この作品は、国立衛生研究所[助成金なしでサポートされていました。 R01NS069726]と援助グラントのアメリカ心臓協会グラント【グラントありません。 13GRNT17020004] SDへ。

注：マウス（C57BL / 6J、オス）高齢者 10から12週目は、この研究で使用しました。すべての手順は、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに従って行われ、ミズーリ州制度動物実験委員会（IACUC）の大学によって承認されました。 1.手術前<ol><li>日手術のオートクレーブの前に、すべての手術器具を滅菌します。乾燥の30分（121°Cの 、15 PSI、30/30サイクル）、続いて30分間、15 psiで121°Cので楽器やオートクレーブを包みます。さらに使用するまで清潔で無菌環境で機器を配置します。 </li><li>新鮮なローズベンガル（RB）溶液（滅菌生理食塩水中の20 mg / mlの）手術の前にするたびに準備します。完全にRBを溶解し、ボルテックスチューブをアルミニウム箔19 W.ラップ管の出力電力と50/60 Hzで5分間超音波処理に続いて、さらにシュール中に使用されるまで、光から保護しますGeryの。 </li><li>滅菌生理食塩水にケタミン/キシラジンの混合物を準備します。麻酔薬混合物の最終容量1mlを作るために：（100 mg / mlのストック濃度）および滅菌生理食塩水550μlのとketmaineの325μL：キシラジン125μlの（20 mg / mlのストック濃度）を追加します。 </li><li>恒温加熱パッドを事前に温めます。 </li><li>ランプ電力を安定させるために30分間、メタルハライドランプ（FN1エピ蛍光顕微鏡用の光源）を事前温め。 </li><li> 10倍対物レンズと直立FN1落射蛍光顕微鏡で視野絞りを調整することにより、レチクルを使用して1mmの直径に照明領域のサイズを調整します。 </li></ol> 2.手術手順<ol><li>ケタミンの用量でマウスを麻酔（130ミリグラム/ kgのBの重量。）およびキシラジン（10mg / kgのBとの重量）。マウスのB.重量g当り1.3、4μlのカクテルに基づきます。必要とされています。アルコール綿棒で注射部位を消毒し、内を通って麻酔薬を投与します-peritoneal（IP）ルート。動物の誘導と回復を遅らせることになる。このような血管や筋肉に麻酔薬を注入しないように注意してください。 </li><li>乾燥を防止し、低体温症を防ぐために加熱パッドの上に動物を配置するために、マウスの両眼に人工涙軟膏を適用します。 </li><li>動物の作製<ol><li>つま先のピンチ応答を使用して、適切な外科的レベルの麻酔のために動物を確認してください。 </li><li>動物が麻酔の外科的レベルに達したら、電気ヘアトリマーを使用して、動物の正中線の周りの背側表面の毛をクリップ。ベータダイン液で3回、続いて70％エタノールで手術部位を洗浄。次のステップまで、滅菌外科用ドレープを持つサイトをカバーしています。 </li></ol></li><li>薄い骨の外科的処置は、脊髄を露出させます<ol><li>手術用プラットフォーム（ 図1A）の恒温加熱パッドの上にうつ伏せにマウスを置きます。適切にマウスを確保細長いネック領域（ 図1A、B）を維持するために鼻のクランプを用いて姿勢。 </li><li> T12に胸椎T9から延びる背半ば線に沿って手術用はさみを使用して（約1センチ）の切開を行います。手術領域を露出するために皮膚を脇に移動します。 </li><li>メスを使用して、慎重にT9で背棘を公開するために筋肉をクリア - T12椎骨を。滅菌綿棒で穏やかな圧力を適用することにより、各ステップにおいて出血を止めます。別々のT10 -周辺の筋肉からT12椎骨と安定させ、任意の移動を防止するために椎骨クランプを使用して固定します（ 図1A、B）。 </li><li> T10やT11の椎骨の背側表面（ 図1C）SCの背面に脊椎静脈および他の小血管を可視化するために慎重に、ゆっくりと薄く、ドリルビット研磨骨と高速ドリルを使用します。 </li><li>間引き手順中に発生する熱による熱損傷を防止するために、破片を除去するために一定の吸引と一緒に通常の生理食塩水の穏やかで一定のストリームを適用します。 </li><li>主血管がはっきりと見えるまでメスを使用すると、慎重に骨の表面を滑らかに。このプロセスの間に、脊髄を損傷しないように注意してください。 </li><li>血管が可視化されると、インスリン注射器を用いて眼窩洞を介して経路を30mg / kg（体重）の用量でRBを投与します。 </li><li> RB注射後3分後、レーザードップラー流量計を使用して血流を測定する必要に応じて（ 図2A、B）。全体の手順の間に無菌状態を維持します。 </li></ol></li></ol> PTの3誘導<ol><li>ラボ·ジャックの高さを調整することができる上にXY位置調整可能なステージ上に動物を置きます。 T11脊髄の露出領域を直接FN1エピ蛍光顕微鏡（ 図3A）の10倍の目的の下にあるように、マウスの位置を調整します。 </li><li>李の電力を設定12％でGHTソースと（注：この領域は脊椎静脈およびその他の毛細血管を含む）、薄型化、脊髄の中央に0.75ミリメートルの直径を有するT11領域を照射する緑色光（波長540と - である、580 nmの2分間の10倍の対物レンズを介して顕微鏡でフィルターキューブ）により達成しました。照射（ 図3B、C）の最初と最後に画像を撮影し、この時点では実験の時間を記録します。 </li><li>必要であれば、2.4.8（ 図2A、B）のような脊髄上記と同じ位置に、レーザードップラープローブを配置することにより、10分間、再び血流を測定します。 </li><li>任意の出血のための照射確認後と場合いずれも、動物を縫合に進んで見つかりませんでした。吸収性縫合糸または4-0サイズの絹縫合糸を用いて、脊髄の両側の筋肉と一緒に浅筋膜を縫合。露出されたSCを傷つけないように注意してください。 4-0絹縫合糸で皮膚を縫合。ベタジンまたはヨウ素を適用します。縫合後の皮膚の縁に。 </li></ol> 4.手術後のケア<ol><li>縫合した後、回復のための加熱パッド上に動物を配置します。回収後の両方の後肢の動きを観察することによって神経学的欠損の徴候のために動物を確認してください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人動物を放置しないでください。 </li><li>ホームケージに動物を転送します。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。 </li><li>一定の間隔で動物を確認してください。重度の神経学的欠損の場合には、膀胱の避難、鎮痛薬の投与（ - 0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィン、0.05）のように適切なケアを提供しています。脱水のためにチェックし、重度の場合には、通常の生理食塩水を皮下に投与します。通常、ブプレノルフィン（0.1 mgの/ kg）は、手術部位の痛みを軽減するために縫合した後に投与されるであろう。 </li><li>動物はすぐにされていない場合動物は簡単に食べ物に到達することができますので、手術後に安楽死させ、我々は、ケージの床の上に、高含水量の食事を配置します。 </li></ol> 5. Transcardial灌流、ニッスル染色および免疫染色<ol><li>先に説明したように17-20経動物を灌流。 <ol><li>以前のプロトコルで説明したように、動物を麻酔し、経PBS中の氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）、続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）中で灌流。 </li><li>灌流後、脊髄（SC）を除去し、4°CO / NでPBS中4％PFAでそれをポストは、固定してください。 30％のショ糖を含むPBSに固定SCを転送し、2のためにそれを維持する - それはチューブの底に沈むまで3日。 </li><li>クライオスタットを使用することで、厚さ30μmの切片に脊髄を切断し、ゼラチンコートしたスライドガラス上に、または0.01 M PBSで48ウェルプレートにシリアルに配置します。 </li></ol></li><li>ニッスル染色：ニッスルstainiを行うPTによって引き起こされる損傷を検査します以前17-20に記載されているように、脊髄切片にngの。 <ol><li>簡単に説明すると、0.25％クレシルバイオレットで五回ごと脊髄ガラススライド上のスライスや汚れを収集します。染色した切片（ 図4）の画像を撮影します。 </li></ol></li><li>免疫染色：浮動セクション法17,18,20を用いて前述したように。 <ol><li>ウサギ抗のNeuN抗体（1：300）、およびウサギ抗：簡潔には、ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）ポリクローナル抗体（300 1）を用いて4℃でO / Nインキュベートすることにより脊髄切片を染色IBA1抗体（1：500）ロバ抗ウサギアレクサ568コンジュゲートのIgG（1：400）、続いて室温で4時間二次抗体。蛍光顕微鏡（ 図5）を入れて撮影します。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

本研究では、SCの虚血の光血栓モデルを説明しました。遺伝工学の進歩が可能SCにおける虚血性病態生理に関与する特定の遺伝子の影響を研究するために作られた市販のトランスジェニックマウスの急増がありました。研究の目的は、脊髄虚血の再現可能なマウスモデルを開発することでした。ここでは、マウスでSCIを誘導するために皮質PTモデルを適応しました。手術後のT11胸?...

外傷性脊髄損傷（SCI）は、SCの感覚と自律神経機能に影響を与える壊滅的な臨床症状です。 SCIを生き残った患者は、多くの場合、大幅に日常活動や生活1の品質に影響を与える対麻痺を衰弱が残されています。実験SCIモデルはSCIの病態生理と関連する神経修復プロセスを理解するために、科学的な調査で必要不可欠なツールとなっています。これらのモデルはまた、機能回復を目的とする種々の実験の神経保護的介入の前臨床効力を試験するために使用されています。現在、実際にSCIモデルの大部分は、機械的に破壊し、SCを傷つけるために物理的な鈍力の使用を採用しています。これらの方法は、SC 2の挫傷、圧縮、転位や離断を含みます。ことが示唆されている主要な機械的な損傷、負傷したSC内における虚血セットの形での二次損傷後<html> 3,4。二次虚血の原因は、大規模な組織変性、実質内出血、時には組織浮腫5-7による血管の閉塞によって含まれています。 SCの整合性がさらに影響される二次的損傷の結果として、ニューロンとグリア細胞がひどく機能および生存度が損なわれ、虚血性ペナンブラ脳卒中後の成長に類似した損傷の慢性期の間に成長を梗塞につながるアポトーシスを受けます8,9。興奮毒性、フリーラジカル生成、および炎症などのいくつかのメカニズムは、SCI 10,11次の虚血性細胞死の原因であることが報告されています。また、SCの虚血は、多くの場合、患者12,13に対麻痺を引き起こす胸腹部大動脈瘤修復手術の重篤な合併症です。このような高い臨床的影響にもかかわらず、高い再現性脊髄虚血の非常にいくつかのモデルは、現在利用可能です。 NTは&quot;&gt;光血栓（PT）は、技術が高度に再現、かなり非侵襲的である。脳14-20における局所的虚血の誘導のために一般的に使用される方法であり、脳17の露出した領域に正確な焦点虚血性病変を生成します-21。これは、ローズベンガル（RB）16-20,22又はエリスロシンBなどの光活性染料の全身投与により達成されるが、適切な光源を用いて血管の局所照射し23。色素の光活性化は、フリーラジカルの生成を引き起こします滑らかな血管内皮の完全性を破壊し、そして血小板がその後容器24によって供給される領域内の梗塞内血栓結果により血液の流れの閉塞、血栓を形成し、蓄積させる。ためには、制御を容易にします照射の強度および持続時間は、この手順は非常に均一で再現性の梗塞を生じる。また、この方法はinfarcを誘導するために使用することができます虚血の影響の空間（ 例えば 、対白質、灰白質）の理解を可能にする様々な解剖学的位置でT。 現在の研究の目的は、マウスにおけるSC虚血の簡単かつ再現性の高いモデルを開発することです。我々は、マウスにおけるSC虚血のPTモデルの手順を説明しました。組織学および免疫染色の結果から、PTが効果的にSC梗塞、神経細胞脱落と反応性神経膠症を誘発することができることを実証しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1050">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Rose Bengal</td>
			<td style="width:233px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">330000</td>
			<td style="width:421px;">20 mg/ml in sterile saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl6/J</td>
			<td>Jackson lab</td>
			<td>664</td>
			<td>22-25g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine&#160;</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-996-06</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine&#160;</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-234-11</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Betadine solution</td>
			<td>Purdue</td>
			<td>NDC-67618-150-01</td>
			<td>10% povidone iodine topical solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal saline</td>
			<td>Abott Laboratories</td>
			<td>04930-04-10</td>
			<td>For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial tears ointment&#160;</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC-0536-6550-91</td>
			<td>83% white petrolatum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Decon labs.Inc</td>
			<td>2716</td>
			<td>70% ethanol for disinfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal halide lamp</td>
			<td>EXFO, Canada</td>
			<td>X-Cite 120 PC&#160;</td>
			<td>Set power at 12%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>15000-10</td>
			<td>for minor dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors (angled to side)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>14063-011</td>
			<td>No. 3 handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard scalpel</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>for removing muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2976</td>
			<td>No. 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (curved)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11150-10</td>
			<td>for holding tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (straight)</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>for holding tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holder&#160;</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>for suturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue adhesive glue</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>to adhere to edges of the cut skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monofilament polypropylene&#160;</td>
			<td>USSC Sutures</td>
			<td>VP-521</td>
			<td>Size = 4-0 (for fascia)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perma-hand silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>683G</td>
			<td>Size = 4-0 (for skin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro drill</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. Inc.</td>
			<td>RS-6300</td>
			<td>with bone polishing drill bit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser doppler flowmeter</td>
			<td>Moor Instruments</td>
			<td>moorVMS-LDF1</td>
			<td>for monitoring change in blood flow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating pad</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>21052-00</td>
			<td>to prevent hypothermia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab-Jack</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>14-673-50</td>
			<td>4x4 in plate to adjust the height of the animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y gliding stage&#160;</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>GT100</td>
			<td>for positioning the animal under microscope&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photothrombosis-induced focal ischemia as a model of spinal cord injury in mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

本研究の目的は、PTモデルを用いて、マウスにおける脊髄虚血を生成することでした。脊髄（T10 - T12）上記骨の所望の領域の後薄くした、ローズベンガルは眼窩洞経路で注入し、虚血はPTによって誘導された、図1A、Bは内に配置マウスを示してカスタムメイドの外科。手術中のプラットフォーム。マウスは、鼻クランプにより所定位置に保持され、2つの調整可能脊椎動物は、脊髄...

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Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

マウスの脊髄損傷のモデルとしての光血栓誘発性局所虚血

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

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13.1K ビュー.  University of Missouri. Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice. 