Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da biologia tumoral sobre os mecanismos moleculares da metástase. A principal vantagem dessa técnica é que o recrutamento de células tumorais dentro de um órgão remoto pode ser quantitado. Comece usando um reagente de dissociação celular não enzimática para remover o carcinoma pulmonar de Lewis, ou LLC, de acordo com os protocolos padrão.
Transfira a solução celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros antes da centrifugação, e a centrífuga lave as pelotas duas vezes em cinco mililitros de PBS por lavagem. Após a segunda lavagem, filtre as células através de um coador de células poros de 40 micrômetros e dilua a suspensão para uma única vezes 10 para as seis células por concentração mililitro. Em seguida, carregue as células em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha calibre 29, e injete 100 microliters de células na veia traseira de cada 8 a 10 semanas de idade, C57-Black-6, rato masculino.
No ponto final experimental apropriado, use uma tesoura para remover a pele da superfície ventral de cada rato, e corte as costelas e o diafragma para expor a cavidade torácica. Use uma agulha de infusão e tubos alados de calibre 25 para lavar 15 mililitros de PBS através do ventrículo direito, e remover o coração e o timo. Agarrando a traqueia com fórceps, puxe para cima, dissecando os tecidos conjuntivos ao redor da traqueia, para colher os pulmões.
Em seguida, lave os pulmões em PBS, e desprende um lobo para visualização das células fluorescentes in situ sob um microscópio de fluorescência. Para digerir o tecido pulmonar, primeiro pique o lobo caudal com uma tesoura, e coloque os pedaços de pulmão em uma seringa de 10 mililitros. Feche a seringa com o êmbolo, e aspire cinco mililitros de solução de digestão na seringa, movendo o êmbolo para dentro e para fora do eixo da seringa até que o tecido pulmonar seja disseminado em toda a solução.
Distribua o chorume pulmonar em um tubo de 50 mililitros, e digerir o tecido em um agitador recíproco por 15 minutos a 37 graus Celsius e 150 rpm. No final da incubação, triturar o tecido restante até que as células pulmonares estejam completamente dispersas, e devolva o tubo ao agitador por mais 30 minutos. Em seguida, filtrar as células através de um filtro de poros de 40 micrômetros, e coletar as células por centrifugação.
Para analisar as células pulmonares isoladas por citometria de fluxo, resuspensar a pelota em dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por um minuto à temperatura ambiente, e coletar as células por centrifugação. Em seguida, centrifugar a pelota duas vezes em cinco mililitros de PBS fresco suplementado com 1% de gêrio bovino por lavagem. Após a segunda centrifugação, resuspenque a pelota em um mililitro de PBS fresco mais BSA, e filtre as células através de um novo filtro de poros de 40 micrômetros para quantificação das células tumorais por citometria de fluxo.
Os pulmões apresentam muitas células GFP-LLC duas horas após a injeção, com a grande maioria das células desaparecendo dos pulmões dentro de 24 horas. Observe que quaisquer manchas fluorescentes detectadas dentro do filtro vermelho devem ser excluídas da contagem celular. Para confirmar o número de GFP-LLC nos pulmões, um dos lóbulos pode ser usado para análise citométrica de fluxo como demonstrado.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que um procedimento de seção congelada é um método mais preciso para observar a localização exata das células tumorais.
