Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health [Grant não. R01NS069726] e da Associação Americana do Coração, em Grant Grant Aid [Grant não. 13GRNT17020004] para SD.

Nota: Os ratinhos (C57BL / 6J, macho) envelhecido 10 - 12 semanas, foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pela Universidade de Missouri Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Pré-Surgery <ol><li> No dia antes da cirurgia autoclave e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos. Enrole os instrumentos e autoclave a 121 ° C a 15 psi durante 30 min seguido por 30 min de secagem (121 ° C, 15 psi, 30/30 ciclo). Coloque os instrumentos em um ambiente limpo e esterilizado até à sua utilização. </li><li> Solução fresca Rosa Bengala (RB) (20 mg / ml em solução salina estéril) toda vez que antes da cirurgia se preparar. Para dissolver completamente RB, o tubo de vórtice, em seguida, seguido por sonicação durante 5 min a 50/60 Hz, com potência de 19 W. Envoltório do tubo em folha de alumínio e proteger da luz de saída até novo utilizado durante surGery. </li><li> Prepara-se uma mistura de cetamina / xilazina em solução salina estéril. Adicionar 125 ul de xilazina (concentração estoque: 20 mg / ml) e 325 ul de ketmaine (concentração estoque: 100 mg / ml) e 550 ul de solução salina estéril para perfazer um volume final de 1 mL de mistura de anestésicos. </li><li> Pré-aquecer a almofada de aquecimento homeotérmicos. </li><li> Pré-aquecer a lâmpada de iodetos metálicos (fonte de luz para FN1 epi-microscópio de fluorescência) durante 30 minutos para estabilizar a potência da lâmpada. </li><li> Ajustar o tamanho da região iluminada a um diâmetro de 1 mm, utilizando uma objectiva 10X e retículo ajustando o diafragma de campo na vertical FN1 epi-microscópio de fluorescência. </li></ol> 2. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Anestesiar o rato com uma dose de cetamina (130 mg / kg B. peso.) E xilazina (10 mg / kg B. peso.). Com base no cocktail em 1,3, 4 ul por g de rato B. peso. são precisos. Esterilizar o local da injecção com um algodão com álcool e administrar os anestésicos através do intra-peritoneal rota (IP). Tome cuidado para não injetar os anestésicos para os vasos sanguíneos do músculo ou como isso iria atrasar a indução e recuperação do animal. </li><li> Aplicar pomada lágrima artificial para ambos os olhos do rato para evitar a secagem e colocar o animal no almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. </li><li> Preparação de animais <ol><li> Verifique o animal para a anestesia adequada nível cirúrgico usando a resposta toe pitada. </li><li> Uma vez que o animal atingiu o nível cirúrgico de anestesia, cortar o cabelo na superfície dorsal em torno da linha média do animal usando um aparador de cabelo elétrico. Esfregar o local cirúrgico com etanol a 70% seguido por solução de betadine três vezes. Cubra o local com um campo cirúrgico estéril até o próximo passo. </li></ol></li><li> Procedimento cirúrgico para afinar o osso para expor a medula espinhal <ol><li> Colocar o rato em uma posição de bruços através da almofada de aquecimento homeotérmica na plataforma cirúrgica (Figura 1A). Corretamente proteger o ratopostura usando uma braçadeira de focinho para manter uma região de pescoço alongado (Figura 1A, B). </li><li> Faça uma incisão (cerca de 1 cm de comprimento) usando tesouras cirúrgicas ao longo de meados da linha dorsal que se estende desde o T9 vértebras torácicas para T12. Afastar a pele para expor a área cirúrgica. </li><li> Usando um bisturi, cuidadosamente limpar o músculo para expor as espinhas dorsais na T9 - T12 vértebras. Parar o sangramento em cada etapa aplicando uma pressão suave com cotonete estéril. T10 separado - T12 vértebras do músculo circunvizinho e fixá-los usando uma braçadeira vertebral para estabilizar e impedir qualquer movimento (Figura 1A, B). </li><li> Usando uma broca de alta velocidade com osso polimento broca, com cuidado e fina suavemente a superfície dorsal da vértebra T10 ou T11 para visualizar a veia vertebral posterior e outras embarcações pequenas na superfície dorsal do SC (Figura 1C). </li><li> Para evitar danos térmicos, devido ao calor gerado durante o processo de desbaste,aplicar uma corrente suave e constante de solução salina normal juntamente com sucção constante para remover os detritos. </li><li> Usando um bisturi cuidadosamente alisar a superfície do osso até que o recipiente principal é claramente visível. Tome cuidado para não danificar a medula espinhal durante este processo. </li><li> Uma vez que o vaso sanguíneo é visualizado, RB administrar a uma dose de 30 mg / kg (peso corporal) por via do seio retro-orbital usando uma seringa de insulina. </li><li> Medir o fluxo sanguíneo através de um medidor de fluxo laser de Doppler após 3 min após a injecção, se necessário, RB (Figura 2A, B). Manter a assepsia durante o procedimento inteiro. </li></ol></li></ol> 3. Indução de PT <ol><li> Colocar o animal numa fase ajustável posição XY ao longo de um Lab-Jack que pode ajustar a altura. Ajuste a posição do mouse para que a região exposta do T11 medula espinhal está diretamente sob a objetiva de 10x do microscópio FN1 epi-fluorescência (Figura 3A). </li><li> Defina o poder do lifonte GHT a 12% e irradiar a região T11 com um diâmetro de 0,75 milímetros no meio da medula espinal diluído (Nota: esta região inclui a veia vertebral posterior e outros capilares) com uma luz verde (comprimento de onda de 540-580 nm, que é conseguido pelo cubo de filtro no microscópio) através da objectiva 10X durante 2 min. Captar imagens no início e no fim de irradiação (Figura 3B, C) ​​e registar o tempo da experiência neste ponto. </li><li> Medir o fluxo de sangue de novo durante 10 minutos, se necessário, através da colocação da sonda Doppler de laser para a mesma posição acima da medula espinhal como em 2.4.8 (Figura 2A, B). </li><li> Após o check-irradiação para qualquer hemorragia e se nenhum encontrado proceder à sutura do animal. Sutura da fáscia superficial juntamente com os músculos de cada lado da medula espinhal do usando uma sutura absorvível ou tamanho 4-0 sutura de seda. Tome cuidado para não danificar o SC exposta. Sutura da pele com fio de seda 4-0. Aplicar Betadine ou iodopara as bordas da pele após a sutura. </li></ol> 4. Pós-cirurgia Cuidados <ol><li> Após a sutura, coloque o animal na almofada de aquecimento para a recuperação. Após a recuperação dos animais para verificar sinais de déficits neurológicos, observando o movimento de ambas as traseiras-membros. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Transferir os animais para a gaiola. Não devolva o animal que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. </li><li> Confira os animais em intervalos regulares. Em caso de déficits neurológicos graves, fornecer o cuidado adequado, como evacuação de bexiga, administração de analgésicos (buprenorfina, 0,05-0,1 mg / kg). Verifique se há desidratação e administrar por via subcutânea soro fisiológico normal em caso grave. Normalmente, a buprenorfina (0,1 mg / kg), será administrada após a sutura para aliviar a dor no local da cirurgia. </li><li> Se os animais não são imediatamentesacrificados após a cirurgia, vamos colocar alto teor de água dieta no chão da gaiola, para que os animais possam alcançar o alimento facilmente. </li></ol> 5. transcardial Perfusão, coloração Nissl e Immunostaining <ol><li> Transcardialmente perfundir o animal, como descrito anteriormente 17-20. <ol><li> Anestesiar o animal, tal como descrito anteriormente no protocolo e perfundir transcardíaca com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), seguido de gelado paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. </li><li> Após a perfusão, remover a medula espinhal (SC) e pós fixar-lo em PFA 4% em PBS a 4 ° CO / N. Transferir o SC fixo em PBS com 30% de sacarose e mantê-lo por 2 - 3 dias até que se deposita no fundo do tubo. </li><li> Usando um criostato corte da espinal medula em 30 mm de espessura e colocá-los em série em um revestido com gelatina em lâminas de vidro ou uma placa de 48 poços com 0,01 M de PBS. </li></ol></li><li> Coloração de Nissl: Para inspecionar o prejuízo causado pela PT realizar uma Nissl staining em secções da espinal medula como descrito previamente 17-20. <ol><li> Resumidamente, recolher cada quinta fatia da medula espinhal nas lâminas de vidro e mancha com 0,25% de cresilo violeta. Tome imagens dos cortes corados (Figura 4). </li></ol></li><li> A imunocoloração: Tal como anteriormente descrito utilizando um método secção 17,18,20 flutuante. <ol><li> Resumidamente, corar as secções da espinal medula por incubação O / N a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-glia proteína fibrilar ácida (GFAP) anticorpo policlonal (1: 300), anticorpo de coelho anti-NeuN (1: 300), e anti-coelho anticorpo Iba1 (1: 500) seguido de anti-coelho de burro conjugado com Alexa 568-IgG (1: 400) de anticorpos secundários durante 4 h à TA. Captar imagens com um microscópio de fluorescência (Figura 5). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Neste estudo, descrevemos um modelo photothrombotic de SC isquemia. Devido aos avanços na engenharia genética, tem havido uma onda de camundongos transgênicos comercialmente disponível que tornou possível estudar o impacto de genes específicos envolvidos na fisiopatologia isquêmico no SC. O objectivo do estudo foi o de desenvolver um modelo reprodutível rato de isquemia medular. Aqui nós adaptamos um modelo cortical PT para induzir SCI em camundongos. No seguimento da cirurgia da coluna vertebr...

Traumática lesão medular (LM) é uma condição clínica devastador que afeta as funções sensório-motoras e autonômicas do SC. Pacientes sobreviventes SCI muitas vezes são deixados com paraplegia debilitante que afeta significativamente suas atividades diárias e qualidade de vida 1. Modelos Experimental SCI têm sido uma ferramenta indispensável na investigação científica para compreender a fisiopatologia da SCI e processos de reparação neural associados. Estes modelos também foram utilizados para testar a eficácia pré-clínica de diversas intervenções neuroprotectores experimentais que são destinadas a recuperação funcional. Atualmente, a maioria dos modelos SCI, na prática, empregar o uso da força física sem corte para perturbar e prejudicar o SC mecanicamente. Estes métodos incluem contusão, compressão, deslocamento e transecção do SC 2. Tem sido sugerido que após o insulto mecânica primária uma lesão secundária sob a forma de conjuntos de isquemia no lesada no SC<html> 3,4. A etiologia da isquemia secundária inclui extensa degeneração do tecido, hemorragia parenquimatosa e às vezes por obstrução de vasos sanguíneos por edema do tecido 5-7. Como resultado da lesão secundária a integridade de SC é mais afectada, neurónios e células gliais são severamente prejudicada em função e viabilidade e sofrem apoptose que leva a um crescimento de infarto durante a fase crónica da lesão, análogo ao crescimento de penumbra de isquemia pós-AVC 8,9. Vários mecanismos como excitotoxicidade, produção de radicais livres, e inflamação foram relatados para ser responsável pela morte celular isquémica após uma lesão medular 10,11. Além disso, SC isquemia é uma complicação grave de cirurgias tóraco-abdominal do aneurisma da aorta, que muitas vezes levam a paraplegia nos pacientes 12,13. Apesar de tão alto impacto clínico muito poucos modelos de isquemia medular com alta reprodutibilidade estão disponíveis no momento. nt &quot;&gt; Indocianina (PT) é um método vulgarmente utilizado para a indução de isquemia focal no cérebro 14-20. A técnica é relativamente não invasivo e altamente reprodutível e produz uma lesão isquémica focal exacta da área exposta do cérebro 17 -21. Isto é conseguido por administração sistémica de corantes fotoactivos como Rose Bengal (RB) ou 16-20,22 eritrosina B 23 seguido por irradiação localizada de vasos sanguíneos com fonte de luz adequada. A fotoactivação do corante faz com que a geração de radicais livres que interromper a integridade do endotélio vascular liso, e fazer com que as plaquetas se acumulam, que subsequentemente forma um trombo. A obstrução do fluxo de sangue pelos resultados do trombo em um enfarte na região fornecido pelo vaso 24. Devido à facilidade de controlo sobre o intensidade e da duração da irradiação este procedimento produz um enfarte altamente uniforme e reprodutível. Além disso, este método pode ser empregue para induzir um enfartet em várias posições anatómicas permitindo espacial (por exemplo, substância cinzenta vs matéria branca) compreensão do efeito da isquemia. O objetivo do presente estudo é desenvolver um modelo fácil e altamente reprodutível de SC isquemia em ratinhos. Nós descrevemos o procedimento de um modelo PT de SC isquemia em ratinhos. Os resultados de histologia e imunocoloração demonstrou que a PT pode efectivamente induzir enfarte do SC, perda neuronal e gliose reactiva.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1050">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Rose Bengal</td>
			<td style="width:233px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">330000</td>
			<td style="width:421px;">20 mg/ml in sterile saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl6/J</td>
			<td>Jackson lab</td>
			<td>664</td>
			<td>22-25g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine&#160;</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-996-06</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine&#160;</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-234-11</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Betadine solution</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC-67618-150-01</td>
			<td>10% povidone iodine topical solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal saline</td>
			<td>Abott Laboratories</td>
			<td>04930-04-10</td>
			<td>For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tears ointment&#160;</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC-0536-6550-91</td>
			<td>83% white petrolatum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Decon labs.Inc</td>
			<td>2716</td>
			<td>70% ethanol for disinfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal halide lamp</td>
			<td>EXFO, Canada</td>
			<td>X-Cite 120 PC&#160;</td>
			<td>Set power at 12%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>15000-10</td>
			<td>for minor dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors (angled to side)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>14063-011</td>
			<td>No. 3 handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard scalpel</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>for removing muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2976</td>
			<td>No. 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (curved)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11150-10</td>
			<td>for holding tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (straight)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>for holding tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holder&#160;</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>for suturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue adhesive glue</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>to adhere to edges of the cut skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monofilament polypropylene&#160;</td>
			<td>USSC Sutures</td>
			<td>VP-521</td>
			<td>Size = 4-0 (for fascia)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perma-hand silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>683G</td>
			<td>Size = 4-0 (for skin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro drill</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. Inc.</td>
			<td>RS-6300</td>
			<td>with bone polishing drill bit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser doppler flowmeter</td>
			<td>Moor Instruments</td>
			<td>moorVMS-LDF1</td>
			<td>for monitoring change in blood flow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating pad</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>21052-00</td>
			<td>to prevent hypothermia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab-Jack</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>14-673-50</td>
			<td>4x4 in plate to adjust the height of the animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y gliding stage&#160;</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>GT100</td>
			<td>for positioning the animal under microscope&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photothrombosis-induced focal ischemia as a model of spinal cord injury in mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

O objetivo deste estudo foi o de produzir isquemia medular em ratos usando um modelo PT. Após a região desejada do osso por cima da medula espinhal (T10 - T12) foi diluído, Rosa de Bengala foi injectado por via sinus retro-orbital, e a isquemia foi induzida pela PT A Figura 1A e B mostram o rato posicionado numa cirúrgico feito por encomenda. plataforma durante a cirurgia. O rato foi mantido no lugar por um grampo focinho e dois grampos vertebrado ajustável para estabilizar a coluna vertebral <stro...

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Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Fototrombose induzida por isquemia focal como um Modelo de Lesão Medular em Ratos

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

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Research

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Medicine

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