Este trabalho foi financiado pelo fundo de Dorothy D. Radford Dote da West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. O uso de modelos e de imagem West Virginia University animal Facility (AMIF) e Microscopia de imagem Facility (MIF) (apoiado pela Mary Babb Randolph Cancer Center e NIH subvenções P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 e S10 RR026378) é reconhecido agradecimento.

Todos os procedimentos com animais demonstraram neste protocolo ter sido analisado e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Universidade animal o West Virginia no âmbito de protocolos 11-0412 e 14-0514 e conduzida de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Guia do NIH para o Cuidado e Uso dos Animais. 1. Preparação de animais <ol><li> Anestesiar um único rato numa câmara de indução usando 3% de isofluorano misturados com 1,5 L / min de 100% de oxigénio. Remover o animal a partir da câmara de indução e posicionar numa posição supina sobre a plataforma de imagem pré-aquecido a 40 ° C e mantida entre 37-42 ° C (Figura 2A). Confirmar anestesia pela falta de resposta a um aperto do dedo do pé. </li><li> Posicione o focinho rato dentro do nosecone conectado ao sistema de anestesia. Aplicar anestesia para manutenção da sedação em estado estacionário (1,5% de isofluorano misturados com 1,5 L / min de 100% de oxigénio). </li><li> Aplique lubrificante olho a cada olho para evitar morrendo prag. Aplicar gel de eléctrodo e os eléctrodos para utilizar fita adesiva para prender cada uma das quatro patas para o eléctrodo correspondente. As almofadas de eletrodo irá transmitir ECG do animal para o sistema de imagem para permitir o monitoramento da freqüência cardíaca e taxa de respiração. Lubrifique e insira a sonda de temperatura retal para o monitoramento contínuo da temperatura corporal. Temperatura normal do corpo do rato é de 36,9 ° C. 1-2 variação ° C é normal, enquanto sob anestesia. </li><li> Utilizar um creme depilatório para remover o pêlo do pescoço do rato. Lavar a região do pescoço com gaze embebida em água para remover o cabelo e excesso de creme depilatório. Opcionalmente, usar a aplicação adicional de creme depilatório para remover qualquer cabelo do corpo restante (Figura 2B). </li></ol> 2. Identificação e aquisição de imagens de rato Cervical linfonodos Usando HFUS <ol><li> Para começar, aplicar uma camada de gel de ultra-som aquecida até à área do pescoço desprovida de pele. Use aplicação liberal de gel de imagem ideal paraqualidade (Figura 2C). Evitar a introdução de bolhas de ar no gel durante a aplicação, que pode interferir com a imagiologia ultra-sónica. </li><li> Ajuste a plataforma de imagem 20-30 ° para que o mouse é posicionado com a cabeça ligeiramente elevada. Esta posição ajuda a assegurar a taxa de respiração óptima para o rato. Posicionar o transdutor de 40 MHz transversalmente no sistema de montagem e baixá-la cuidadosamente até que a frente do scanhead transdutor está imerso no gel de ultra-sons (Figura 2C). NOTA: Certifique-se de não colocar pressão excessiva sobre o gargalo do mouse, pois poderia causar desconforto respiratório indevida. Além disso, é útil para imagiologia por ter um tampão de gel de entre o transdutor e o rato. </li></ol> Imagem B-Mode e Detecção de gânglios linfáticos: <ol start="3"><li> Usando o computador que controla o software de aquisição HFUS, ajustar o brilho (B-) definições do modo para os seguintes parâmetros: Ganho 22 dB, profundidade 10.00mm, largura de 14,08 milímetros. NOTA: Essas configurações são um ponto de partida sugerido, e pode exigir leve ajuste para aquisição de imagem ideal entre diferentes aplicações. Observe linfonodos cervicais normais como estruturas hipoecóicas oval perto da superfície da pele dentro de um campo hiperecoica circundante. O aparecimento de nódulos linfáticos doentes podem variar entre modelos. Para sistematicamente imagem todos os gânglios linfáticos na região do pescoço use as seguintes etapas: <ol><li> Use o eixo Y para digitalizar o pescoço em um cranial para caudal maneira para a região torácica. Use-eixo X para centralizar a imagem. </li><li> Identificar marcos principais: cavidade bucal, língua e da glândula tiróide (Figuras 3A, B e C; respectivamente); inclinar a plataforma de imagem para ajustar horizontalmente a superfície ventral do pescoço do rato, fazendo ambos os lados do pescoço até aparecer na imagem em modo B. A quantidade de inclinação depende da fisiologia de cada ratinho individual. </li></ol></li&gt; <li> Realizar uma varredura 3D da região do pescoço toda da região bucal cavidade / língua para a glândula tireóide, a fim de mapear os gânglios linfáticos e pontos de referência associados ao longo do pescoço. <ol><li> Localize a região de língua / cavidade bucal (Figura 3A) e anote a localização numérica na escala Y. </li><li> Localize glândula tireóide (Figura 3C) e anote a localização numérica na escala Y. </li><li> Calcula-se a diferença entre os valores obtidos em (2.4.1) e (2.4.2) para determinar o comprimento total em mm para a região do pescoço com imagens. </li><li> Use o botão de Y para centrar o transdutor no ponto médio do comprimento total determinado. </li><li> Pressione o botão &quot;3D&quot;. Digite o comprimento total. Para o tamanho 3D passo, utilize 0,076 milímetros para adquirir a pilha série de imagens para a região do pescoço inteiro. </li></ol></li><li> Quando a digitalização estiver concluída, selecione o lado direito ou esquerdo do pescoço e centrar o transdutor em um linfonodo individual de interesse, em seguida, levantar a 4Transdutor de 0 MHz fora do mouse. Retire o transdutor de 40 MHz e substituir com um transdutor de MicroScan 50 MHz (também em uma posição transversal) para obter imagens de alta resolução. Reabastecer o gel de ultra-som sobre o pescoço do mouse e diminuir o transdutor de 50 MHz para o gel de ultra-som. </li></ol> 3D Poder Doppler Imaging <ol start="6"><li> Conduta 3D varre com Doppler poder de volume de jumentos e vascularização dos linfonodos cervicais individuais do seguinte modo: <ol><li> Pressione o botão Power no teclado do sistema para adquirir poder Dopper e ajustar as seguintes configurações de modo de poder: PRF 4 KHz, Doppler ganhar 34 dB, 2D ganho de 30 dB, profundidade 5,00 milímetros, largura de 4,73 milímetros. NOTA: Como antes, essas configurações são um ponto de partida sugerido e podem ser modificados conforme necessário para a aquisição de imagem ideal em vários modelos. </li><li> Localize a-ponto mais cranial do linfonodo de interesse e anote a localização na escala Y. </li><li> Localize o ponto mais caudal do mesmo nó e notaa localização na escala Y. </li><li> Calcule a diferença da distância para determinar o comprimento total do linfonodo (veja o passo 2.4.3). </li><li> Centrar o transdutor no ponto médio do comprimento total determinada, usando o local Y-escala. </li><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; e digite comprimento total do nó de linfa. Use 0,051 milímetros para o tamanho do passo. NOTA: Devido à proximidade do transdutor para a região do tórax, o transdutor de 50 MHz podem resultar em uma imagem Doppler instável devido à detecção de movimento respiratória normal. Isto pode ser eliminado usando a opção &quot;Respiração Gating&quot; disponível sob a guia &quot;fisiológica&quot;. </li><li> Cerque o linfonodo selecionado com a caixa amarela que designa a região a ser analisada por power Doppler e selecione &quot;digitalização 3D&quot; para adquirir imagens. Elevar o transdutor fora do rato e movê-lo para o lado oposto do pescoço. Abaixe o transdutor para o mouse e repita os passos descritos acima para imalinfonodos ge deste lado do pescoço. </li></ol></li><li> Salvar conjuntos de imagens para análise posterior. </li></ol> 3. Cervical Biópsia do Linfonodo <ol><li> Selecione o nó de linfa desejado para biópsia e manter imaging HFUS com o transdutor de 50 MHz. Escolheu o maior linfonodo cervical visível em cada lado do pescoço mouse. Linfonodomegalias normalmente indica uma resposta inflamatória, e, portanto, estes nós são candidatos ideais para biópsia. NOTA: Nós descobrimos que é muito difícil de realizar biópsias em nódulos cervicais menor que 10 mm 3. </li><li> Preparar a agulha e seringa para biópsia, colocando uma seringa de 1 ml com um anexado 27 g, 0,5 polegadas da agulha no suporte de seringa. Ajustar o suporte de agulha para orientar a agulha 90 ° em relação ao pescoço do rato (Figura 4A). </li><li> Preparar por toda a plataforma de elevação rato ao nível da agulha. Conseguir isso, removendo o motor 3D e mudar para um platf mais altoorm, ou colocando um objeto sólido de altura adequada sob a plataforma curta fornecidas. Usar um suporte para tubos de microcentrífuga de plástico para esta finalidade. Se necessário, rodar a plataforma 180 °, a fim de biopsia aos nódulos localizados na parte lateral do pescoço em frente ao aparelho de agulha. </li><li> Ajuste as configurações de aquisição, selecionando &quot;Preferências&quot;, então escolhendo &quot;Max &amp; tampão estendida&quot;. Ampliar o campo de visão para uma profundidade de 8,00 milímetros e 9,73 milímetros de largura. Ligue o guia de agulha usando a tela de teclas de discagem. A guia de agulha irá prever o trajecto da agulha na tela e permite que o utilizador alinhe o nó de linfa de interesse no local correcto para a biópsia. </li><li> Assegure-se que o nó de linfa permanece constantemente em vista centrando o nó de linfa no meio ou ligeiramente à esquerda do centro da tela (Figura 4B). Para obter toda a cine loop do procedimento, prima Pré-trigger no teclado do sistema antes de iniciar a biópsia. </li><li> Ajuste o suporte da agulha até que a ponta da agulha vem na vista e contacto com a pele (Figura 4B). Avançar a agulha com um firme, rápida empurrar para perfurar a pele. Continue a avançar a agulha até que a ponta também perfura a cápsula (Figura 4C) e é visível dentro da medula (Figura 4D). </li><li> Uma vez que a agulha está correctamente localizada dentro do nó, puxar suavemente o êmbolo da seringa para trás entre as demarcações 200-300 ul de realizar a biópsia (Figura 4D e 4E). Note-se que material de biópsia não é normalmente visível no interior da seringa. </li><li> Remova cuidadosamente a agulha do pescoço mouse. Expelir o conteúdo da seringa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Remover a agulha da seringa, deixando a agulha no tubo. Recolha 1 ml de mídia biópsia (a partir de uma alíquota, separados da fonte estoque) com a mesma seringa e volte a encaixar a agulha da seringa, mantendo a agulha no the tubo. <ol><li> Lavar a seringa e a agulha com os meios de biópsia, expulsando os meios de biópsia para dentro do tubo. NOTA: Não puxe o êmbolo enquanto a agulha está ligado em qualquer ponto após a biópsia. Isto reduz o risco de perda do material da biópsia, devido ao pequeno tamanho da amostra. </li></ol></li><li> Confirme linfa conteúdo do nó por meio histológicos (Figura 4F) e analisar por métodos adicionais (histoquímica, citometria de fluxo, etc.), conforme apropriado. </li><li> Uma vez que a biópsia é completa, desligue a anestesia e remover a sonda de temperatura retal. Retire o excesso de gel ultra-som do mouse com gaze e remover a fita de cada pata. </li><li> Remover o rato da plataforma de imagem e voltar a uma gaiola. Hemorragia mínima do local da biópsia pode ocorrer, mas este pára sem intervenção. Monitorar o mouse durante a recuperação plena atividade até que seja retomada. </li></ol> 4. Análise de Imagem de linfonodos cervicais <ol><li&gt; No software de ultra-som, selecione a imagem para análise e navegue até a guia &quot;Processamento de Imagem&quot;. Escolha &quot;Load em 3D&quot;. </li><li> Selecione &quot;3D Reconstruído Imagem&quot; no canto superior esquerdo, clicar sobre o botão &quot;Mostrar Pane Single&quot;. Use a função de zoom para ampliar a imagem, se desejar. Alternar &quot;Layout Display&quot; para ver a imagem apenas em B-mode, o que elimina a sobreposição de Doppler de vista. Isto faz com que seja mais fácil de ver as bordas do linfonodo durante subsequente análise 3-D. Role a série de imagens para localizar o início do nódulo linfático. </li><li> Para circunscrever o linfonodo, navegue até a guia &quot;Configurações 3D&quot;. Selecione &quot;volume&quot;, em seguida, no botão &quot;Iniciar&quot; ao lado de &quot;Parallel&quot;. </li><li> Desenhe contornos ao redor da área de interesse dentro de imagens individuais através de rolagem. Continue até que as imagens que englobam todo o linfonodo estão marcados. Escolha &quot;Concluir&quot; paracompletar a análise. </li><li> Na parte inferior da imagem, 3D% volume e vascularização será apresentada automaticamente. NOTA: 3D volume corresponde ao volume de linfonodos e por cento vascularização representa a porcentagem do linfonodo positivo para o fluxo sanguíneo pelo Doppler poder. </li><li> Alternar &quot;Layout Display&quot; para visualizar o Doppler poder como uma sobreposição da imagem em modo B- diante. Na visão superfície observar uma vista líquida da área do volume de juros. Exportar as imagens em arquivo de imagem (TIF) ou formato 3D scans marcados como filmes (.avi) para uso posterior. </li></ol>

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Os custos de publicação do presente artigo são patrocinados pela Visual Sonics.

O protocolo descrito permite a visualização e avaliação in situ dos linfonodos cervicais murino usando a imagem latente HFUS não-invasivo. A utilização de modo-B e Doppler poder visualizar cervical morfologia linfonodo, volume e nó de linfa para o fluxo sanguíneo fornece uma análise experimental de sistemas de modelos pré-clínicos rato análogos àqueles utilizados para a caracterização dos gânglios cervicais de pacientes na prática clínica. A capacidade de controlar os nódulos linfáticos cervial via biópsia com agulha fina também proporciona uma técnica útil para a detecção de alterações de células imunitárias e a presença de tipos de células estranhas ou bactérias durante linfadenopatias induzida por doenças da cavidade oral, em ratos. A facilidade de utilização e de baixo custo associado com HFUS permite a avaliação rápida de estado do linfonodo cervical em uma ampla variedade de modelos animais. Uma etapa fundamental neste protocolo é a identificação bem sucedida inicial dos gânglios linfáticos cervicais em imagens HFUS. Nossa unidade tem uma variedade de HFUS transducers como descrito, por isso, eles têm utilizado para obter as imagens da mais alta qualidade. No entanto, se os transdutores que descrevem não estão disponíveis, é possível adaptar-se a imagem utilizando outros transdutores. Para este efeito, o ajuste de profundidade e largura de imagem para obter uma imagem adequada é tudo o que é necessário. Resolução de tais imagens pode variar, mas ele ainda deve ser possível obter imagens de alta qualidade usando HFUS. Marcos de imagem da cavidade oral e da glândula tiróide vai ajudar muito em orientar o usuário para a região apropriada, onde os nódulos linfáticos são localizadas. A forma oval, natureza hypoechoic característica e localização superficial perto da superfície da pele permite a rápida identificação de confirmação dos linfonodos cervicais na região do pescoço adequada. Enquanto todas as três nós pode ser visível num plano de imagem (Figura 3B), tipicamente um ou dois nós são capturadas durante o exame. Pequenos ajustes da posição do transdutor pode ser conduzida para rasgarer diferentes planos de imagem visível, permitindo a visualização de todos os nodos de um único lado do pescoço. Embora tenhamos encontrado a técnica descrita confiável para a identificação de linfonodos cervicais, há limitações específicas para a técnica de imagem e biópsia. A natureza superficial de rato linfonodos cervicais confere mobilidade excessiva ao mesmo ligeira pressão é aplicado à pele através da cabeça do transdutor. Isto pode ser combatido através da aplicação lentamente a cabeça de transdutor de ultra-som para o gel no pescoço do rato até que as imagens marcantes são identificados. Mobilidade linfonodo também pode complicar a biópsia por agulha fina, especialmente quando se utiliza transdutores na resolução mais alta (50 MHz) gama. Centrado imagens de nódulos linfáticos para biópsia são normalmente empurrados para fora do campo de visão, devido à força da agulha de biópsia necessária para perfurar a pele sobrejacente e cápsula. Isso pode ser remediado pelo posicionamento descentrado do linfonodo na direção da entrada da agulha,proporcionando espaço para o nó de linfa para ser empurrada através de, mas ainda permanecem dentro do campo de visão durante a biópsia. Na nossa experiência, nódulos linfáticos&gt; 10 mm3 são muito difíceis de biópsia, e muitas vezes são empurrados pela agulha penetrou, em vez de durante o avanço da agulha. Assim, a biópsia é melhor reservado para aumento dos gânglios linfáticos, onde o tamanho é&gt; 10 mm3 para garantir o tamanho do alvo nó e estabilidade suficientes na região cervical. Além disso, o material de biópsia não pode conter o número de células suficientes para procedimentos em que são necessárias maiores números de células (por exemplo, citometria de fluxo). HFUS tem sido utilizado com sucesso para visualizar HNSCC ortotópico tumores 25, e tem o potencial para controlar metástases do colo do útero em ratinhos com tumores orais 24. Em adição aos ultra-sons, imagiologia bioluminescente, também tem sido usada para visualizar a formação do tumor por via oral ortotópico e cervical metástases linfáticas em ratos vivos 26,27. Como um alternabordagem operatória, imagem de bioluminescência tem uma vantagem distinta sobre HFUS em ser capaz de quantificar directamente a progressão do tumor e carga metastático ao longo do tempo no mesmo animal. Enquanto inegavelmente útil, imagem de bioluminescência é incapaz de medir muitos dos parâmetros visualizadas por HFUS, incluindo a morfologia nó de linfa, volumes nodais ou fluxo sanguíneo. Imagem de bioluminescência também requer caixas escuras especializados para manter os ratos durante o exame, tornando esta técnica inadequada para adaptação para a biópsia por agulha fina. Além disso, a imagem de bioluminescência requer a produção de células de tumores que expressam de forma estável a enzima luciferase, permitindo esta técnica para ser utilizado apenas em casos de xenoenxertos ortotópicos com células tumorais transfectadas com luciferase em ratinhos imunocomprometidos, ou com sistemas transgénicos específicos de tecidos indutíveis que restringem a expressão de luciferase de um modo espaço-temporal específica para o tecido de origem tumoral. Em contraste, pode ser u HFUSsed em conjunto com imagens bioluminescência nestes modelos, bem como sendo capaz de imagiologia de nódulos linfáticos cervicais em modelos de tumores orais induzida por carcinogénico em ratos com sistemas imunitários completas 28,29. Enquanto HFUS pode ser mais adaptável a maioria dos modelos do rato do cancro oral, a informação combinada que pode ser obtido a partir de bioluminescência e imagem HFUS em sistemas onde as células tumorais expressam luciferase pode fornecer um quadro mais completo da cervical comprometimento dos linfonodos do que qualquer modalidade de imagem sozinha. A capacidade de identificar e detectar nódulos linfáticos cervicais rato em tempo real permite a esta técnica para ser utilizado na maioria dos modelos de doença oral que resultam em linfadenopatia inflamatória em que o animal pode ser mantida numa posição invertida sob anestesia a curto prazo. A detecção de metástases em linfonodos ou infecção bacteriana eo impacto concomitante na morfologia do linfonodo em animais vivos apresenta um benefício significativo em relação aos métodos tradicionaisque exigem nódulos linfáticos de ser removido a partir de animais mortos para processamento histológico. Combinando HFUS com biópsia de agulha fina permite um meio para a realização de análise patológica rotina de nódulos linfáticos cervicais, semelhante ao que é realizado na clínica, proporcionar um método melhorado para monitorizar a progressão da doença na maioria dos modelos actuais de ratinho de doenças da cavidade oral.

Drenagem linfática do tecido fluido intersticial é o principal método de difusão para microorganismos infecciosos e cancros resultantes na região oral e maxilofacial 1,2. A avaliação clínica dos nódulos linfáticos cervicais é uma prática comum de diagnóstico para determinar a presença ou progressão de doenças que se originam na cavidade oral. Isso ressalta a importância dos linfonodos cervicais da coleta em locais anatômicos valiosas para o diagnóstico da doença por via oral 3. Diversas metodologias de imagiologia especializados são clinicamente utilizada para a identificação de linfonodos cervicais doentes. Estes incluem a tomografia de emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (RM). Embora altamente valiosos, estes métodos requerem todos extensa preparação do paciente, equipamentos altamente especializados e / ou infusão química para a circulação para habilitar ou aprimorar o processo de imagem. Sonográfica (ultra-som; US) é uma técnica comumente aplicado usadas para imlinfonodos cervicais em geral apresentam com linfadenopatia devido à infecção ou comprometimento metastático 4-6. EUA é muitas vezes combinado com PET-CT e ressonância magnética para fornecer uma representação completa do estado do linfonodo paciente, ajudando a determinar o estadiamento do tumor ea necessidade de excisão cirúrgica 7. A natureza não-invasivo de nós também tem vantagens inerentes sobre outras modalidades de imagem, incluindo a facilidade de utilização, baixo custo, o mínimo de desconforto do paciente e preparação. A localização subcutânea superficial da maioria dos linfonodos cervicais permite a US para guiar biópsias aspirativa por agulha fina minimamente invasivas com maior precisão, melhorando a precisão do diagnóstico 8. De alta freqüência comercial (IC) dos EUA fornece resolução detalhada de estruturas anatômicas internas a 30 um 9. Utilizando transdutores variando 22-70 MHz, HFUS foi prontamente aplicadas a uma variedade de sistemas de roedores experimentais para permitir a imagiologia em tempo real dos órgãos internos in vivo.; HFUS foi adaptado para a visualização da formação de tumor em brilho (B) -modo convencional, bem como com um número de gerais e especializados agents9 realce do contraste. Usando Doppler poder com HFUS fornece a capacidade de monitorar o fluxo de sangue dentro de tumores de ratos, permitindo uma avaliação abrangente da perfusão angiogênico em camundongos vivos 10,11. HFUS tem sido usada para visualizar os nódulos linfáticos do rato doentes dentro da cavidade do corpo principal, demonstrando utilidade paralelo desta tecnologia para a prática clínica. Em particular, inflamatórias e metastáticos alterações linfonodos visceral têm sido observados em modelos de ratos com câncer de mama abrigando 12,13, 14 de pâncreas, colo-retal e pulmão 15 16 tumores, bem como histocytomas fibrosos 17, e um modelo de rato de idade hydronephrosis adquiriu 18 . Estes exemplos solidificar o valor de HFUS como uma poderosa ferramenta de investigação de linfadenopatia induzida por tumor em uma ampla variedade de rosistemas de dente. Vários modelos de infecção bacteriana 19,20 e cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermóide) 21,22 foram desenvolvidos para estudar estas doenças na configuração pré-clínico. Em contraste com os seres humanos, os ratos conter três linfonodos cervicais que pesquisa linfa dos tecidos bucais da cavidade (mandibular, mandibular submandibular e parótida superficial 23). Recentemente, nós relataram o uso de HFUS para mapear a localização e morfologia desses linfonodos, monitorando mudanças no volume de linfa nó e fluxo de sangue em um modelo de rato induzida por substância cancerígena de CECP 24. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a utilização de HFUS para a identificação, de imagem e análise de nódulos linfáticos cervicais em ratos vivos. Este protocolo também demonstra a viabilidade da utilização HFUS para conduzir image- guiado biópsia por agulha fina dos linfonodos cervicais rato alargada, permitindo o monitoramento histológico de alterações no conteúdo dos linfonodos cervicais e patologias mais de time no mesmo animal. Este protocolo é facilmente adaptável para permitir o estudo detalhado da cervical patologias resultantes dos nódulos linfáticos a partir de qualquer doença invasiva cavidade oral em ratinhos.

<table><tbody><tr><td>Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>Power Dopper Mode and 3D Mode</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-11952; VS-11484</td><td></td></tr><tr><td>Vevo compact anesthesia system</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>SA-11983</td><td></td></tr><tr><td>Thermasonic Gel Warmer</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td></td><td>Optional</td></tr><tr><td>Transducers &amp;ndash; MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz)</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-11960</td><td>Referred to as 40 MHz Transducer</td></tr><tr><td>Transducers &amp;ndash; MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz)</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-12026</td><td>Referred to as 50 MHz Transducer</td></tr><tr><td>Ophthalmic Ointment</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-1663</td><td></td></tr><tr><td>Electrode gel</td><td>Parker Laboratories</td><td>174-1525</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>Medical Arts Press</td><td>174-153000</td><td></td></tr><tr><td>Depilatory Cream</td><td>Carter Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>General Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-907</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>General Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lubricating gel</td><td>Parker Laboratories</td><td>57-05</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound gel</td><td>Parker Laboratories</td><td>01-50</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube rack</td><td>General Supply</td><td></td><td>Used to raise mouse platform for optimal biopsy position</td></tr><tr><td>27 G &amp;frac12; inch needle with 1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>ThinPrep PreservCyt Solution</td><td>Hologic</td><td>70097-002</td><td>Refered to as biopsy media</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>General Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thinprep 2000 processor</td><td>Cytyc, Marlborough, MA</td><td></td><td>Blue Filter</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Provis Microscope</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-frequency ultrasound imaging of mouse cervical lymph nodes

De alta freqüência ultra-som (HFUS) é amplamente utilizado como um método não-invasivo para a imagem latente estruturas anatômicas internas em sistemas de pequenos animais experimentais. HFUS tem a capacidade de detectar estruturas tão pequenas quanto 30 um, uma propriedade que tem sido utilizada para visualizar linfonodos superficiais em roedores em brilho (B) -modo. Combinando o poder com Doppler em modo-B permite medir o fluxo sanguíneo circulatório dentro de nódulos linfáticos e outros órgãos. Enquanto HFUS tem sido utilizada para imagiologia do nó de linfa de um número de sistemas de modelos de rato, não foi relatado um protocolo detalhado descrevendo imagiologia HFUS e caracterização dos nódulos linfáticos cervicais em ratinhos. Aqui, mostramos que HFUS pode ser adaptado para detectar e caracterizar nódulos linfáticos cervicais em ratinhos. B-modo combinado e Doppler poder pode ser usado para detectar aumentos no fluxo sanguíneo nos gânglios cervicais imunologicamente ampliadas. Nós também descrevem o uso de em modo-B para realizar biópsias por agulha fina de linfa cervical nãodes para recuperar tecido linfático para análise histológica. Finalmente, passos-aided software são descritos para calcular as variações de volume dos linfonodos e visualizar alterações na morfologia dos linfonodos seguintes reconstrução da imagem. A capacidade de monitorar visualmente alterações na biologia nódulo linfático cervical ao longo do tempo proporciona uma técnica simples e poderosa para a monitorização não invasiva das alterações dos nódulos linfáticos cervicais em modelos pré-clínicos de rato da doença da cavidade oral.

O esquema geral para os procedimentos de imagiologia e de biópsia é mostrado na Figura 1. As etapas importantes do processo incluem a preparação adequada do rato para a imagiologia, a identificação dos nódulos linfáticos cervicais, uma correcta preparação e realização de biópsia da agulha, e análise de B -mode e Doppler imagens para medir o volume ea quantidade de vascularização dentro de cada nó selecionado usando o software de computador. HFUS imagiologia de nódulos linfáticos cervicais rato requer a aplicação e manutenção de anestesia adequada ao longo do período de imagiologia (Figura 2A), bem como a remoção completa do cabelo que cobrem toda a área da garganta (Figura 2B). A aplicação liberal de gel de ultra-som para a região depilada garante um sinal claro HFUS durante o procedimento (Figura 2C). HFUS imagem da região do pescoço é auxiliado pela visualização de marcos anatômicos do colo do útero que produzem imagens por ultrassom característicos. Figura3 mostra exemplos dos órgãos-chave (Figura 3A-C), linfonodos cervicais em modo-B (Figura 3D) e no modo Doppler (Figura 3E). Em tempo real de imagens HFUS em ratos anestesiados permite guiar a biópsia com agulha fina de gânglios cervicais semelhantes ao que é realizado na prática clínica. A colocação da agulha de biópsia e seringa de recolha acoplado ao equipamento microinjetor controlador é mostrado na Figura 4A. B-mode subsequente imagens por ultrassom mostrar a localização ideal da agulha antes da biópsia (Figura 4B), agulha de entrada ponta em um linfonodo cervical (Figura 4C), e posição da agulha durante a biópsia (Figura 4D). Close-up imagem mostra a ponta da agulha dentro da medula do linfonodo (Figura 4E). Processamento dos componentes de biópsia por cytospin revela aglomerados de células linfóides abundantes e tecido conjuntivo associado, verificando linfonodo sucessobiópsia (Figura 4F). Análise baseada em computacional de imagens HFUS permite obter informações detalhadas a serem obtidos sobre a arquitetura do linfonodo, volume e fluxo vascular. Usando o modo Doppler poder e medições de volume 3D, cento vascularização (PV) pode ser calculado a partir de séries de imagem abrangendo nós inteiros (Figura 5A). Além disso, imagens 3D permite a reconstrução virtual de linfonodo, revelando a topografia geral dos linfonodos (Figura 5B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig1.jpg" /> Figura 1:. Esquemática Visão geral dos passos envolvidos no diagnóstico HFUS linfático cervical imagiologia nó em ratinhos Os passos chave incluem 1: Preparação do ratos para imagiologia HFUS e obtenção de 40 e 50 imagens de resolução MHz da região do pescoço, contendo os nódulos linfáticos cervicais três rato . 2: biópsia por agulha fina dos linfonodos cervicais e posterior análise histológica guiada por imagem<html> de material de biopsia. 3: análise de imagem assistida por computador e reconstrução 3D de imagens de linfonodos obtidos em modo B e Doppler para determinar o respectivo volume de linfonodo e de porcentagem (%) do fluxo vascular. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig2.jpg" /> Figura 2:. Resumo da alta resolução em sistema de micro-imagem in vivo para a avaliação do linfonodo cervical e biópsia (A) O sistema HFUS é mostrado com um rato anestesiado preparado para imagiologia linfonodo cervical. Também é mostrado o microinjector (MI) e fase 3D-motor (3D MS) equipamento acessório. (B) Feche acima da vista de um rato anestesiado preparado para imagens HFUS com cabelo removido na região do pescoço. (C) O mesmo do rato com o transdutor de 50 MHz no lugar no pescoço. Observe o gel de ultra-som adicional utilizado para facilitar pescoço região de imagem. 718fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Representante HFUS imagens anatomia do colo do útero em modo B e Doppler. (A, B) as imagens de modo B da cavidade oral, mostrando a cavidade bucal (BC) e lingueta (T) visualizada por imagem mais próximo da cavidade nasal. Os três nódulos linfáticos cervicais encontrados em cada lado do pescoço (marcado H, mandibular; SM, submandibular, SP, parótida superficial), aparecem como um grupo de estruturas hipoecoicas num plano de imagem única, como mostrado (B). (C) A glândula tiróide (Th) como visualizado na região torácica superior, aparecendo como uma estrutura em forma de borboleta sólido, ecogénico. (AC) foram visualizadas com um transdutor de 40 MHz; barra de escala = 1 mm. (D, E) Imagens representativas de normal (D) e (E) aumento dos gânglios linfáticos cervicais com B-modo e Doppler (vermelho). As linhas pontilhadas delinear linfonodos individuais. Barra de escala = 0,5 mm. <img alt="Figura 4" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52718 / 52718fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4: Cervical biópsia de linfonodo set-up, imagem e análise cytospin de material de biópsia (A) A plataforma de imagem que mostra a micro-injector e colocação da agulha perto do pescoço mouse.. Um suporte para tubos de microcentrífuga de largura (bloco de laranja) é usado para elevar ligeiramente a plataforma, permitindo a colocação apropriada da agulha permitindo ainda espaço para a fase de 3D-motora. Este arranjo minimiza o tempo gasto remover a fase do motor para cada rato. (B - D) Total das imagens HFUS pescoço tirada de um vídeo de uma biópsia de linfonodo cervical utilizando o transdutor de 50 MHz. Imagem em modo B HFUS mostrando a agulha posicionada para o lado do pescoço antes da biópsia (B). A ponta da agulha é a estrutura hiperecóica logo abaixo da posição da guia de agulha (linha pontilhada verde) sobreposta durante imagiologia para denotar a trajectória da agulha. O nó de linfa é no centro dea imagem. Escala da barra = 1 mm. (C) a entrada da agulha no linfonodo. (D) A biópsia do linfonodo cervical. (E) a biópsia do linfonodo Zoomed cervical. Barra de escala = 0,5 mm. Análise (F) Cytospin de material representante linfa biópsia confirmando biópsia bem sucedido. Barra de escala = 100 pm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig5.jpg" /> Figura 5:. A análise por computador de imagens 3D em linfonodos cervicais (A) imagem de tela Representante de um linfonodo analisadas usando software de computador. O nó está circunscrito em azul; os resultados da análise mostram Volume 3D e vascularização por cento (PV), como indicado. Uma imagem vista superfície do mesmo nó após análise 3D (B). Processa volume inteiro do linfonodo com base em medições efectuadas em A.

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High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Este protocolo descreve a aplicação de ultra-som de alta freqüência (HFUS) para rato imaging linfonodos cervicais. Esta técnica otimiza a visualização e quantificação da morfologia cervical linfonodo, volume e fluxo sanguíneo. Biópsia de linfonodos cervicais e processamento de tecido linfático para avaliação histológica guiada por imagem também é demonstrada.

De alta frequência Ecografia de mouse linfonodos cervicais

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

high-frequency-ultrasound-imaging-of-mouse-cervical-lymph-nodes

Research

JoVE Journal

Medicine

18.9K visualizações.  West Virginia University.  Este protocolo descreve a aplicação de ultra-som de alta freqüência (HFUS) para rato imaging linfonodos cervicais. Esta técnica otimiza a visualização e quantificação da morfologia cervical linfonodo, volume e fluxo sanguíneo. Biópsia de linfonodos cervicais e processamento de tecido linfático para avaliação histológica guiada por imagem também é demonstrada. 

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Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

Biologia

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Cirurgia Nó murino superficial linfático

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Imunologia e Infecção

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a primary tumor has been induced by tamoxifen treatment, an increase in metastatic burden is observed within 4-6 weeks after induction. This paper shows how Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging can be exploited to monitor the increase in metastatic involvement of the inguinal lymph nodes by measuring the increase in their volume.
The UHFUS system is used to scan anesthetized mice with a UHFUS linear probe (22-55 MHz, axial resolution 40 &#181;m). B-mode images from the inguinal lymph nodes (both left and right sides) are acquired in a short-axis view, positioning the animals in dorsal recumbency. Ultrasound records are acquired using a 44 &#181;m step size on a motorized mechanical arm. Afterward, two-dimensional (2D) B-mode acquisitions are imported into the software platform for ultrasound image post-processing, and inguinal lymph nodes are identified and segmented semi-automatically in the acquired cross-sectional 2D images. Finally, a total reconstruction of the three-dimensional (3D) volume is automatically obtained along with the rendering of the lymph node volume, which is also expressed as an absolute measurement.
This non-invasive in vivo technique is very well tolerated and allows the scheduling of multiple imaging sessions on the same experimental animal over 2 weeks. It is, therefore, ideal to assess the impact of pharmacological treatment on metastatic disease.

Melanoma is a very aggressive disease that quickly spreads to other organs. This protocol describes the application of ultra-high-frequency ultrasound imaging, coupled with 3D rendering, to monitor the volume of the inguinal lymph nodes in the Braf/Pten mouse model of metastatic melanoma.

Análise do volume do nódulo linfático por ultra-alta frequência ultrassom no modelo de camundongos geneticamente modificado braf/pten de melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Pesquisa do câncer

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes significantly. Genetically engineered murine models that mimic ATC&#39;s progression may help researchers to study treatments for this disease. Crossing three different genotypes of mice, a TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53&#916;ex2-10/&#916;ex2-10&#160;transgenic ATC model was developed. The ATC murine model was induced by an intraperitoneal injection of tamoxifen with overexpression of BrafV600E and deletion of Trp53, and the tumors were generated within about 1 month. High-resolution ultrasound was applied to investigate the tumor initiation and progression, and the dynamic growth curve was obtained by measuring the tumor sizes. Compared to magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography scanning, ultrasound has advantages in observing the ATC murine model, such as being noninvasive, portable, in real-time, and without radiation exposure. High-resolution ultrasound is suitable for dynamic and multiple measurements. However, ultrasonographic examination of the thyroid in mice requires relevant anatomical knowledge and experience. This article provides a detailed procedure for utilizing high-resolution ultrasound to scan tumors in the transgenic ATC model. Meanwhile, ultrasonic parameter adjustment, ultrasound scanning skills, anesthesia and recovery of the animals, and other elements that need attention during the process are listed.

The present protocol describes high-frequency ultrasonography for visualizing the entire mouse thyroid gland and monitoring the growth of anaplastic thyroid carcinoma.

Ultrassonografia de Alta Resolução na Análise de Tumores Ortotópicos ATC em Modelo de Camundongo Geneticamente Modificado

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to assessing pathology post-mortem in animals euthanized at multiple time points in different cohorts, which increases the number of mice needed for a study. Imaging mice in longitudinal studies can track the progression of disease in individual animals, reducing the number of mice needed. Advances in ultrasound technology have allowed for the detection of micrometer-level changes in tissues. Ultrasound has been used to study follicle maturation in ovaries and xenograft growth but has not been applied to morphological changes in the mouse uterus. This protocol examines the juxtaposition of pathology with in vivo imaging comparisons in an induced endometrial cancer mouse model. The features observed by ultrasound were consistent with the degree of change seen by gross pathology and histology. Ultrasound was found to be highly predictive of the observed pathology, supporting the incorporation of ultrasonography into longitudinal studies of uterine diseases such as cancer in mice.

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

This protocol describes a method for monitoring the progression of morphological changes over time in the uterus in an inducible mouse model of endometrial cancer using ultrasound imaging with correlation to gross and histological changes.

Avaliação Ultrassonográfica Não Invasiva da Progressão do Câncer de Endométrio na Deleção Dirigida por Pax8 dos Supressores Tumorais Arid1a e Pten em Camundongos

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Ultrafast Doppler Ultrasound for Hepatic Microvasculature Analysis in Mice

Imaging and Quantification of the Hepatic Vasculature of Mice Using Ultrafast Doppler Ultrasound

Non-invasive in vivo imaging of the vasculature is a powerful tool for studying disease mechanisms in rodents. To achieve high sensitivity imaging of the microvasculature using Doppler ultrasound methods, imaging modalities employing the concept of ultrafast imaging are preferred. By increasing the frame rate of the ultrasound scanner to thousands of frames per second, it becomes possible to improve the sensitivity of the blood flow down to 2 mm/s and to obtain functional information about the microcirculation in comparison to a sensitivity of around 1 cm/s in conventional Doppler modes. While Ultrafast Doppler ultrasound (UFUS) imaging has become adopted in neuroscience, where it can capture brain activity through neurovascular coupling, it presents greater challenges when imaging the vasculature of abdominal organs due to larger motions linked to breathing. The liver, positioned anatomically under the diaphragm, is particularly susceptible to out-of-plane movement and oscillating respiratory motion. These artifacts not only adversely affect Doppler imaging but also complicate the anatomical analysis of vascular structures and the computation of vascular parameters. Here, we present a qualitative and quantitative imaging analysis of the hepatic vasculature in mice by UFUS. We identify major anatomical vascular structures and provide graphical illustrations of the hepatic macroscopical anatomy, comparing it to an in-depth anatomical assessment of the hepatic vasculature based on Doppler readouts. Additionally, we have developed a quantification protocol for robust measurements of hepatic blood volume of the microvasculature over time. To contemplate further research, qualitative vascular analysis provides a comprehensive overview and suggests a standardized terminology for researchers working with mouse models of liver disease. Furthermore, it offers the opportunity to apply ultrasound as a non-invasive complementary method to inspect hepatic vascular defects in vivo and measure functional microvascular alterations deep within the organ before unraveling blood vessel anomalies at the micron scale levels using ex vivo staining on tissue sections.

Ultrafast Doppler ultrasound (UFUS) with high spatial resolution (100 &#956;m) and sensitivity represents a suitable noninvasive imaging modality for obtaining a comprehensive qualitative overview of the hepatic vasculature. UFUS also facilitates quantitative measurements of the microvasculature, aiming to enhance our understanding of vascular disease mechanisms.

Non-invasive in vivo imaging of the vasculature is a powerful tool for studying disease mechanisms in rodents. To achieve high sensitivity imaging of the ...