Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [Gabe nicht unterstützt. R01NS069726] und der American Heart Association in Grants Beihilfen [Zuschuss Nr. 13GRNT17020004] auf SD.

Hinweis: Die Mäuse (C57BL / 6J, männlich) im Alter 10 bis 12 Wochen um waren in dieser Studie verwendet. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der University of Missouri Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. 1. Pre-Chirurgie <ol><li> Der Tag vor der Operation Autoklaven sterilisieren und alle chirurgischen Instrumenten. Wickeln Sie die Instrumente und Autoklav bei 121 ° C bei 15 psi für 30 Minuten, gefolgt von 30 min zum Trocknen (121 o C, 15 psi, 30/30 Zyklus). Legen Sie die Instrumente in einem sauberen und sterilen Umgebung bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Bereiten Sie frische Rose Bengal (RB) Lösung (20 mg / ml in steriler Kochsalzlösung), jedes Mal vor der Operation. Um sich vollständig aufzulösen RB, Wirbel die dann durch Ultraschallbehandlung für 5 min bei 50/60 Hz mit einer Ausgangsleistung von 19 W. Wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie und vor Lichtröhre bis auf weiteres während sur verwendetgery. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung von Ketamin / Xylazin in steriler Kochsalzlösung. Fügen Sie 125 ul von Xylazin (Stammkonzentration: 20 mg / ml) und 325 &amp; mgr; l ketmaine (Stammkonzentration: 100 mg / ml) und 550 &amp; mgr; l steriler Kochsalzlösung, um ein Gesamtvolumen von 1 ml des Anästhetikums Mischung zu machen. </li><li> Pre-warm die homeothermic Heizkissen. </li><li> Pre-warm die Metallhalogenlampe (Lichtquelle für FN1 Epi-Fluoreszenzmikroskop) für 30 Minuten, um die Lampenleistung zu stabilisieren. </li><li> Anpassen der Größe des beleuchteten Bereichs auf einen Durchmesser von 1 mm unter Verwendung von 10X-Objektiv und einer Strichplatte durch Einstellung der Feldblende in der aufrechten FN1 Epi-Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 2. Chirurgisches Verfahren <ol><li> Betäuben die Maus mit einer Dosis von Ketamin (130 mg / kg B. Gew.) Und Xylazin (10 mg / kg B. Gew.). Auf der Grundlage der Cocktail in 1.3, 4 &amp; mgr; l pro g Maus B. Gew. werden gebraucht. Sterilisieren Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer und Verwaltung der Anästhesie durch den inner-peritoneal (IP) Route. Achten Sie darauf, die Betäubungsmittel in die Blutgefäße oder Muskel injizieren, da dies würde die Ein- und Ausleitung des Tieres zu verzögern. </li><li> Künstliche Tränen Salbe auf beiden Augen von der Maus, um ein Austrocknen zu verhindern und legen Sie das Tier auf dem Heizkissen, um Unterkühlung zu verhindern. </li><li> Aufbereiten von tierischen <ol><li> Überprüfen Sie das Tier für die ordnungsgemäße chirurgische Ebene der Anästhesie durch Verwendung des toe Prise Antwort. </li><li> Sobald das Tier chirurgischen Narkosetiefe erreicht hat, und klemmen die Haare auf der Rückenoberfläche um Mittellinie des Tieres mit einem elektrischen Haarschneider. Scheuern die Operationsstelle mit 70% Ethanol, gefolgt von Betadin-Lösung dreimal. Decken Sie die Website mit einem sterilen Operationstuch bis zum nächsten Schritt. </li></ol></li><li> Chirurgisches Verfahren, um dünne Knochen um das Rückenmark freizulegen <ol><li> Platzieren Sie die Maus in Bauchlage über die homeothermic Heizkissen auf der chirurgischen Plattform (Abbildung 1A). Die Maus richtig zu sichernHaltung mit einem Schnauzen Klemme einen länglichen Halsbereich (1A, B) zu halten. </li><li> Einen Einschnitt (etwa 1 cm Länge) unter Verwendung von chirurgischen Scheren entlang der dorsalen Mittellinie, die sich von der Brustwirbel T9 bis T12. Abnehmen der Haut, OP-Bereich freizulegen. </li><li> Mit einem Skalpell vorsichtig deaktivieren Sie das Muskel, um die Rückenstacheln bei T9 aussetzen - T12 Wirbel. Blutungen stoppen in jedem Schritt durch leichten Druck mit sterilen Wattestäbchen. Separate T10 - T12 Wirbel von der umgebenden Muskeln und sichern Sie diese mit Hilfe eines Wirbelklemme zu stabilisieren und jede Bewegung verhindert wird (Abbildung 1A, B). </li><li> Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsbohrer mit Knochen Polieren Bohrer, vorsichtig und sanft dünne der dorsalen Oberfläche des T10 oder T11 Wirbels der hinteren Rückenader und andere kleine Schiffe auf der dorsalen Oberfläche des SC (1C) zu visualisieren. </li><li> Zu thermischen Schäden aufgrund von Wärme während der Ausdünnung Prozedur erzeugt verhindern,eine milde und konstanten Strom von normaler Kochsalzlösung mit konstanter Saugleistung, um die Trümmer zu entfernen. </li><li> Mit einem Skalpell vorsichtig glatt die Knochenoberfläche, bis der Hauptbehälter ist deutlich sichtbar. Darauf achten, dass das Rückenmark bei diesem Vorgang beschädigt werden. </li><li> Sobald das Blutgefäß visualisiert verabreichen RB bei einer Dosis von 30 mg / kg (Körpergewicht) durch retro-orbitalen Sinus Route unter Verwendung einer Insulinspritze. </li><li> Messen Sie den Blutfluss mit Hilfe eines Laser-Doppler-Durchflussmesser nach 3 min folgenden RB Injektion bei Bedarf (2A, B). Pflegen Asepsis während gesamte Verfahren. </li></ol></li></ol> 3. Induktion von PT <ol><li> Legen Sie das Tier auf einem XY-Position einstellbar Stufe über einen Lab-Jack, der die Höhe justieren kann. Einstellen der Position der Maus, so dass die freigelegten Bereich T11 Rückenmark ist direkt unter dem 10X-Objektiv des FN1 Epi-Fluoreszenzmikroskop (3A). </li><li> Stellen Sie die Macht des liGHT Quelle bei 12% und bestrahlen die Region T11 mit einem Durchmesser von 0,75 mm in der Mitte des ausgedünnten Rückenmark (Anmerkung: Diese Region umfasst die hintere Rücken Vene und anderen Kapillaren) mit grünem Licht (Wellenlänge 540-580 nm, das ist durch den Filterwürfel in dem Mikroskop) durch die 10X-Objektiv für 2 min erreicht wird. Bilder aufnehmen, am Anfang und Ende des Bestrahlungs (3B, C) ​​und Aufzeichnen der Zeit des Experiments an dieser Stelle. </li><li> Messung der Blutfluss wieder für 10 min bei Bedarf, indem der Laser-Doppler-Sonde an der gleichen Position über dem Rückenmark, wie in 2.4.8 (2A, B). </li><li> Nach der Bestrahlung Prüfung für jede Blutung und wenn keiner gefunden, Annähen des Tieres gehen. Naht der oberflächliche Faszie zusammen mit den Muskeln auf der jeder Seite des Rückenmarks mit einem resorbierbaren Naht oder 4-0 Größe Seidenfaden. Achten Sie darauf, um die freiliegende SC beschädigen. Naht der Haut mit 4-0 Seidennaht. Bewerben Betadine oder Jodzu den Rändern der Haut nach dem Vernähen. </li></ol> 4. Post-Chirurgie Pflege <ol><li> Nach dem Nähen, legen Sie das Tier auf dem Heizkissen für die Wiederherstellung. Nach der Wiederherstellung überprüfen Sie die Tiere auf Anzeichen von neurologischen Defiziten durch die Beobachtung der Bewegung der beiden hinteren Extremitäten. Stellen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. </li><li> Übertragen Sie die Tiere auf den Käfig. Stellen Sie das Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. </li><li> Überprüfen Sie die Tiere in regelmäßigen Abständen. Im Falle von schweren neurologischen Defiziten, bieten die richtige Pflege wie Evakuierung von Blase, Verabreichung von Analgetika (Buprenorphin, 0,05 bis 0,1 mg / kg). Überprüfen Sie für die Dehydratisierung und verwalten normaler Kochsalzlösung subkutan in schweren Fall. Üblicherweise wird Buprenorphin (0,1 mg / kg) nach dem Vernähen zu Schmerzen im Operationsstelle zu lindern, verabreicht werden. </li><li> Wenn Tiere nicht sofortnach der Operation getötet, werden wir mit hohem Wassergehalt Ernährung auf dem Käfigboden setzen, damit die Tiere die Nahrung leicht zu erreichen. </li></ol> 5. transkardialer Perfusion, Nissl-Färbung und Immunfärbung <ol><li> Transkardial perfundieren das Tier wie zuvor 17-20 beschrieben. <ol><li> Das Tier zu betäuben, wie zuvor in dem Protokoll beschrieben und transkardial mit Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS, pH 7,4), gefolgt von eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS perfundiert. </li><li> Nach Durchblutung, entfernen Sie das Rückenmark (SC) und post-fix it in 4% PFA in PBS bei 4 ° CO / N. Übertragen Sie die Fest SC in PBS mit 30% Saccharose und halten Sie sie für 2 - 3 Tage, bis es auf den Boden der Röhre sinkt. </li><li> Verwendung eines Kryostaten geschnitten das Rückenmark in 30 &amp; mgr; m dicke Abschnitte und sie seriell auf eine Gelatine-beschichtete Glasobjektträger oder in einem 48-Well-Platte mit 0,01 M PBS. </li></ol></li><li> Nissl-Färbung: Um die Verletzungsgefahr durch PT verursacht inspizieren führen eine Nissl staining auf Rückenmarksabschnitte wie zuvor beschrieben, 17-20. <ol><li> Kurz gesagt, sammeln jeden fünften Rückenmark Scheibe auf den Glasobjektträger und Färbung mit 0,25% Kresylviolett. Nehmen Sie Bilder von den gefärbten Schnitten (Abbildung 4). </li></ol></li><li> Immunfärbung: Wie vorher mit einem schwimmenden Abschnitt Verfahren 17,18,20 beschrieben. <ol><li> Kurz gesagt, färben die Rückenmarkschnitte durch Inkubieren O / N bei 4 ° C mit Kaninchen-anti-Glia fibrilläres saures Protein (GFAP) polyklonalem Antikörper (1: 300), Kaninchen-anti-NeuN Antikörper (1: 300), und Kaninchen-anti- Iba1 Antikörper (1: 500), gefolgt von Esel-Anti-Kaninchen Alexa 568-konjugierten IgG (1: 400) Sekundärantikörper für 4 h bei RT. Bilder aufnehmen, mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 5). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In dieser Studie haben wir beschrieben, eine photothrombotic Modell SC Ischämie. Aufgrund der Fortschritte in der Gentechnik hat es eine Schwankung in der im Handel erhältlichen transgenen Mäuse, die es möglich gemacht hat, um die Auswirkungen von spezifischen Genen in das ischämische Pathophysiologie im SC beteiligt studieren. Das Ziel der Studie war es, eine reproduzierbare Mausmodell der Ischämie des Rückenmarks zu entwickeln. Hier angepasst wir eine kortikale PT Modell SCI in Mäusen zu induz...

Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) ist eine verheerende klinischen Zustand, die die sensomotorische und autonome Funktionen des SC. Patienten überleben SCI sind oft mit schwächenden Querschnittslähmung, die ihre täglichen Aktivitäten und die Lebensqualität erheblich beeinträchtigt 1 verlassen. Experimental SCI Modelle wurden zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der wissenschaftlichen Forschung, um die Pathophysiologie der SCI und die damit verbundenen neuronalen Reparaturprozesse zu verstehen. Diese Modelle wurden auch verwendet, um die Wirksamkeit von verschiedenen präklinischen experimentellen neuroprotektive Eingriffe, bei funktionellen Erholung abzielen testen. Derzeit Mehrheit der SCI-Modelle in der Praxis beschäftigen die Verwendung von physikalischen stumpfe Gewalt mechanisch stören und schädigen die SC. Diese Methoden umfassen Quetschung, Kompression, Dislokation und Durchtrennung des SC 2. Es wurde vorgeschlagen, dass nach der primären mechanischen Insult eine sekundäre Verletzungen in Form von Sätzen in Ischämie im verletzten SC<html> 3,4. Die Ätiologie der sekundären Ischämie beinhaltet umfangreiche Gewebedegeneration, parenchymale Blutungen und manchmal durch Verstopfung von Gefäßen durch Gewebsödeme 5-7. Als Folge der Sekundärverletzung die Integrität SC ist weiter beeinflusst werden Neuronen und Gliazellen stark in Funktion und Lebensfähigkeit beeinträchtigen und Apoptose die an das Wachstum in der chronischen Phase der Schädigung Infarkt führt analog zu unterziehen, um das Wachstum von ischämischen Penumbra nach Schlaganfall 8,9. Mehrere Mechanismen wie Exzitotoxizität, Produktion von freien Radikalen und Entzündungen berichtet worden, für die ischämischen Zelltod nach SCI 10,11 verantwortlich. Darüber hinaus ist SC Ischämie eine ernste Komplikation der thorakoabdominale Aortenaneurysma Reparatur Operationen, die oft zu Querschnittslähmung bei den Patienten, 12,13. Trotz dieser hohen klinischen Auswirkungen gibt sehr wenige Modelle von Rückenmark-Ischämie mit hoher Reproduzierbarkeit verfügbar. nt &quot;&gt; Photothrombosis (PT) ist ein allgemein verwendetes Verfahren für die Induktion einer fokalen Ischämie im Gehirn 14-20. Die Technik ist ziemlich nicht-invasiven, hoch reproduzierbar und ergibt eine genaue fokalen ischämischen Läsion in dem belichteten Bereich des Gehirns 17 -21. Dies wird durch die systemische Verabreichung von photoaktiven Farbstoffen wie Rose Bengal (RB) 16-20,22 oder Erythrosin B erzielt 23, gefolgt von lokalisierten Bestrahlung der Blutgefäße mit der richtigen Lichtquelle. Die Photoaktivierung des Farbstoffs bewirkt die Erzeugung von freien Radikalen, stören die Integrität des glatten vaskulären Endothel, und bewirken, daß die Plättchen zu sammeln, die anschließend bildet einen Thrombus. die Behinderung der Blutströmung durch den Thrombus führt zu einem Infarkt in der von dem Behälter 24 zugeführt Bereich. Aufgrund der Kontrolle über die Leichtigkeit Intensität und Dauer der Bestrahlung dieses Verfahren ergibt sich eine sehr gleichmäßige und reproduzierbare Infarkt. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet, um eine infarc induzierent an verschiedenen anatomischen Stellen ermöglicht räumliche (zB graue Substanz vs. weißen Substanz) Verständnis der Wirkung der Ischämie. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, eine einfache und hoch reproduzierbare Modell SC-Ischämie bei Mäusen zu entwickeln. Beschrieben wir die Prozedur eines PT-Modell SC Ischämie in Mäusen. Ergebnisse aus Histologie und Immunfärbung nachgewiesen, dass PT effektiv induzieren SC Infarkt, Neuronenverlust und reaktive Gliose.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1050">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Rose Bengal</td>
			<td style="width:233px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">330000</td>
			<td style="width:421px;">20 mg/ml in sterile saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl6/J</td>
			<td>Jackson lab</td>
			<td>664</td>
			<td>22-25g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine&#160;</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-996-06</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine&#160;</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-234-11</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Betadine solution</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC-67618-150-01</td>
			<td>10% povidone iodine topical solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal saline</td>
			<td>Abott Laboratories</td>
			<td>04930-04-10</td>
			<td>For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tears ointment&#160;</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC-0536-6550-91</td>
			<td>83% white petrolatum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Decon labs.Inc</td>
			<td>2716</td>
			<td>70% ethanol for disinfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal halide lamp</td>
			<td>EXFO, Canada</td>
			<td>X-Cite 120 PC&#160;</td>
			<td>Set power at 12%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>15000-10</td>
			<td>for minor dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors (angled to side)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>14063-011</td>
			<td>No. 3 handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard scalpel</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>for removing muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2976</td>
			<td>No. 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (curved)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11150-10</td>
			<td>for holding tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (straight)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>for holding tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holder&#160;</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>for suturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue adhesive glue</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>to adhere to edges of the cut skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monofilament polypropylene&#160;</td>
			<td>USSC Sutures</td>
			<td>VP-521</td>
			<td>Size = 4-0 (for fascia)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perma-hand silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>683G</td>
			<td>Size = 4-0 (for skin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro drill</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. Inc.</td>
			<td>RS-6300</td>
			<td>with bone polishing drill bit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser doppler flowmeter</td>
			<td>Moor Instruments</td>
			<td>moorVMS-LDF1</td>
			<td>for monitoring change in blood flow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating pad</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>21052-00</td>
			<td>to prevent hypothermia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab-Jack</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>14-673-50</td>
			<td>4x4 in plate to adjust the height of the animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y gliding stage&#160;</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>GT100</td>
			<td>for positioning the animal under microscope&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photothrombosis-induced focal ischemia as a model of spinal cord injury in mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Das Ziel dieser Studie war es, das Rückenmark Ischämie bei Mäusen mit einem PT-Modell zu erzeugen. Nach der gewünschten Knochenbereich über dem Rückenmark (T10 - T12) wurde verdünnt wurde Rose Bengal durch retro-orbitalen Sinus Weg injiziert, und Ischämie wurde von PT induziert 1A, B zeigen die Maus positioniert eine maßgeschneiderte chirurgisch. Plattform während der Operation. Die Maus wurde anstelle von einer Schnauze Klammer gehalten und zwei verstellbare wirbelKlemmen zur Stabilisierung d...

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Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Photothrombosis induzierte fokale Ischämie als ein Modell der Rückenmarksverletzungen in Mäusen

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

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