Agradecemos Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, e Ohno Rei da Escola de Medicina da Universidade de Keio para assistência técnica. Este trabalho foi parcialmente financiado por um programa de apoio à I &amp; D Systems para acelerar a utilização prática dos resultados da pesquisa em saúde, e do Programa Estrada para a Realização de Medicina Regenerativa.

1. Prepare células T humanas activadas <ol><li> Colete 10 ml de sangue total heparinizado de um doador por punção venosa. <ol><li> Obter o consentimento informado dos doadores antes da punção venosa. Punção venosa deve ser feita por pessoal qualificado e treinado. </li><li> Lidar com amostras de sangue obtidas com equipamentos esterilizados e seguintes diretrizes de biossegurança adequadas. </li></ol></li><li> Dilui-se 10 ml de sangue total heparinizado com 10 ml de D-PBS (-). </li><li> Colocar 15 ml de Ficoll solução (prémio de Ficoll-Paque) para um novo tubo cónico de 50 ml. </li><li> Camada da solução de sangue de 20 ml, preparada na etapa 1.2 para a solução de Ficoll no passo 1.3. Usando uma pipeta elétrica, deixe a solução de sangue preparada no Passo 1.2 funcionar lentamente ao longo da parede interior do tubo. Tenha cuidado para não misturar a solução de sangue e solução de Ficoll. </li><li> Centrifuga-se a 400 x g durante 30 min à TA. Defina a velocidade de desaceleração centrífuga para &quot;lento&quot;. Nota: Após a centrifugação, uma fina brancocamada surge entre uma camada de plasma leitoso superior e uma camada inferior Ficoll clara. Esta fina camada branca contém células mononucleares. </li><li> Transferir a camada de células mononucleares para um novo tubo cónico de 50 ml com uma pipeta de 1 ml. Tenha cuidado para não incluir solução Ficoll. </li><li> Adicionar D-PBS (-) para as células mononucleares a um volume total de 10 ml, e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Desprezar o sobrenadante. Adicionar 10 ml de D-PBS (-) para as células mononucleares, e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio KBM502 para as células mononucleares coletadas, e contar as células utilizando um hemocitómetro. Mais de 5 x 10 6 células mononucleares pode ser obtido a partir de 10 ml de sangue total heparinizado com separação apropriada usando Ficoll. </li><li> Prepara-se uma solução de anticorpo anti-CD3 humano a uma concentração de 10 ug / ml em D-PBS (-). Adicionar a solução de anticorpo anti-CD3 humano de uma placa de 6 poços, embeber a ressacaás de cada poço, e a incubação do prato a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 durante pelo menos 30 min. </li><li> Remover a solução de anticorpo CD3 anti-humano a partir de cada cavidade e lavar uma vez com D-PBS (-) imediatamente antes de semear as células. </li><li> Células mononucleares de semente que foram preparados no passo 1.9, a uma densidade de 2,5 x 10 5 células / cm2 sobre o anti-CD3 humana revestidas com anticorpo placas de 6 poços em meio de KBM502. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante 3-7 dias, sem mudança de meio, as células T até a confluência. As células T neste período são as duas células em suspensão e aderentes. </li></ol> 2. As células T humanas Infect com SEV Vetores <ol><li> Depois de 3-7 dias de cultura, recolher as células T ativadas com meio existente por pipetagem. Transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco KBM502. Contar as células e placa 1.5 x 10 6 células (em 2 ml de meio fresco KBM502) em cada poço de um anti-CD3 anticorpo revestidos por placa de 6 poços. </li><li> Descongele as soluções de OCT3 SEV / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, e c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF no gelo. </li><li> Adicionar as soluções contendo OCT3 Sev / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, e c-Myc (LCF) -SeV / TS15ΔF individualmente para os poços, cada um com uma multiplicidade de infecção (MOI) 10. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante mais 24 horas. </li></ol> 3. Retire Vetores SEV de células T humanas <ol><li> 24 h após a infecção, as células infectadas recolha com uma pipeta. Se houver células aderentes, eles podem facilmente ser destacado pipetando-los várias vezes para cima e para baixo. Transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante contendo os vetores SEV, e adicionar 2 ml de meio KBM502 fresco. Células replate em each dos poços. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante mais 24 horas adicionais. </li></ol> 4. RESEED células em uma camada Matrigel <ol><li> Preparar a solução matriz da membrana basal por gel matriz descongelação (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) a 4 ° C e dissolvendo 0,2 ml em 10 ml de meio DMEM / F12. Nota: gel Matrix (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) precisa descongelar O / N a 4 ° C para ser totalmente descongelado. Mantenha-o em gelo até imediatamente antes da utilização. </li><li> Placa 5 ml de solução de matriz da membrana basal por placa em placas de 100 mm e deixar à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min antes da sementeira de células. Pelo menos duas placas de 100 mm são necessários para um experimento. </li><li> Recolhe células SEV-infectados por pipetagem, transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco KBM502. Contar o número de cells usando um hemocitômetro, remova a solução de matriz da membrana basal de pratos de 100 mm preparado no passo 4.2 e placa 1 × 10 5 e 1 × 10 6 células (em 10 ml de meio mTeSR fresco) em uma de 100 mm membrana basal matriz revestido pratos. Finalmente, use a placa em que as colônias são facilmente colhidas. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora S / N. </li><li> Mude a médio e 10 ml carne médio mTeSR a cada dois dias. Nota: Aproximadamente 20-30 dias após a infecção, colônias que se assemelham células-tronco embrionárias (CES) aparecerá. </li></ol> 5. Expanda T iPSCs derivadas de células <ol><li> Preparar a solução matriz da membrana basal por gel matriz descongelação (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) a 4 ° C e dissolvendo 0,2 ml em 10 ml de meio DMEM / F12. </li><li> Placa 1 ml da solução de matriz da membrana basal por poço numa placa de 6 poços e deixar à temperatura ambiente durante amenos 30 minutos antes de escolher colônias. </li><li> Encha uma placa de 96 poços com 20 ul de meio por poço mTeSR. </li><li> Selecione colônias que se assemelham a CES sob o microscópio estereoscópico com uma pipeta de 20 mL. Nota: As colônias do CES e iPSCs são redondos e lisos como mostrado na Figura 1B. </li><li> Transferência de colónias seleccionadas para a placa de 96 poços preenchidos com meio mTeSR no passo 5.3. </li><li> Adicionar 200 ul de meio mTeSR a cada poço e cuidadosamente pipetar para cima e para baixo para quebrar a colónia em pequenos torrões, ao microscópio estereoscópico, utilizando uma pipeta de 200 uL. Remover a solução de matriz de membrana basal preparado a partir do poço de 5,2 e colocar cada colónia para um poço da membrana basal revestida de matriz de 6 poços da placa com 2 ml de meio por poço mTeSR. </li><li> Mude a médio e 2 ml carne médio mTeSR a cada dois dias. </li></ol> 6. Manter T iPSCs derivadas de células Os iPSCs derivadas de células T pode ser mantidae armazenadas usando as mesmas técnicas que para iPSCs humanos e CES humanos. Uma vez colónias IPSC crescer, expandir-los em pratos maiores, repetindo o mesmo procedimento. <ol><li> Mudar o meio mTeSR a cada 1-2 dias. </li><li> Quando as colónias tornam-se confluentes a cada 5-7 dias, a passagem das células, utilizando uma solução de dissociação para iPSCs humanos e CES humanos de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Hayes, M., Zavazava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+generate+induced+pluripotent+stem+cells.">Strategies to generate induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).</li><li>Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+making+induced+pluripotent+stem+cells:+reprogramming+a+la+carte.">Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte.</a> Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8+T+Cells.">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li><li>Sampsell-Barron, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+adaptation+and+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Minegishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+optineurin+E50K-TBK1+interaction+evokes+protein+insolubility+and+initiates+familial+primary+open-angle+glaucoma.">Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma.</a> Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).</li><li>Tanaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+induces+myofibrillar+disarray+and+contractile+vector+variability+in+hypertrophic+cardiomyopathy-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li><li>Kishino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+peripheral+T+cells+in+defined+culture+conditions.">Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions.</a> PLoS One. 9, e97397 (2014).</li><li>Masaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Sendai+virus-mediated+gene+transfer+to+vasculature:+a+new+class+of+efficient+gene+transfer+vector+to+the+vascular+system.">Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system.</a> FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).</li><li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression.">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Sendai+virus-mediated+gene+transfer+into+adult+rat+retinal+tissue:+efficient+gene+transfer+by+brief+exposure.">Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure.</a> Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions.">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612 (2012).</li><li>Iida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+vector:+vector+development+and+its+application+to+health+care+and+biotechnology.">Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology.</a> Uirusu. 57, 29-36 (2007).</li><li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+repopulation+of+cytoplasmically+gene+transferred+hematopoietic+cells+by+temperature-sensitive+mutant+of+recombinant+Sendai+viral+vector.">In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector.</a> Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).</li><li>Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+vectors+as+an+emerging+negative-strand+RNA+viral+vector+system.">Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system.</a> J Gene Med. 5, 543-553 (2003).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus.">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).</li><li>Okano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Sendai+virus+vectors+for+activated+T+lymphocytes.">Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes.</a> Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells.">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).</li><li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells.">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).</li><li>Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Episomal+Vectors.">Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors.</a> Methods Mol Biol. , (2014).</li></ol>

Os autores não têm nenhum concorrente ou interesses conflitantes para divulgar.

We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors16. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation. 
SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine16.
Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus6. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger. 
The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.
There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.

iPSCs atraíram considerável atenção como uma fonte inovadora de células para a medicina regenerativa 1-3. Até à data, diversos métodos para gerar iPSCs foram relatados 4,5. Entre estes, iPSCs gerado a partir de células T humanas têm sido de particular interesse devido ao método menos invasivo da célula de amostragem 6-8. Além disso, iPSCs derivadas de células T contêm rearranjos do gene receptor de células T (TCR) e são, portanto, uma fonte de células T específicas de antigénio 9,10. Portanto, a geração de células T derivados iPSCs é seguramente útil para avançar a medicina regenerativa. Este método baseia-se no conceito de reduzir o risco de patogenicidade imprevisível. Para aplicação clínica segura de iPSCs é importante para reduzir o risco de exposição a agentes patogénicos 11. Anteriormente em diversos sistemas de cultura de células estaminais pluripotentes, células de soro bovino fetal e de alimentação têm sido utilizados como reagente essencialS 12. No entanto, a remoção de ambos os reagentes a partir do sistema de cultura para a geração é preferível iPSC para reduzir o risco de patogenicidade imprevisível. Além disso, este método tem a vantagem de evitar amostragem invasiva de células de pacientes e laboriosa preparação de células alimentadoras. Como células T derivadas iPSCs já têm sido utilizados com sucesso na pesquisa de doenças 13,14, este método também é aplicável e útil para gerar iPSCs de doenças específicas de pacientes. Entre os métodos de reprogramação das células T, utilizando o vector de vírus Sendai (SeV) como um veículo de genes é um método que pode gerar iPSCs com alta eficiência 7,16. Além disso, porque é um SeV single-stranded RNA vírus e não necessita de uma fase para a replicação de ADN, a sua utilização na produção de iPSC evita quebrar o genoma do hospedeiro 17-19. Portanto, nós estabelecemos protocolos para gerar iPSCs de células T periférico humano no soro-free e condições de livre-de alimentação, utilizando uma combinação de matrigel, médio mTeSR, e SEV vetores.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PREMIUM</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE mouse anti-human CD3</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KBM502 medium</td>
			<td>KOHJIN BIO</td>
			<td>16025020</td>
			<td>Warm in 37 &#8451; water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin fraction V solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw completely at 4&#8451; overnight and dilute it 50 times with Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium before coating culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium kit</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>5850</td>
			<td>Warm at room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Solution</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCHETP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS(&#8211;)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0</td>
			<td>DNAVEC</td>
			<td>DV-0303c</td>
			<td>Thaw on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from human peripheral t cells using sendai virus in feeder-free conditions

Recentemente, iPSCs têm atraído a atenção como uma nova fonte de células para terapias regenerativas. Embora o método para a geração inicial iPSCs invocado fibroblastos dérmicos obtidos por biópsia invasiva e inserção genómico retroviral de transgenes, tem havido muitos esforços no sentido de evitar estas desvantagens. As células T periférico humano são uma fonte de célula exclusivo para gerar iPSCs. iPSCs derivadas de células T contêm rearranjos do receptor de células T (TCR) e os genes são uma fonte de células T específicas de antigénio. Além disso, o rearranjo receptor de células T no genoma tem o potencial para identificar linhas de células individuais e distinguir entre células transplantadas e doadores. Para aplicação clínica segura de iPSCs, é importante minimizar o risco de expor iPSCs recém-gerados a agentes nocivos. Embora as células de soro bovino fetal e de alimentação têm sido essenciais para a cultura de células estaminais pluripotentes, é preferível removê-los a partir do sistema de cultura para reduzir o riscode patogenicidade imprevisível. Para resolver isso, nós estabelecemos um protocolo para gerar iPSCs de células T periférico humano usando vírus Sendai para reduzir o risco de exposição a patógenos iPSCs indefinidos. Embora a manipulação do vírus Sendai requer equipamento com o nível de segurança biológica apropriada, Sendai vírus infecta células T activadas sem inserção do genoma, mas com elevada eficiência. Neste protocolo, demonstramos a geração de iPSCs de células T periférico humano em condições de livre-de alimentação, utilizando uma combinação de cultura de células T ativadas e vírus Sendai.

<html> Usando este protocolo, os usuários são capazes de gerar iPSCs de células T periférico humano estavelmente. geração iPSC a partir de células T com SeV e Matrigel mostrou aproximadamente 0,002% -. 0.005% de eficiência de reprogramação celular entre vários casos doadores e SeV não foram detectados após várias passagens 16 A Figura 1A mostra um esquema do protocolo para a geração de células T derivadas de iPSCs em condições de livre-feeder usando matrigel e médio mTeSR. Cerca de 20-30 dias após a infecção com SeV, colónias IPSC são reconhecidos por sua colônia ESC-como a morfologia (Figura 1B). Imunofluorescência revelou a expressão de marcadores típicos de células pluripotentes (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) em T-iPSCs derivadas de células gerada sob condições isentas de alimentação (Figura 1C). &quot;Width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 1. (A): Um esquema do protocolo de reprogramação das células T sob condições isentas de alimentação nesse estudo. (B): A ESC-como colônia típica iPSC no dia 27 após a coleta de sangue em condições de livre-de alimentação. (C): coloração ALP e imunofluorescência para marcadores de pluripotência e de superfície (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) em T-iPSCs derivadas de células geradas sob condições isentas de alimentação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions at JoVE.com

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-peripheral-t

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.9K visualizações.  Keio University School of Medicine. This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.