Name: caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
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. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Ciências Naturais e Council of Canada Kim Gilbert Pesquisa de Engenharia detém uma bolsa de estudo de Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Os animais são tratados em conformidade com as regulamentações do Comitê Animal Care o local, de acordo com as orientações do Canadian Council on Animal Care. Os ratos são alojados individualmente, sob condições constantes (temperatura de 21-22 ºC e umidade de 40-50%), incluindo um 12 hr ciclo escuro-claro, com início às 08h00. Pelotas de comida e água da torneira estão disponíveis ad libitum durante todo o estudo. Um período de aclimatação de 3 dias após a entrega pelo fornecedor é permitido antes do experimento. Ratos machos Sprague-Dawley pesando entre 300-800 g foram rotineiramente usado com este protocolo. 1. Cirurgia MI <ol><li> Induzir anestesia com injecções intraperitoneais de cetamina 60 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg. Confirme anesthetization adequada por ausência de reflexo quando as patas são trilhados. </li><li> Raspar sítio cirúrgico. Intubate rato com tubo endotraqueal: cateter (16G 1,77 polegadas) e colocá animal em decúbito lateral. Colocar os animais numa almofada de aquecimento para manter a temperatura de cerca de 37 ° C. Conecte o tubo endotraqueal ao isoflurano a 2%. </li><li> Prepare sítio cirúrgico com gluconato de clorexidina e álcool isopropílico. Durante a cirurgia, usar luvas estéreis e instrumentos esterilizados. Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos para prevenir a secura e sob anestesia. Coloque campo estéril em animais e os instrumentos no outro campo estéril ao lado do animal. </li><li> Inciso pele com lâmina de bisturi nº 10. Descolar o tecido muscular com uma pinça hemostática. Colocar o animal em decúbito ventral. Abrir parede torácica com uma pinça e posição afastador peito hemostático. Abrir pericárdio com uma pinça hemostática. </li><li> Para produzir a oclusão coronária, um circuito de 360 ​​mm de comprimento de sutura de seda 4-0 à volta da artéria coronária descendente, passando através do tecido do miocárdio contígua. Insira ambas as extremidades do fio de sutura de seda num 14G, 1,25 cm longo tubo de plástico. </li><li> Puxar ambas as extremidades da sutura de seda e push do tubo para baixo contra a artéria para ocluir-lo, por 40 min. Oclusão seguro por aperto o tubo de plástico com uma pinça hemostática. </li><li> Após 40 min, a oclusão por libertar a abertura da pinça hemostática, seguido por remoção do tubo flexível e sutura de seda. Nota: ratos controle Sham submetidas ao mesmo procedimento cirúrgico menos a oclusão da artéria coronária. </li><li> Antes de fechar a parede torácica, colocar um cateter flexível (18 g, 4,5 cm) através da cavidade torácica a extrair o ar para fora do tórax com uma seringa de 5 ml para evitar pneumotórax. </li><li> Fechar tórax cavidade com sutura 2-0, ponto do músculo com fio de seda 4-0 ea pele com sutura de seda 3-0. </li><li> Antes de fechar o último ponto da pele, de novo aspirar o ar para fora do tórax com 5 ml da seringa através do cateter colocado previamente na cavidade do tórax. </li><li> Suturar último ponto da pele. Pare de ventilação isoflurano. </li><li> Monitorar despertar rato. Não deixe um animal sem supervisão até que ele tem Regained consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Tratar de rato a cada 8 horas durante 24 h com um analgésico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip) e com um antibiótico (uma única dose de duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Após a cirurgia, os ratos de casas individualmente até à hora de sacrifício, ou seja, 3 dias de pós-MI. </li><li> Tamanho do enfarte, necrose, principalmente, é expressa como a percentagem de tecido enfartado em a área em risco de o ventrículo esquerdo. Isto pode medido usando coloração 11 trifeniltetrazólio. </li></ol> 2. Amygdala Isolamento <ol><li> Coloque a cabeça de animal pela primeira vez em um saco em forma de cone, com o nariz saliente da abertura extremidade mais estreita. Rato seguro para evitar qualquer movimento. Posicione sua cabeça de forma adequada na guilhotina, entre as lâminas da tesoura. Decapitar animal. </li><li> Coloque a cabeça do rato em um prato mantidos em gelo picado. Efectuar todos os procedimentos para o isolamento do tecido em gelo picado (4 ° C). </li><li> Sk aberta Corteull com uma tesoura, retire cuidadosamente bainhas ósseas com fórceps osso, puxando para cima e evitando mutilando o tecido embaixo. </li><li> Colocar a lâmina achatada de uma espátula entre a parte inferior do crânio e a superfície ventral posterior do cérebro e cuidadosamente separar cérebro do crânio empurrando cuidadosamente a lâmina para a frente ao longo da parte inferior do crânio até ao cérebro pode ser levantada lentamente para fora do crânio. Descarte o crânio. </li><li> Coloque cérebro em sua superfície dorsal. Identificar hipotálamo (estrutura em frente do cerebelo) e cortar o cérebro coronalmente em frente da sua extremidade anterior e por trás da sua extremidade posterior; descartar as anterior e posterior partes do cérebro se não for necessário para outros usos. </li><li> Visualize as amígdalas como pequenas esferas debaixo dos lobos temporais, bilateralmente, mesmo ao lado do hipotálamo. </li><li> Virar o plano cerebral em sua extremidade frontal, superfície dorsal longe do experimentador. </li><li> Comece com o lado esquerdo ou direito do cérebro. Separe o hemiesferas e, em seguida, o córtex da amígdala contígua. Cortar caminho de cerca de 8 mm desta córtex solto para permitir o isolamento da amígdala. Cortar amígdala com bisturi. </li><li> Isolar a parte basolateral da amígdala de sua parte centromedial cortando ao longo da sutura escuro que atravessa-lo, quase meio a meio. Esta estrutura nem sempre é facilmente identificável. </li><li> Coloque subparts amígdala em frascos separados e identificados manter em gelo picado. </li><li> Procedimento de dissecção Repita com o outro hemisfério. </li><li> Mergulhe frascos em azoto líquido durante 1 min. Manter frasco em freezer -80 ° C até serem necessárias. </li></ol> 3. Actividade de Caspase-3 <ol><li> Preparar tampão de lise com 0,32 M de sacarose, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de ácido etilenodiaminotetra-acético, 2 mM de ditiotreitol, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 10 ug / mL de leupeptina , 10 ug / mL de pepstatina A e 10 ug / mL de aprotinina. </li><li>Adicionar 150 ul de tampão de lise a cada amostra (5-10 mg). Manter em gelo. Sonicar cada amostra em gelo durante 5 segundos a intensidade máxima (40 W). Incubar o tecido em tampão de lise em gelo durante 30 min. Vortex cada amostra durante 5 minutos. </li><li> Realizar 3 ciclos de congelamento / descongelamento, colocando alternadamente amostras em azoto líquido e numa placa de aquecimento controlado termostaticamente ajustado a 37 ° C. Centrifugar o tecido a 13.000 g (4 ° C) durante 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante e manter em tubo em gelo. </li><li> Prepare a concentrações de proteína padrão entre 0 e 10 ug / ml, com albumina de soro bovino. Prepare espaços em branco, com apenas tampão. </li><li> Adicionar 200 ul de reagente de Bradford a cada padrão. Leia padrão a 595 nm. Para níveis de proteína, adicionam-se 5 ul de amostra de sobrenadante a 795 ul de água destilada e 200 ul de reagente de Bradford. Leia cada amostra a 595 nm e quantificar a proteína com curva padrão. </li><li> Preparar tampão de reacção com 50 mM de Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM de ácido tetra-acético de etileno glicol, 0,1% de 3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulf onato e 1 mM de ditiotreitol. </li><li> Adicionam-se 25 ug de proteína para tampão de reacção e substratos de caspase-3 para obter amostras reactivas positivos e negativos. Para as amostras negativas, adicionar tampão de reacção, 25 ug de proteína, 0,4 ul de Ac-DEVD-CHO 800 uM e 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Para amostras positivas, adicionar 25 mg de proteína para tampão de reacção e 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Processar todas as amostras negativas e positivas em triplicado. Completar o volume final de cada amostra até 200 mL por adição de tampão de reacção. </li><li> Produção de controlos negativos pela adição de 188,7 ul de tampão de reacção de 0,5 ul de Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM e 10 ul de tampão de lise. Para os controlos positivos, adicionar 189,2 ul de tampão de reacção, 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM e 10 ul de tampão de lise. </li><li> Incubar as amostras econtroles no escuro durante 3 horas a 37 o C. </li><li> Parar a reacção com 600 ul de glicina 0,4 M e NaOH a 0,4 M (pH 10) em cada amostra e controlo. </li><li> Quantificar fluorescência por espectrofluorometria no comprimento de onda de excitação de 365 nm de comprimento de onda e emissão de 465 nm. Adicionar 2 ml de água destilada a reacção na cuvete de vidro. Leia controles e amostras de 10 segundos com um ponto em cada segundo. </li><li> Quantificar a actividade específica de cada amostra: ((fluorescência de amostras negativas menos fluorescência de amostras positivas) x volume de 2,8 ml) dividido por (tempo de incubação de 3 h x quantidade de proteína de 25 mg). </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Nossa experiência com este protocolo durante os últimos 10 anos levou à identificação de questões metodológicas críticas. Em primeiro lugar, dissecção rápido do cérebro em uma placa de Petri sobre gelo moído é importante para manter a qualidade da preparação. Em segundo lugar, deve-se perceber que a ultra-sons de tecido é mais curto para a amígdala cerebral em comparação com outros tipos de tecidos, tais como o coração (10 seg) ou rins (20 sec). Em terceiro lugar, deve ser tomado muito cuidado para misturar cuidadosamente o substrato antes de adicionar as amostras. Encontramos sinais variáveis ​​quando a sequência de mistura foi inadequada. Em quarto lugar, não há bolhas deve estar presente na célula de quartzo, quando da leitura das amostras. Caso contrário, o sinal pode ser alterada. Nós fizemos uma mudança nos últimos anos para aumentar a reprodutibilidade dos resultados: aumento do volume do substrato a fim de evitar o volume inferior a 1 mL. Ainda, pequenas variações podem ocorrer entre ensaios sucessivos, e, pelo menos, 3 amostras de controlo devem ser usadas parade controlo para variações. Medidas de fluorescência destes controlos são calculados e a média é estabelecida em 100%. Medidas de fluorescência em amostras experimentais são transformados em percentagem das amostras de controlo. Outra limitação da técnica é que apenas uma parte do tecido é utilizado e, por conseguinte, a actividade da caspase-3 pode ser subestimada. Com efeito, a janela de tempo de apoptose é curto em qualquer dada célula e pode ser dispensada, mesmo que ocorre em áreas vizinhas na altura da amostragem 1,4,15. O inverso é também possível: a apoptose pode ser particularmente intenso em porções de tecido, resultando em sobreavaliação da actividade da caspase-3. Recomendamos a utilização de tecidos remanescentes (amígdala) para técnicas complementares, tais como ensaios de TUNEL ou razão Bax / Bcl2 (ver Introdução). Espectrofluorometria tem pelo menos duas vantagens sobre Western blotting. Em primeiro lugar, diretamente gera dados quantitativos. Em segundo lugar, mede um enzimáticaem si, em vez de expressão da proteína ou RNA, que podem ser independentes, e sabe-se que a expressão da proteína pode ser aumentada sem qualquer alteração na actividade enzimática ctividades. Além disso, espectrofluorometria pode ser realizado em outros tecidos ou com diferentes espécies de animais e podem ser ajustados para outros subtipos de caspase, com diferentes substratos, de modo que as comparações de segurança pode ser feita. Em conclusão, este documento demonstra o uso de espectrofluorometria para medir a actividade da caspase-3 na amígdala, fornecendo a evidência de que a apoptose ocorre nesta região do sistema límbico 3 dias depois do MI.

As caspases ou proteases de aspartato dirigida-cisteína-dependentes são uma família de enzimas que estão envolvidas em vários homeostase processess 1. Caspases podem ser classificados de acordo com seus papéis na apoptose ou inflamação. A caspase-1, -4, -5 e -12 estão envolvidos na inflamação enquanto que aqueles envolvidos na apoptose pode ser sub-classificados como caspases iniciadoras (caspase-8 e -9) e caspases executoras (caspase-3, -6 e -7 ). As caspases desempenham papéis importantes em muitas patologias, principalmente em desordens nas quais a apoptose pode ser excessivo, como observado após enfarte do miocárdio (MI) ou isquemia cerebral. No modelo de rato da síndrome pós-MI utilizado no nosso laboratório, ficou estabelecido que a caspase-3 é activado, não só no miocárdio 2, mas também no sistema límbico, que está implicada no controlo do humor e emoções 3-6. Veja-se também que a caspase-3 é activado em diferentes regiõesdo sistema límbico, tal como a amígdala e o hipocampo, e esta activação picos em torno de 3 dias após o insulto isquémico 4. Curiosamente, a caspase-3 atividade está correlacionada com pós-MI deficiências comportamentais, e sua atenuação por meio de intervenções farmacológicas e nutricionais reduz essas lesões, o que sugere uma possível ligação entre caspase-3 e depressão pós-MI 7-12. A caspase-3 de activação pode ser medida por várias técnicas. Western blotting verifica as propriedades enzimáticas dos caspases e pode detectar enzimas activas, bem como as suas formas de pró-enzima. Western blotting, no entanto, é semi-quantitativa, e pequenas variações podem ser perdida através fracos sinal-ruído rácios 13. Uma melhor técnica baseia-se na clivagem de um substrato (DEVD-AMC), através da caspase-3 que liberta um composto fluorogénico e podem ser medidos por espectrofluorometria. Caspase-3 é um marcador de activação é confiável de apoptose. Medição da apoptose CAn ser instável porque a janela de tempo de ocorrência é curto, e as células vizinhas poderia fagocitar corpos apoptóticos ou células 14. A apoptose pode ser ainda confirmada por outras técnicas, tais como a desoxinucleotidil transferase terminal dUTP nick end rotulagem (TUNEL) ensaio, que detecta a fragmentação de ADN resultante de cascatas de sinalização de apoptose, 6 ou a proporção de proteínas pró / anti-apoptótica, tal como a Bax / Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

O infarto do miocárdio (MI) tem de médio e longo prazo consequências dramáticas nos níveis fisiológicos e comportamentais, mas os mecanismos envolvidos ainda não estão claros. Nosso laboratório desenvolveu um modelo de rato da síndrome pós-MI que exibe funções prejudicadas cardíacas, perda neuronal no sistema límbico, déficits cognitivos e comportamentais sinais de depressão. No nível neuronal, ativação da caspase-3 medeia pós-MI apoptose em diferentes regiões límbicas, como a amígdala - atingindo um máximo de 3 dias pós-MI. Alterações cognitivas e comportamentais aparecem 2-3 semanas pós-MI e estes correlacionar estatisticamente com medidas de caspase-3 atividade. O protocolo aqui descrito é utilizado para induzir MI, coletar tecido amígdala e medir caspase-3 atividade usando espectrofluorometria. Para induzir a MI, a artéria coronária descendente é obstruída durante 40 minutos. O protocolo para a avaliação da activação da caspase-3 começa depois de 3 dias MI: os ratos são sacrificados e a amígdala isolado rapiDLY a partir do cérebro. As amostras são rapidamente congeladas em azoto líquido e mantido a -80 ° C até à análise real. A técnica utilizada para avaliar a activação de caspase-3 baseia-se na clivagem de um substrato (DEVD-AMC) por caspase-3, o qual liberta um composto fluorogénico que pode ser medido por espectrofluorometria. A metodologia é quantitativo e reprodutível, mas o equipamento necessário é caro e o procedimento para quantificar as amostras é demorado. Esta técnica pode ser aplicada a outros tecidos, tais como o coração e os rins. DEVD-AMC pode ser substituído por outros substratos para medir a actividade de outras caspases.

A amígdala foi isolado em 8 simulada (controlo) e 8 mi ratos três dias após a indução do protocolo de isquemia / reperfusão. A caspase-3 foi medida a actividade neste tecido usando um fluorocromo que pode ser clivada pela caspase-3 activa e detectado por espectrofluorometria. Medidas positivas e negativas (ver passos 3.11, 3.12 e 3.16) foram realizadas em triplicado e medido durante 10 segundos, com um ponto em cada segundo. As diferenças entre os controlos positivos e negativos foram calculadas e a média das diferenças para todo o tecido simulado realizada durante esta experiência foi fixada em 100%. Os resultados de ratos MI foram dimensionados de acordo com esta referência e A Figura 1 ilustra os resultados finais: indica uma actividade significativamente mais elevada nos ratos MI em comparação com sham (p &lt;0,05). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Figura 1. A caspase-3actividade na amígdala de ratos MI, expressa como percentagem de actividade significativo em controlos simulados, definida como 100% (8 ratos por grupo). * Indica diferença significativa entre os grupos (p &lt;0,05). Os dados são expressos como média ± SEM.

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Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspase-3 Atividade no Rat Amygdala Medido pelo espectrofluorometria Após Infarto do Miocárdio

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K visualizações.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

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Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos

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Medicina

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Medindo a atividade da caspase usando um ensaio fluorométrico ou citometria de fluxo

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Bioquímica

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

Quantificação histológico de miocárdio crônico infarto em ratos

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Um modelo de roedor isquêmico de pericárdio intacto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Coloração por imunofluorescência para estudar a morte celular em modelos de AVC MCAO de rato

Evaluating Cell Death Signaling by Immunofluorescence in a Rat Model of Ischemic Stroke

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery (MCA). Current pharmacological approaches for the treatment of ischemic stroke are limited; therefore, novel therapies providing effective neuroprotection against ischemic injury following stroke are urgently needed. In the brain tissue following ischemic stroke, the area of the ischemic penumbra is salvageable but at risk of progressing to irreversible damage. The penumbral area surrounding the infarcted core is a conceptual target for neuroprotection. Since the blood flow is partially maintained in the penumbral area, neuronal and non-neuronal cells in this area transiently survive after stroke, and these cells that are still viable may be rescued by appropriate medical interventions. Understanding the pathophysiology of the penumbra is important in the development of neuroprotective therapies because the cell death pathways activated in the ischemic penumbra may indicate therapeutic targets, such as RUNX1 and cathepsins. These protein targets functioning as mediators of programmed cell death can be further exploited in translational research. With moderate size and similarity to the human brain, the in vivo rat model of MCA occlusion (MCAO) mimics the human ischemic stroke and offers an applicable tool to investigate the penumbral pathology, examine the cell death signaling, and evaluate the effects of potential targets in the context of MCAO. Here, we describe how to induce MCAO in rats and how to perform immunofluorescence staining for the detection of cell death signaling in the rat brain following MCAO.

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação da sinalização de morte celular por imunofluorescência em um modelo de rato de AVC isquêmico

Rat in vivo models are indispensable tools to investigate the pathological mechanisms and therapeutic targets for ischemic stroke. This work will describe performing immunofluorescence staining in infarcted brain slices following middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats.

Avaliação da sinalização de morte celular por imunofluorescência em um modelo de rato de AVC isquêmico

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery ...

Caspase-3 Atividade no Rat Amygdala Medido pelo espectrofluorometria Após Infarto do Miocárdio

Resumo

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Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos

Medindo a atividade da caspase usando um ensaio fluorométrico ou citometria de fluxo

Quantificação histológico de miocárdio crônico infarto em ratos

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Um modelo de roedor isquêmico de pericárdio intacto

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Avaliação da sinalização de morte celular por imunofluorescência em um modelo de rato de AVC isquêmico

Avaliação da sinalização de morte celular por imunofluorescência em um modelo de rato de AVC isquêmico