Este trabalho foi financiado por HL094536 (BJH).

1. Isolamento de mitocôndrias de coração rato <ol><li> Para isolar mitocôndria cardíaca, anestesiar e sacrificar animais de acordo com os procedimentos aprovados pelo seu Animal Care Institucional e Comitê local de uso. </li></ol> Nota: Todos os passos do protocolo de isolamento de mitocôndrias deve ser executada em gelo. Use tampões de gelo frios e pratos pré-refrigerados de Petri, Falcon tubos e tubos Eppendorf. Os volumes indicados no protocolo são para uma amostra contendo 2 corações de rato. <ol start="2"><li> Remover os corações, colocá-los em tampão de isolamento frio Mitocôndria (300 mM de sacarose, 10 mM de Na-HEPES, 200 mM EDTA, pH 7,4) e enxaguar sangue. </li></ol> Nota: Para melhores resultados, o pH dos tampões mitocondrial deve ser ajustado com KOH e ácido acético. <ol start="3"><li> Corações lugar em uma placa de Petri frio, retire a gordura e átrios, e pique finamente com uma lâmina até obterrelativa a um produto homogéneo. </li><li> Transferir corações picados para um 50 tubo Falcon ml, adicionar 10 ml de tampão de isolamento mitocôndrias com 0,1 mg / ml de tripsina e permitir que a amostra de digerir em gelo durante 10 min. </li></ol> Nota: A tripsina durante o procedimento de isolamento aumenta o rendimento de mitocôndrias isoladas e deve ser mantido constante entre preparações mitocondriais. Recomendamos testar as funções mitocondriais em preparações isoladas é a ausência de tripsina para garantir que a enzima não interfira com a funcionalidade. <ol start="5"><li> Adicionar 10 ml de tampão de isolamento mitocôndrias com 0,1% de BSA livre de ácidos gordos e 5 mg de inibidor de tripsina (soja) e misturar por vezes invertendo o tubo várias para neutralizar a tripsina. </li></ol> Nota: tampão de isolamento Mitocôndrias podem ser preparadas com antecedência e pode ser armazenado a -20 ° C. Verificar o pH após a descongelação. Tripsina, inibidor de tripsina ou BSA deve ser umdded para o tampão de isolamento mitocôndrias no dia da experiência. <ol start="6"><li> Recuperar o tecido digerido por baixo e médio da velocidade de centrifugação durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o tecido em tampão de isolamento 8 ml mitocôndrias com 0,1% de BSA livre de ácido gordo e homogeneizar utilizando um homogeneizador Dounce motorizado com um pilão de Teflon (4-6 passagens em 1,200-14,00 rpm). Manter a amostra em gelo enquanto se homogeneíza. </li><li> Transferir homogeneizado num tubo Falcon de 15 ml e centrifugar a 800xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar os núcleos e os restos dos tecidos. </li><li> Recuperar o sobrenadante que contém as mitocôndrias em tubos de Eppendorf e centrifugar a 8000 xg durante 15 min, a 4 ° C. </li><li> Remova cuidadosamente a camada de top branco e lavar o restante mais escuro pellet contendo mitocôndrias em um tampão de isolamento ml mitocôndrias. </li><li> Centrifugar a 8000xg durante 15 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 150 ul mitocôndrias mitocondrial IsolaTampão ção. Manter em gelo mitocôndrias para ensaios posteriores. </li></ol> Nota: Para obter melhores resultados durante os ensaios funcionais, use mitocôndrias dentro de 4 horas de isolamento. <ol start="12"><li> Quantificar proteína mitocondrial utilizando o ensaio de Bradford. </li></ol> 2. Controle de Qualidade das mitocôndrias isoladas 2.1. Medição de índice de controle respiratório (RCR) <ol><li> Calibra-se o eléctrodo de oxigénio Oxytherm com água saturada de ar para estabelecer a linha máxima de oxigénio. Quando um nível estável de oxigénio é obtida adicionando 100 ul de uma solução a 10 mM preparada de fresco de hidrossulfito de sódio, para estabelecer a linha de oxigénio zero. Realizar medições a 30 ° C. </li><li> Adicionar 2 ml de Tampão de respiração Mitocôndria (125 mM KCl, 20 mM de HEPES, 3 mM de MgCl2, 400 mM de EGTA, 300 mM DTT, 5 mM de KH 2 PO 4, pH 7,2) com 1 uM rotenona à câmara Oxytherm, vedar a câmara e recor inícioding. </li><li> Quando o sinal de oxigênio é estável, adicionar 250 mg mitocôndrias e respiração basal recorde de 1 min. A respiração, neste ponto deve ser muito baixo, como as mitocôndrias são respirando sobre substratos endógenos (respiração estado 1). </li><li> Adicionar 5 mM succinato e sinal recorde de 1 min. O consumo de oxigênio deve aumentar durante a respiração Estado 2. </li><li> Induzir a respiração Estado 3, incluindo 150 ADP fiM. Neste ponto o consumo de oxigénio deve aumentar devido à síntese do ATP através da fosforilação oxidativa. Sinal de gravação até que a respiração fica mais lento, indicando ADP consumo e transição para o estado 4 da respiração. Gravar estado 4 da respiração durante pelo menos 1 min. </li><li> Adicione 1 CCCP mM e sinal recorde de 1 min. Respiração desacoplada deve ser máxima. </li></ol> Nota: O efeito da CCCP na respiração mitocondrial é dependente da dose: altas concentrações de CCCP pode inibir o consumo de oxigênio e, portanto, deve ser cuidadosamente titrated. <ol start="7"><li> Calcule a razão do controle respiratório (RCR), dividindo a taxa de consumo de oxigênio durante o Estado respiração 3 pela taxa de consumo de oxigênio durante a respiração Estado 4. A RCR alvo deve ser ≥ 4. </li></ol> 2.2. Avaliação da integridade da membrana mitocondrial (ensaio do citocromo c) <ol><li> Lave a câmara Oxytherm com etanol a 70% e água, e repetir as etapas 2.1.2 -2.1.4. </li><li> Adicione 1 mM ADP e consumo recorde de oxigênio para 1 min. </li><li> Adicionam-se 10 ^ M do citocromo c. Uma vez que o citocromo c é impermeável à intactas membranas mitocondriais, um aumento na respiração indica quebrados ou danificados membranas mitocondriais. </li></ol> 3. Medição da permeabilidade mitocondrial de abertura de poros de transição <ol><li> Configure o espectrofluorímetro para a medição de parâmetros múltiplos de abertura mtPTP. Usando o programa FelixGx, criar uma nova configuração de hardware (Quanta sta mestre constantete) que compreende a fonte de luz, um monocromador de excitação, o compartimento da amostra e dois detectores posicionados a 90 ° e 270 ° em relação ao monocromador de excitação (Figura 4). Para atingir resolução de tempo máximo, dois monocromadores de emissão (90 ° e 270 °) deve ser desativado e os filtros de emissão em 90 ° e 270 ° no compartimento de amostra habilitado no menu de configuração de hardware. Esta etapa irá remover o controle motor dos comprimentos de onda de emissão e corrigir cada monocromador em um determinado comprimento de onda. Se os monocromadores de emissão não são deficientes, cada detector ciclo entre os dois comprimentos de onda e medições duplicadas será gravado. </li><li> Criar um protocolo de aquisição novo usando o tipo multi Dye e digite os seguintes corantes: <ul><li> Fura (alto Ca + +): 340 nm de excitação, 525 nm de emissão (detector 1) </li><li> Fura (Ca + +) baixo: excitação 380 nm, 525 nm de emissão (detector 1) </li><li> JC1 (agregado): excitação 543 nm, Emissão 595 nm (detector 2) </li><li> JC1 (monómero): excitação 498 nm, emissão a 525 nm (detector 1) </li><li> Inchaço: excitação 525 nm, emissão a 525 nm (detector 1) </li></ul></li><li> Definir as fendas de excitação e de emissão a 1 nm e a temperatura de 37 ° C. </li><li> Para se obter o sinal de medida proporcional para Fura e JC-1, geram dois traços derivados: Fura (alto Ca + +) / Fura (baixo Ca + +) e JC1 (agregado) / JC1 (monómero). </li><li> Ajustar manualmente o comprimento de onda de emissão de detectores 1 e 2 a 525 nm e 595 nm, respectivamente. </li><li> Mistura-se 1 ml de Tampão de Ensaio As mitocôndrias (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM de KH 2 PO 4, 20 mM de HEPES-Tris, pH 7,2) com 1 uM rotenona, 5 mM de succinato e 800 nM Fura FF num descartável de 4 faces cuvette metacrilato. Adicionar 250 mg de amostra mitocôndrias e colocar no compartimento de amostra. Certifique-se de que o agitador magnético está ligado. </li><li> Iniciar a gravação. Após 1 min, pausar a aquisição, adicionar 500 nM JC-1 e, em seguida, reiniciar o umQUISIÇÃO. O sinal de JC-1 proporção deve aumentar, indicando absorção do corante pela mitocôndria ativa. Continuar a gravar até que o sinal de JC-1 ter atingido um patamar (em geral, dentro de 5 min). </li><li> Adicionam-se 20 ^ M de CaCl2. Um aumento instantâneo na proporção FF Fura sinal devem ser observados pelo aumento da presença de Ca 2 + na solução tampão de ensaio, seguido de uma diminuição gradual devido a mitochondrial Ca 2 + absorção. O sinal de JC-1 deve apresentar uma taxa de diminuição transitória breve indicativo de despolarização da membrana mitocondrial leve. </li><li> Espere até que Fura FF retornos de sinal relação ao nível basal, antes da adição de um outro pulso de CaCl 2 (1-1,5 min). Continue pulsando em intervalos fixos até que as mitocôndrias não pode acumular-se Ca 2 + e começar a libertar Ca2 + para o tampão de ensaio. abertura mtPTP é visualizado por um aumento concomitante no sinal de relação de Fura FF devido à libertação de Ca2 +, uma redução na relação sinal JC-1, devido ao pote membranantial colapso, e uma diminuição da dispersão de luz devido a inchaço mitocondrial (Figura 5). </li><li> Após a activação mtPTP, verificar a especificidade de Fura FF, JC-1 e sinais de inchaço, respectivamente, com 1 mM de EGTA, 1 mM de CCCP e 5 ug / ml de alameticina. </li><li> Para verificar a especificidade da abertura mtPTP, repetir os passos 3,6-3,9, na presença de 1 uM do inibidor da ciclofilina D ciclosporina A (ciclofilina D é um componente do mtPTP). Na presença de ciclosporina A, a abertura da mtPTP requer significativamente mais CaCl 2 pulsos do que as amostras de controlo (Figura 6). </li></ol> 4. Resultados representativos A Figura 2 mostra um típico controle respiratório de coração de rato isolado mitocôndrias. Estado 3 da respiração é conseguido através da adição de ADP para respiradoras mitocôndrias em succinato, e é caracterizado por um consumo de oxigénio significativamente aumentada em relação ao substrate sozinho. Depleção de ADP adicionado Estado iniciados 4 respiração, durante o qual o consumo de oxigénio diminui e é comparável às taxas obtidas antes da adição de ADP. RCR é obtida dividindo-se a taxa de consumo de oxigénio para a respiração estado 3 da respiração por esse Estado 4. O citocromo c de teste é utilizado para ensaiar a integridade da membrana mitocondrial externa: quando o citocromo c é adicionado ao respiradoras mitocôndrias em succinato e ADP, qualquer aumento adicional na respiração é observada, indicando uma intactas exteriores das membranas mitocondriais (Figura 3). Uma imagem representativa para a abertura mtPTP no coração mitocôndrias isoladas é mostrado na Figura 4. Neste caso, a abertura mtPTP foi desencadeada por adição de CaCl 2 4 pulsos (20 uM de cada) em intervalos de 1,5 min. abertura mtPTP é aparente pelo lançamento quase simultâneo de mitocondrial Ca 2 + (aumento da taxa de Fura sinal FF), colapso do mitochondpotencial de membrana rial (diminuição do sinal de JC-1 ratio) e aumento do volume mitocondrial (diminuição do sinal de inchaço). Quando a ciclosporina A é adicionado, o qual se liga ao componente de ciclofilina D mtPTP, abertura mtPTP requer 7 pulsos de CaCl 2 em vez de 4 (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma da permeabilidade mitocondrial de parâmetros múltiplos transição de protocolo de abertura de poros para o coração mitocôndrias isoladas. Coração é colhida a partir de ratinhos e mitocôndrias são isoladas através de centrifugação diferencial. A preparação mitocondrial é então avaliado qualitativamente por medição polarográfico do índice de controlo respiratório e intacto membrana mitocondrial na presença de citocromo c. Permeabilidade mitocondrial de abertura de poros de transição em mitocôndrias isoladas é desencadeada por CaC sequenciall 2 adições e é medida com um espectrofluorímetro monitorando Ca 2 + lançamento do colapso da membrana da mitocôndria, potencial e inchaço da matriz mitocondrial. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Figura 2. Medição de razão do controle respiratório (RCR) de coração mitocôndrias isoladas. O consumo de oxigénio pelas mitocôndrias de coração isolado é medida durante a respiração Estado 3 na presença de succinato e ADP, e durante a respiração Estado 4, após o consumo de ADP. A resposta das mitocôndrias isoladas de desacopladores é medido pela adição de CCCP. Números no gráfico são as taxas de consumo de oxigénio por mitocôndrias isoladas em nmol / min / mg de proteína. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Figura 3. Medida<html> mento da integridade da membrana do coração de mitocôndrias isoladas. A integridade da membrana mitocondrial é determinada por medição do consumo de oxigénio em mitocôndrias isoladas na presença de succinato e ADP e após a adição de citocromo c. Números no gráfico são as taxas de consumo de oxigénio por mitocôndrias isoladas em nmol / min / mg de proteína. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> Figura 4. Espectrofluorómetro configuração de hardware para a medição de parâmetros múltiplos de abertura mtPTP. A configuração de hardware do espectrofluorómetro inclui uma fonte de luz, um monocromador de excitação, de um compartimento de amostra e dois detectores, com comprimentos de onda de emissão de 525 nm fixos e 595 nm. Detector 1 é usado para a detecção de sinais de Fura FF alto e baixo de Ca 2 +, o monómero de JC-1, e o sinal de inchamento. Detector 2 mede o sinal de JC-1 agregado. &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; jove_content sempre &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Figura 5. Múltiplos parâmetros de medição da abertura mtPTP no coração mitocôndrias isoladas. abertura mtPTP foi desencadeada por adições sequenciais de 20 uM de CaCl2 e foi caracterizado por Ca 2 + a partir de mitocôndrias libertação potencial colapso, membrana mitocondrial e aumento de volume da matriz mitocondrial (inchaço). Extramitochondrial Ca 2 + e o potencial de membrana foi medida com os indicadores de medida proporcional Fura FF (verde traço) e JC-1 (vermelho traço). Inchaço das mitocôndrias foi medido por espalhamento de luz a gravar a 525 nm (linha preta). Especificidade de JC-1 e sinais de inchaço foi testado com um CCCP uM e 5 ug / ml de alameticina (uma toxina microbiana). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Figura 6. Multi-Parâmetro de medição da abertura mtPTP no coração mitocôndrias isoladas na presença de ciclosporina A. A ciclosporina (1 uM), aumenta o número de CaCl 2 impulsos necessários para abrir mtPTP no coração mitocôndrias isoladas.

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A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui apresentado descreve os passos necessários experimentais para avaliar a permeabilidade da abertura do poro de transição no coração mitocôndrias isoladas (Figura 1 e Figura 4): o procedimento para o isolamento de coração de rato mitocôndrias, os controles respiratórias que assegurem a sua integridade e funcionalidade, os parâmetros monitorizados durante mitocondriais mtPTP abertura e os corantes utilizados para a sua medição, a criação da instrumentação ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina (soja) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Hidrossulfito de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Citocromo c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alameticina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> A ciclosporina A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Moinho de tecidos Potter-Elvehjem com um pilão de teflon de 15 ml </td><td> Wheaton Industries </td><td></td></tr><tr><td> Agitador suspenso </td><td> Wheaton Industries </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (temperatura do eléctrodo de oxigénio controlado) </td><td> Hansatech Instruments </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 espectrofluorímetro emissão dupla </td><td> Photon Technology International, Inc. </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

A poro de transição da permeabilidade mitocondrial (mtPTP) é um canal não específico em que se forma a membrana mitocondrial interna para transportar solutos com uma massa molecular inferior a 1,5 kDa. Embora a identidade molecular definitivo do poro está ainda sob debate, proteínas tais como a ciclofilina D, e VDAC ANT contribuir para mtPTP formação. Embora a participação de abertura mtPTP na morte celular está bem estabelecido 1, acumulação de provas indica que o mtPTP serve uma função fisiológica durante mitocondrial homeostase Ca 2 + 2, bioenergética e redox sinalização 3. mtPTP abertura é desencadeada pela matriz de Ca 2 +, mas a sua actividade podem ser moduladas por vários outros factores, tais como o stress oxidativo, o esgotamento de nucleótidos de adenina, altas concentrações de Pi, a despolarização da membrana mitocondrial ou desacoplamento, e os ácidos gordos de cadeia longa 4. In vitro, mtPTP de abertura pode ser achieved por aumento da concentração de Ca + 2 no interior da matriz mitocondrial através da adição exógena de Ca 2 + (capacidade de retenção de cálcio). Quando os níveis de Ca 2 + no interior mitocôndrias atingir um determinado limite, o mtPTP abre e facilita a libertação de Ca2 +, a dissipação de força motriz de protões, colapso potencial de membrana e um aumento de volume da matriz mitocondrial (inchaço) que em última análise conduz à ruptura da membrana mitocondrial externa e perda irreversível da função organela. Descrevemos aqui um ensaio fluorométrico, que permite para uma caracterização completa de mtPTP abertura de coração de rato isolado mitocôndrias. O teste envolve a medição simultânea de 3 parâmetros mitocondriais que são alteradas quando a abertura mtPTP ocorre: mitochondrial Ca 2 + manuseamento (absorção e libertação, conforme medido por Ca 2 + a concentração no meio de ensaio), o potencial de membrana mitocondrial, e mitochovolume de ndrial. Os corantes utilizados para o Ca 2 + medida no meio de ensaio e o potencial de membrana mitocondrial são Fura FF, um impermeante de membrana, o indicador de medida proporcional que sofre uma mudança no comprimento de onda de excitação na presença de +, e JC-1, uma catiónica Ca 2, indicador de medida proporcional que forma monómeros verdes ou agregados vermelhas no potencial de membrana de baixa e alta, respectivamente. As variações de volume mitocondrial são medidos através da gravação de dispersão da luz pela suspensão mitocondrial. Desde de alta qualidade, as mitocôndrias funcionais são necessárias para o ensaio de abertura mtPTP, também descrever os passos necessários para obter intacta, coração altamente acopladas e funcional mitocôndrias isoladas.

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca mitocôndrias<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manuseamento, volume potencial de membrana mitocondrial e mitocondrial. O procedimento para a obtenção de coração e de alta qualidade funcional a mitocôndria é também descrito.

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K visualizações.  University of Washington, Seattle. Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca mitocôndrias 2 + Manuseamento, volume potencial de membrana mitocondrial e mitocondrial. O procedimento para a obtenção de coração e de alta qualidade funcional a mitocôndria é também descrito.

Vídeo: Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Preparação de coração de rato altamente acoplado mitocôndrias

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Biologia

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.