Esses métodos podem fornecer insights mecanicistas sobre citotoxicidade de células tumorais mediadas por células imunes e comportamento invasivo em um ambiente 3D. A principal vantagem dessa técnica é que este modelo de cocultura 3D esferoide não requer a transferência de esferoides para múltiplos ensaios subsequentes. Demonstrando este procedimento será Apsra Nasir, uma estudante de doutorado do nosso departamento.
Para gerar os esferoides usando técnica asséptica em uma capa de cultura celular adicione 500 microliters de agarose derretida em um molde de borracha de 81 microwells tomando cuidado para evitar bolhas. Quando a agarose se solidificou cuidadosamente flexionar o molde de borracha para sair as lanças agarose em poços individuais de uma placa de 12 poços. Para equilibrar os moldes adicione 2,5 mililitros de cultura celular meio suplementado com soro bovino 10% fetal em cada poço e coloque a placa em uma incubadora de cultura celular por uma hora.
No final da incubação inclinar a placa para remover o meio de cultura celular no ambiente em primeiro lugar, em seguida, na câmara de semeadura e cuidadosamente semeado 190 microliters do preparado para a suspensão de células tumorais dropwise em cada câmara de semeadura celular. Após uma incubação de 15 minutos na incubadora de cultura celular adicione a 2,5 mililitros de médio a fora do gesso e devolva a placa à incubadora por 48 horas. Para configurar uma co-cultura de células T resuspenque o número apropriado de células T em 190 microliters de cultura inapropriada de células T, médio por poço até os 12 poços para permitir a remoção do meio de cultura celular em torno do elenco agarose primeiro.
Em seguida, na câmara de semeadura, sem remover os esferoides use um microscópio leve para verificar se algum esferoides foi aspirado e segurando a pipeta carregada P200 cerca de meio centímetro acima de cada fundamento cuidadosamente semeado as células T nos moldes de forma dropwise sem desalojar os spheroids. Quando todos os moldes foram semeados cuidadosamente devolvido a placa para a incubadora de cultura celular por 15 minutos antes de adicionar meio de cultura celular fresca complementado com soro bovino fetal para o exterior de cada gesso para outra incubação de 48 horas. Para incorporar as co-culturas 3D no colágeno diluído tipo um colágeno com meio base livre de soro para uma concentração final de trabalho de três miligramas por mililitro e adicionar 11 microliters de 10X PBS, adicione 1,2 microliters de um hidróxido de sódio molar por 100 microliters de colágeno.
Depois de neutralizar a solução de colágeno no gelo por uma hora, remova o meio de cultura celular ao redor e dentro de cada gesso como demonstrado. Adicione cuidadosamente o colágeno neutralizado uma mistura a cada molde de forma dropwise, e imediatamente devolveu a placa à incubadora de cultura celular por cinco minutos antes de inverter a placa por mais uma hora na incubação. No final da incubação coloque a placa do lado direito para cima no capô de biossegurança e adicione lentamente um meio de cultura celular fresco ao lado de cada poço.
Em seguida, devolva a placa à incubadora de cultura celular por 48 horas. Para a coloração imunofluorescente das co-culturas 3D incorporadas fixar cada elenco inteiro de agarose, incluindo os esferoides em 5,4% formalina durante a noite em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. No dia seguinte, remova a formalina em torno do molde de agarose e use pinças de ponta elegantes para agarrar o canto de cada matriz de colágeno para permitir que os moldes sejam descascados das câmaras de semeadura em um único movimento fluido.
Coloque cada patch de colágeno em um único poço de um slide de câmara de oito poços e adicione 250 microliters de 0,5% octoxynol todos a cada poço. Após uma hora em temperatura ambiente substitua o octoxynol por 250 microliters de solução de bloqueio. Depois de uma hora à temperatura ambiente adicione 250 microliters do coquetel de anticorpos primário de interesse a cada poço e coloque um slide em uma câmara escura umidificada durante a noite à temperatura ambiente.
Na manhã seguinte, remova o anticorpo primário de cada poço e lave os poços três vezes com 300 microliters de amortecedor IF por cinco minutos à temperatura ambiente por lavagem. Após a última lavagem, adicione 250 microliters de solução de anticorpos secundários inadequados a cada poço para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação remova o anticorpo e lave cada amostra três vezes com o buffer IF como demonstrado.
Após a última lavagem enxágue as amostras com 300 microliters de PBS por poço e remova cuidadosamente as paredes do escorregador da câmara. De modo que apenas o deslizamento de vidro na parte inferior permanece. Adicione 200 microliters de meio de montagem ao slide de vidro e solte cuidadosamente o deslizamento da tampa na amostra sem criar bolhas e, em seguida, armazene as amostras montadas em um lugar seco escuro durante a noite antes da imagem por microscopia de fluorescência confocal Aqui configurações experimentais típicas para os ensaios e produzem amostras representativas e analisáveis no final do experimento para cada protocolo podem ser observadas.
Incorporar a cultura 3D no colágeno tipo um dentro dos micro poços de um molde de agarose permite o monitoramento e análise da invasão por imagem J.In essa análise de duas linhas primárias de células cancerígenas do pâncreas diferentes formas e comportamentos invasivos foram observadas. A primeira linha celular um demonstrou uma formação mais compacta de esferoides e uma invasão espetada semelhante à observada para invasões de células únicas. Enquanto a segunda linha celular formava esferoides mais soltos e demonstrava um padrão de invasão coletiva.
A co-cultura pode ser realizada com duas diferentes linhas de células clonais tumorais semeadas ao mesmo tempo ou com tumores e células T após a formação de esferoides tumorais ou avaliações subsequentes de interação tumoral de células T. Para uma avaliação detalhada do comportamento invasivo, a coloração imunofluorescente e a imagem con focal podem ser realizadas de forma de alto rendimento. O elenco de agarose permite a incorporação de todo o sistema de cultura 3D em parafina para seção serial e coloração imunohistoquímica para quantificar a relação espacial entre tumor e células T.
Por exemplo, a infiltração de células T pode ser identificada e caracterizada pela coloração do marcador de superfície celular. Esta técnica permite a análise de amostras de pacientes, bem como o uso de drogas estimulantes e de bloqueio para sondar interações células T-células tumorais.
