipada em um copo de 7,62 centímetros. Além disso, temos sido capazes de determinar precisos energias amostra de cavitação, bem como formas de ondas consistentes e amplitude dentro da faixa de 40 kHz usando um medidor de cavitação e osciloscópio com hidrofone. Refinando e sistematizar nossos protocolos, temos sido capazes de estabelecer uma coerência em nossos sonicações experimentais, o que nos permite comparar quantitativamente as sensibilidades sônicas de células neoplásicas e normais de diferentes linhagens de histogênese. Nosso protocolo para o sistema de 40 kHz é apresentado em grande pormenor, a fim de laboratórios interessados ​​para ser capaz de realizar experiências comparáveis, e para avaliar os resultados dos efeitos antineoplásicos eliciados porultra-som de baixa freqüência. Além disso, nós examinamos os efeitos dependentes de dose de metil-β-ciclodextrina (MeβCD; Figura 1), um agente de empobrecimento do colesterol, no aumento da sensibilidade de ultra-sons de células U937 e células THP1 de leucemia monocítica humana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium w/ NaHCO3 &#38; 25mM Hepes&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x Solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3&#34; (25mm) Cuphorn</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>101-063-726</td>
			<td>sonication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater</td>
			<td>Brisk Heat</td>
			<td>SDCJF1A-GBH1000-1</td>
			<td>heater used for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp&#174; Software</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 50mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL &#38; 25mL Vented Culture Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>&#160;A35473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuJet Pro Auto Pipet&#160;</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1840, 1126-7810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100uL Micropipette&#160;</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000uL Micropipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Dual Chamber Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tektronix&#160; DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO2002B</td>
			<td>used to measure the ultrasonic waveform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter</td>
			<td>PPB Megasonics</td>
			<td>PB-500&#160;</td>
			<td>used to assess the sound intensity in W/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone</td>
			<td>Teledyne</td>
			<td>TC4013-1&#160;</td>
			<td>connects to the oscilloscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 250mL Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z364827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Glass Scintillation Vials&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>diluent for Z2 counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof Anhydrous&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-1011K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplate Reader</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>&#160;EW-13055-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL&#173;1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP1 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative analysis of pulsed low frequency ultrasound to determine the sonic sensitivity of untreated and treated neoplastic cells

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

A estabilidade do sistema é fundamental na obtenção de resultados reprodutíveis e confiáveis. A especificação torque adequado de 54,23 N. M alcançado acoplamento adequado do transdutor e sonotrodo 2, com a consistência da forma de onda a ser avaliada através da utilização de um osciloscópio e hidrofones (Figura 3A). A Figura 3B representa medições dentro do frasco de amostra, e Figura 3C avalia a estabilidade dentro do chifre copo. Como esperado, a amplitude foi ligeiramente reduzida devido a alguma energia seja absorvida pelo vidro. No entanto, a forma de onda não foi perturbado ou distorcido em qualquer painel B ou C, o que é necessário para a entrega fiável de energia sónica para a amostra. Uma forma de onda que não aparece como uma onda senoidal singular claro indica um transdutor defeituoso ou instalação inadequada. Isso está expresso na figura 3D que mostra várias ondas aberrantes, uma clara ausência de uma onda senoidal, e uma frequência de leitura nãot esperado com um bom funcionamento do sistema. O medidor de cavitação usado para medir a energia de cavitação gerado (Figura 4) encontrada a intensidade do som para ser 100-110 W / cm2 a 33% de amplitude, e 125-130 W / cm 2 a 50% de amplitude. Uma vez que o sistema de 40 kHz foi adequadamente calibrado e montado na sua totalidade (Figura 5), a destruição de células de confiança foi prontamente alcançada, tal como determinado por ambas as contadores TC20 e Z2 (Figura 6). Tal como esperado, mais danos extensivos de células foi observada nas populações de células sonicadas em 50%, em vez de a 33% de amplitude. No entanto, 33% da amplitude é útil como um ponto de partida para detectar potenciais efeitos sónica sensibilizadores de agentes administrados, uma vez que produz os danos visíveis, mas deixa espaço para mais danos a ser detectado quando os agentes são aplicados para avaliar a sua potenciação da sensibilidade de ultra-sons. Isto é demonstrado na Figura 7A, em que oefeitos dependentes da dose de MeβCD na potenciação da sensibilidade de ultra-sons de células U937 são apresentados. Embora as células tratadas com MeβCD não sonicadas foram muito semelhantes na viabilidade de células não tratadas, sonicado, a viabilidade caiu acentuadamente após três pulsos de 1 segundo 40 kHz foi aplicado ultra-som. Além disso, a diminuição na viabilidade após sonicação parece ter sido dependente da dose, como MeβCD 5 mM produziu a maior queda na contagem de células, seguido de 1 mM e, em seguida, 0,5 MeβCD mM. Efeitos semelhantes sobre a viabilidade celular e a actividade mitocondrial foram observados em ambas as células U937 e THP1 que foram tratados com concentrações variáveis ​​de MeβCD antes da sonicação, tal como determinado com o kit XTT (Figura 7B). Embora THP1 células parecem ser um pouco mais resistentes que as células U937 sónica, ambas as linhas de leucemia humana são danificadas de modo dependente da dose. Maiores concentrações de MeβCD e mais pulsos de ultra-som produced a menor redução de XTT a, um derivado solúvel de laranja intensamente colorido tanto para U937 e células THP1, que corresponde a diminuir a viabilidade celular e a actividade mitocondrial. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> Figura 1. Estrutura molecular de metil- β-ciclodextrina. (A) estrutura completa de metil-β-ciclodextrina (MeβCD). (B) MeβCD é um polímero de sete unidades de repetição com um grupo R de H ou CH3. Fórmula molecular: C 56 H 98 O 35. Peso Molecular = 1331,36. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> Figura 2. Adequadamente torqueing o sistema de ultra-som de 40 kHz. (A) A antena e o conversor são removidos do copo priou para torqueing. (B) Posicione a chave de fenda e chave de torque em suas respectivas posições. (C) Aplicar 54,23 N. M de torque no sentido horário antes de recolocar o chifre e um conversor para a taça. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> Figura 3. Utilização de um osciloscópio para caracterizar a forma de onda do sistema de ultra-sons. (A) um osciloscópio com hidrofones pode ser utilizado para avaliar a consistência de amplitude e forma de onda. (B) Uma gravação feita com o copo directamente por cima da corneta a 1,5 cm e é ajustado a 33% de amplitude. (C) A forma de onda representada aqui é adquirida a partir de uma leitura quando o hidrofone for colocado dentro do frasco de cintilação de 20 ml de vidro. O frasco é posicionado a 1,5 cm acima do chifre e de novo fixado em 33% da amplitude. (D) Um osciloscópio tela osistema fa com freqüências aberrantes como seria de esperar com um sistema defeituoso ou acoplamento da união imprópria conversor chifre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> Figura 4. O uso de um medidor de cavitação para caracterizar a intensidade do som do sistema de ultra-sons. O medidor de cavitação visto aqui é usado para representar a energia de cavitação em W / cm2. Este é um instrumento muito importante para avaliar a consistência de energia em relação à amostra. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> Figura 5. Os principais componentes do sistema de ultra-som de 40 kHz. O sistema de ultra-sons é mostrada completa com copo de chifre ( <strong&gt; A), o aparelho de aquecimento (B), o conversor (C), e um mecanismo de posicionamento da amostra (D). Este design permite uma fácil posicionamento da amostra (E), o corno (F). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> Figura 6. Efeitos de diferentes níveis de amplitude de ultra-sons sobre a lise de células U937, utilizando os contadores TC20 e Z2. As células foram sonicadas com a célula Dismembrator 40 kHz a 33% amplitude (100-110 W / cm2) ou 50% da amplitude (125-130 W / cm 2) usando três pulsos de 1 seg de ultra-sons, com um segundo espaçamento entre cada desses impulsos. (A) Uma imagem do software do contador Z2 demonstra o efeito de ultra-sons em células U937. (B) Os dados do contador de TC20 foram compilados em um gráfico para demonstrar a reprodutibilidade do resultados. Estes dados incluem as contagens totais e de células vivas, bem como o azul de tripano avaliada a viabilidade celular. Bares refletir o erro padrão da média (SEM) para 4 populações de células independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> Figura 7. Efeitos da metil- β-ciclodextrina na potenciação da sensibilidade de ultra-sons de células U937 e células THP1. (A) As células U937 foram tratadas com várias concentrações de MeβCD durante 30 min antes de ser submetida a ultrassons com ultra-som de 40 kHz (105 W / cm 2 ) usando três pulsos de 1 seg espaçadas 1 segundo de intervalo. Populações de células foram agrupadas em ≥12 ≥17 um e um. (B) U937 ou células THP1 foram novamente tratados com concent variandorações de MeβCD durante 30 min antes de ser submetida a ultrassons com o sistema de 40 kHz utilizando 1-3 pulsos de 1 s 1 s de ultra-sons espaçados separados. A viabilidade celular e atividade mitocondrial foram avaliados com o kit XTT. 100 uL de células foram semeadas por poço numa placa de 96 poços de microtitulação de fundo plano. A placa foi incubada durante 24 h antes da adição de solução de XTT. As células foram então incubadas durante mais 2 horas antes de o comprimento de onda foi lido. Bares refletir SEM por 4 populações de células independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

Geração e Análise Quantitativa de Baixa Freqüência ultra-som pulsado determinar Sonic sensibilidade dos tratados e não tratados células neoplásicas

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

generation-quantitative-analysis-pulsed-low-frequency-ultrasound-to

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K visualizações.  Syracuse University. Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells. 

Vídeo: Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Medicina

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Ecocardiografia fetal e ultra-som Doppler pulsátil em um modelo de coelho de restrição do crescimento intra-uterino

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Geração e quantificação 3-Dimensional de Arterial lesões em ratos por meio de tomografia óptica de Projeção

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

De alta frequência Ecografia de mouse linfonodos cervicais

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Análise quantitativa [18F]-NAF-PET-RM para avaliação da rotatividade óssea dinâmica em paciente com dor nas costas Facetogênica

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions

Contemporary high-resolution ultrasound instruments have sufficient resolution to facilitate the measurement of mouse aortas. These instruments have been widely used to measure aortic dimensions in mouse models of aortic aneurysms. Aortic aneurysms are defined as permanent dilations of the aorta, which occur most frequently in the ascending and abdominal regions. Sequential measurements of aortic dimensions by ultrasound are the principal approach for assessing the development and progression of aortic aneurysms in vivo. Although many reported studies used ultrasound imaging to measure aortic diameters as a primary endpoint, there are confounding factors, such as probe position and cardiac cycle, that may impact the accuracy of data acquisition, analysis, and interpretation. The purpose of this protocol is to provide a practical guide on the use of ultrasound to measure the aortic diameter in a reliable and reproducible manner. This protocol introduces the preparation of mice and instruments, the acquisition of appropriate ultrasound images, and data analysis.

Ultrasound imaging has become a common modality to determine the luminal dimensions of thoracic and abdominal aortic aneurysms in mice. This protocol describes the procedure to acquire reliable and reproducible two-dimensional ultrasound images of the ascending and abdominal aorta in mice.

Ecografia da Aorta torácica e Abdominal em ratos para determinar as dimensões de aneurisma

Contemporary high-resolution ultrasound instruments have sufficient resolution to facilitate the measurement of mouse aortas. These instruments have been ...