Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Eye Institute (R01 EY12998) para FH Andrade.

1. Preparação de Buffers <ol><li> Ligue 5804R centrífuga e definir a 4 ° C. Ligue Isotemp banho de água 3006D e definida para 37 ° C. </li><li> Preparar as soluções seguintes antes de isolamento muscular: <ul><li> PBS: Dissolver tampão fosfato salino (PBS) comprimidos em água destilada (5 comprimidos / litro). Misture bem. </li><li> PBS acrescido de 10 mM EDTA: Para preparar uma solução de 100 ml, adicionar 2 ml de 500 mM EDTA a 98 ml de PBS. </li><li> Buffer de mitocôndrias 8X: 10,28 g de sacarose para uma concentração final de 0,6 M, 400 mg de ácido graxo livre-albumina sérica bovina (BSA) para uma concentração final de 0,8%, 2,08 g de HEPES para uma concentração final de 160 mM, pH para 7,4 e QS de 50 ml com água destilada. </li><li> Tampão de isolamento 1 (IB1): Adicione 200 mL de 500 mM EDTA para uma concentração final de 10 mM, 0,392 g de D-manitol para uma concentração final de 215 mM, 1,25 ml de 8X mitocôndrias tampão pH, para 7,4 e QS a 10 ml com água destilada. </li><li> Tampão de isolamento 2 (IB2): Adicionar 60 mL de 500 mM EGTA para uma concentração final de 3 mM, 0,392 g de D-manitol para uma concentração final de 215 mM, 1,25 ml de 8X mitocôndrias tampão pH, para 7,4 e QS a 10 ml com água destilada. </li><li> Tampão Experimental (EB): Adicionar 100 l de 500 mM MgCl 2 para uma concentração final de 5 mM, 0,392 g de D-manitol para uma concentração final de 215 mm, 25 mL de 2,5 mM KH 2 PO 4 para uma concentração final de 6,25 mM, 2 l de 100 mM EGTA para uma concentração final de 20 mM, 1,25 ml de tampão mitocondrial, pH de 7,4 e QS a 10 ml com água destilada. </li></ul></li></ol> 2. Isolamento muscular <ol><li> Em um balde de gelo, colocar três copos de 10 ml, moedores Potter-Elvehjem tecido e todos os outros instrumentos necessários / supplies no gelo. Tudo deve ficar gelada durante todo o experimento. </li><li> Lugar IB1 e IB2 em balde de gelo e EB em banho de água quente quando terminar. </li><li> Nos três copos 10 ml, as seguintes soluções devem ser adicionadas: <ul><li> Copo 1: 10 ml de PBS </li><li> Copo 2: 10 ml de PBS / EDTA </li><li> Copo de 3: 3 ml de IB1 </li></ul></li><li> Matar um rato humanamente aprovado pelo seu Animal Care locais Institucional e Comitê de uso. </li><li> Isolar rapidamente 250-500 mg de músculo esquelético, lavar em uma taça, e transferir para Beaker 2. </li></ol> 3. Homogeneização / isolamento mitocondrial <ol><li> Transferência de músculo para copo de 3 e finamente picada do músculo com uma tesoura. </li><li> Transferir a solução para o homogeneizador Potter-Elvehjem. Homogeneizar o músculo usando um pilão motorizado (uma imprensa de broca irá fazer o trabalho) 10 vezes mantendo o tubo no gelo em todos os momentos. </li><li> Transferência de homogenato de pré-refrigerados tubos de microcentrífuga 2 ml e centrifugar a 700 g por 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo pré-refrigerados. Descartar pellet. </li><li> Centrifugar o sobrenadante do 10.500 g por 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo pré-refrigerados e SN1 etiqueta (número sobrenadante 1) e tipo de músculo. </li><li> Re-suspender pellet em 500 mL de IB2. </li><li> Centrifugar a 10.500 g por 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo pré-refrigerados e SN2 etiqueta (número sobrenadante 2) e tipo de músculo. </li><li> Suspender finais mitocondrial pellet em 100 ml de IB2. </li><li> Re spin-finais suspensão mitocondrial em minifuge por alguns segundos. Se houver um pellet, transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga pré-refrigerados e descartar o pellet. </li><li> Determinar a concentração de proteína utilizando o ensaio de Bradford 8. </li></ol> 4. Calibração do eletrodo NOTA: calibração do eletrodo Completa durante o isolamento mitocondrial. <ol><li> Adicione 100 ml de água destilada para 250 ml. Mexa vigorosamente por 20 minutos para equilibrar a água com gás atmosférico. </li><li> Adicione algumas gotas de 50% KCl no eletrodo Oxygraph. </li><li> Coloque um pequeno pedaço de papel de Blue Rizla rolando em cima do eletrodo. </li><li> Coloque um pedaço de membrana PTFE em cima do papel para enrolar. </li><li> Aplicar o anel interno utilizando o aplicador de anel e, em seguida, coloque o anel externo na ranhura do eletrodo. </li><li> Conectar eletrodos e montar o resto do equipamento: base maior anel de plástico, câmara mitocondrial, e mangueiras de água. </li><li> Ligar caixas de Oxygraph e começar software Oxygraph. </li><li> Adicione a água equilibrada para a câmara mitocondrial. </li><li> Adicionar agitar bar e ligue a uma velocidade de 60. </li><li> Começar uma nova experiência. </li><li> Clique em calibrar e, em seguida, a calibração de fase líquida para Box 1. Mudança de temperatura para 37 ° C e clique em &quot;OK&quot; duas vezes. </li><li> Quando &quot;Substituir&quot; muda para &quot;OK&quot; clique nele e abrir o tanque de gás nitrogênio. </li><li> Ponta lugar conectadopara o tanque de nitrogênio na câmara e estabelecer oxigênio zero. Clique em &quot;OK&quot; quando se muda de &quot;Ignorar&quot;. </li><li> Aspirar água e adicionar 500 mL de tampão EB às câmaras mitocondrial. </li><li> Vedação de câmara com êmbolo. </li><li> Se estiver usando várias caixas, repita os passos 11-15 para calibração de Caixa 2. </li></ol> 5. A respiração mitocondrial <ol><li> Iniciar uma nova experiência; deixá-lo correr por cerca de 1 minuto para estabilizar sinal. </li><li> Adicionar o volume necessário da suspensão mitocondrial (passo 3.11) para 150 mg em cada câmara, o evento marca, e deixá-lo correr por 1 minuto. </li><li> Adicionar 10 ml de morno 250 mM/125 mM glutamato / malato para uma concentração final de 5 mM mM/2.5. Marca e deixar correr por 1 minuto. Esta é definida como estado 2. </li><li> Adicionar 7,5 mL de 10 mM ADP para uma concentração final de 150 mM, marca, e deixar correr por 30 segundos. Isto é definido como Estado 3. </li><li> Adicionar outro mL 7,5 mM ADP, de 10, marca, e deixar correr para 1,5 minutos. </li><li> Adicionar 0,5 mL de oligomicina mM frio 10 para uma concentração final de 1 mM, marca, e deixar correr por 3 minutos. Isto é definido como Estado 4. </li><li> Adicionar 1 ml de frio 0,1 mM FCCP para uma concentração final de 0,2 mM, marca, e deixar correr por 3 minutos. Isto é definido como Estado 5. </li><li> Quando terminar, final experimentar e salvar. </li><li> Adquirir taxas de respiração usando software Oxygraph. </li><li> Digite fator de normalização: se a adição de 150 mg de proteína mitocondrial, o fator de normalização será 0,15. </li><li> Calcular as taxas de respiração normalizada para os estados de respiração diferente. </li><li> Calcular a Razão de Controle Respiratório (RCR) dividindo-se 3 por Estado Estado 4. </li></ol> 6. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Mostra um representante rastreamento do consumo de oxigênio pelo músculo esquelético mitocôndrias. Após o sinal de eletrodo é estabilizado, a amostra mitocôndria é adicionado à câmara Oxygraph. Estado respiração 2 começa com adição de glutamato e malato. Adição de ADP aumenta o consumo de oxigênio, que define a respiração estado 3. ATP sintase é bloqueada pela adição de oligomicina para obter a respiração estado 4. Finalmente, FCCP é adicionado ao desacoplar respiração mitocondrial (estado 5). Tabela 1 mostra as taxas de consumo de oxigênio representante para os estados 2, 3, 4 e 5. A relação de controle respiratório (RCR) é calculado para cada experimento. RCR ≥ 4 é considerado como evidência de uma preparação de mitocôndrias viáveis. <table border="1"><tbody><tr><td> Estados </td><td> Preços normalizado </td></tr><tr><td> Estado 2 </td><td> 34,74 </td></tr><tr><td> Estado 3 </td><td> 153,40 </td></tr><tr><td> Estado 4 </td><td> 16,49 </td></tr><tr><td> Estado 5 </td><td> 143,70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9,30 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Taxas de respiração mitocondrial. Taxas de consumo Representativeoxygen do músculo esquelético mitocôndrias. Os valores são normalizados para a quantidade de mitocôndrias adicionado à câmara. A relação de controle respiratório (RCR) é determinado pela divisão do estado 3 por estado 4. Um RCR ≥ 4 representa uma preparação viável mitocôndrias.

<ol>
	<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li><li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease.">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, S96-S102 (2004).</li><li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease.">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia.">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li><li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria:+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function.">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um protocolo para isolar mitocôndrias viáveis ​​do músculo esquelético. Se o rendimento é um problema, o protocolo pode ser modificada, incubando o músculo isolado em 5 ml de tripsina EDTA/0.01 PBS/10mM% por 30 minutos em gelo. Para assegurar a digestão muscular completo com tripsina, o músculo precisa ser totalmente picada. Após a incubação de 30 minutos, a solução de tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% deve ser completamente substituído com 3 ml de isolamento tampão 1 (IB1). Além disso, ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>95% CO2 / 5% O2 mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local gas company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine 5&#x2032;-diphosphate sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A2754</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Rizla Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>890101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bradford protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>500-0006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compressed nitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local gas company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-mannitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9647</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E3889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0728</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Free fatty acid bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H7006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isotemp 3006D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Male Sprague Dawley Rats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harlan</td>
<td>300-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Malic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C1301P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oligomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygen electrode disc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>S1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygraph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygraph Plus V1.01 Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH-meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mettler Toledo</td>
<td>1225506149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3911</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8416</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potter-Elvehjem homogenizers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-414-14A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTFE (0.0125mm &#215; 25mm) membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hansatech</td>
<td>S4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SKIL 3320 drill press</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hardware store</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5016</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mitochondrial isolation from skeletal muscle

As mitocôndrias são organelas controlar a vida ea morte da célula. Eles participam nos principais reações metabólicas, sintetizar a maior parte do ATP, e regular uma série de cascatas de sinalização 2,3. Pesquisadores passadas e actuais, mitocôndrias isoladas de ratos e camundongos tecidos como fígado, cérebro e coração 4,5. Nos últimos anos, muitos pesquisadores se concentraram em estudar a função mitocondrial dos músculos esqueléticos. Aqui, descrevemos um método que temos utilizado com sucesso para o isolamento de mitocôndrias de músculo esquelético 6. Nosso procedimento requer que todos os tampões e reagentes são feitas fresco e precisa de cerca de 250-500 mg de músculo esquelético. Foram estudadas mitocôndrias isoladas de ratos e camundongos gastrocnêmio e diafragma e os músculos extra-oculares de ratos. Concentração de proteína mitocondrial é medido com o ensaio de Bradford. É importante que as amostras mitocondrial ser mantida gelada durante a preparação e que estudos funcionais ser realizada dentro de um prazo relativamente curto (~ 1 hr). Respiração mitocondrial é medida usando polarografia com um eletrodo do tipo Clark (sistema Oxygraph) a 37 ° C 7. Calibração do eletrodo de oxigênio é um passo fundamental neste protocolo e deve ser realizada diariamente. Mitocôndrias isoladas (150 mg) são adicionados a 0,5 ml de tampão experimental (EB). Estado respiração 2 começa com adição de glutamato (5mM) e malato (2,5 mM). Então, difosfato de adenosina (ADP) (150 mM) é adicionado para começar estado 3. Oligomicina (1 mM), um bloqueador sintase ATPase, é usado para estimar o estado 4. Por último, carbonil cianeto de p-[trifluoromethoxy]-fenil-hidrazona (FCCP, 0,2 mM) é adicionado à measurestate 5, ou não atrelados a respiração 6. A relação de controle respiratório (RCR), a relação entre o estado 3 para o estado 4, é calculado depois de cada experimento. Um RCR ≥ 4 é considerado como evidência de uma preparação de mitocôndrias viáveis. Em resumo, apresentamos um método para o isolamento de mitocôndrias viáveis ​​a partir de músculos esqueléticos que podem ser usadas em bioquímica (por exemplo, atividade enzimática, imunodetecção, proteômica) estudos e funcionais (respiração mitocondrial).

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Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de Scorrano<em&gt; Et al.</em&gt; (2007). O procedimento de isolamento mitocondrial requer cerca de 2 horas. A respiração mitocondrial pode ser concluído em cerca de 1 hora.

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

28.7K visualizações.  University of Kentucky. Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de Scorrano Et al. (2007). O procedimento de isolamento mitocondrial requer cerca de 2 horas. A respiração mitocondrial pode ser concluído em cerca de 1 hora.