A engenharia genética é uma ferramenta valiosa usada para modificar genomas de organismos modelo em um processo conhecido como transgênese. Na biologia do desenvolvimento, essa abordagem é frequentemente usada para expressar genes modificados que podem ser visualizados em tecidos vivos. Alternativamente, a engenharia genética pode ser usada para prevenir ou interromper a expressão proteica para estudar a função de desenvolvimento de genes específicos.

Este vídeo vai resumir os princípios por trás dessa tecnologia, rever alguns procedimentos de engenharia genética e destacar maneiras de que essas técnicas são usadas em laboratório.

Para começar, vamos explorar alguns conceitos importantes subjacentes à transgênese. Isso envolve a inserção de DNA no genoma de um organismo modelo. Há uma série de abordagens dependendo do objetivo do estudo.

Primeiro, a adição de um gene alterado pode revelar alterações funcionais ou morfológicas devido a uma mutação. Outro método é colocar cópias adicionais do gene do tipo selvagem não beterado para estudar os efeitos da superexpressão, que muitas vezes pode ser tão prejudicial quanto uma mutação. Uma abordagem diferente é inserir uma proteína de fusão que contenha uma etiqueta visualizal, como proteína fluorescente verde, para rastrear a localização e o tempo da expressão genética em animais vivos.

O segmento de DNA que será inserido no genoma deve ser cuidadosamente projetado para produzir os padrões e resultados de expressão desejados. O promotor, que é um elemento de sequência que dita quando e onde um gene é expresso, é um componente crucial. Certos promotores são onipresentemente expressos em quase todos os tecidos, enquanto outros são ativos apenas em tecidos específicos. Promotores indutores, que são ativados pela administração química ou exposição a altas temperaturas, também podem ser usados para controlar o tempo de expressão genética.

Para ser expressado em tecidos, um transgene deve primeiro se integrar ao genoma. Para isso, transgenes podem incluir sequências de DNA de flanqueamento que correspondem a áreas do genoma do organismo. Isso permite que o transgene se integre ao DNA hospedeiro através de um processo conhecido como recombinação homologos. Alternativamente, em algumas espécies elementos especiais chamados transposons podem tornar a transgênese mais eficiente, incluindo locais de reconhecimento para a enzima transposase, que catalisa a inserção aleatória do transgêgênio no genoma.

Agora que você conhece alguns dos fundamentos do design transgênico, vamos rever como fazer um animal transgênico. Para fazer a construção transgênica, comece amplificando o gene de interesse usando PCR. Esta região amplificada é então clonada em um vetor, que é um pedaço de DNA que pode transportar o transgene para as células. Os vetores normalmente contêm elementos que permitem amplificação transgênica eficiente usando bactérias, como e. coli. Após esta etapa de amplificação, o vetor é purificado da cultura bacteriana.

Animais transgênicos são feitos injetando DNA purificado em embriões. Em peixes e sapos, as construções são geralmente injetadas diretamente na gema ou citoplasma de embriões de estágio de uma célula. Para transgênese mediada por transposon, uma transcrição codificando a enzima transposase é adicionada à mistura de injeção.

Em camundongos, a transgênese pode ser realizada pela manipulação de óvulos recém-fertilizados nos quais os pronucleis espermatozoides e óvulos ainda não se fundiram. A construção é injetada diretamente no pronucleus maior, onde pode se integrar ao genoma à medida que a célula se divide. Os óvulos devem então ser transplantados no útero de uma fêmea pseudopregnante para o desenvolvimento.

A eficiência da transgênese varia, por isso os animais devem ser rastreados para identificar a prole na qual a construção se integrou com sucesso ao genoma. Isso pode ser feito procurando uma etiqueta fluorescente que foi inserida para fácil identificação, ou através de análises moleculares como PCR de DNA genômico isolado de pequenos pedaços de tecido.

Uma segunda abordagem para a engenharia genética se concentra em segmentação genética específica para interromper a função genética. Existem várias abordagens para alcançar esse objetivo. Um método relativamente novo, conhecido como edição de genomas, aproveita enzimas específicas de sequência chamadas nucleases, que cortam a espinha dorsal do DNA e causam mutações nos genes à medida que o DNA é reparado.

Outro método de segmentação envolve o uso de recombinação homólogo para substituir um gene por DNA estranho ou uma cópia do gene ladeado por sequências de reconhecimento para enzimas conhecidas como recombinases. Quando as recombinases estiverem presentes, a sequência flanqueada será extirpada do genoma. Isso é conhecido como nocaute condicional, e o controle da excisão genética pode ser alcançado expressando a enzima em tecidos específicos ou em determinados momentos.

Vamos rever um procedimento geral para gerar ratos nocautes por recombinação homóloga. Aqui, uma construção deve ser preparada em que parte da sequência de DNA genômico é substituída por DNA estranho. Esse DNA muitas vezes codifica outro gene, como a resistência a antibióticos, que fornece uma maneira de selecionar células modificadas com sucesso em etapas posteriores.

Para iniciar o procedimento, as células-tronco embrionárias são coletadas da massa celular interna de um embrião de camundongos primitivo conhecido como blastocisto. A construção linearizada é então entregue nas células-tronco via eletroporação, na qual pulsos elétricos geram poros transitórios na membrana celular. As células são então autorizadas a incubar na presença de um antibiótico para eliminar células sem o transgene.

Após esta etapa de seleção, as células-tronco podem ser injetadas em outro embrião de rato no estágio blastocisto. Os embriões são então transferidos para o útero de uma fêmea para continuar o desenvolvimento. Os filhotes resultantes serão quimeras, que são compostas de células selvagens e eliminatórias. Algumas quimeras terão células de nocaute dentro de sua linha germinal, que transmitirá o gene interrompido quando forem criadas, o que estabelecerá uma nova linha de nocaute.

Você aprendeu o básico da engenharia genética de modelos de desenvolvimento, então agora vamos olhar para algumas aplicações práticas.

Estudos de desenvolvimento geralmente usam proteínas fluorescentes marcadas para identificar células e estudar seu desenvolvimento. Usando promotores específicos do tecido, organismos transgênicos podem ser projetados para expressar proteínas fluorescentes em células específicas, como a crista neural. Usando técnicas avançadas de imagem, as células fluorescentes podem ser imagens em tempo real, permitindo que os pesquisadores visualizem diretamente eventos complexos de desenvolvimento.

Outro importante uso da engenharia genética é estudar genes específicos e seu papel nos fenótipos da doença. Aqui, mutações direcionadas são introduzidas em um gene de rato específico usando nucleases, como TALENs. PcR mostra se o mouse tem zero, uma ou duas cópias do gene mutado. Os embriões que carregam duas cópias mutantes agora podem ser estudados em detalhes para determinar a função de desenvolvimento do gene.

Usando nocautes condicionais, os cientistas podem determinar a função de um gene dentro de um conjunto restrito de células. Aqui, um gene flanqueado loxP foi expresso em todo o embrião, mas Cre foi expressa apenas em células endoteliais, causando uma exclusão genética no coração e vasos sanguíneos. Este nocaute específico do tecido resultou em uma mudança mensurar na frequência cardíaca embrionária, e ilustra como testar o papel localizado de um gene sem alterar todo o organismo.

Você acabou de assistir a introdução da JoVE à tecnologia transgênica. Essas técnicas ajudam a entender o básico da engenharia genética, alguns dos métodos envolvidos e como ela é aplicada na ciência cotidiana. A engenharia genética pode ser amplamente aplicada em muitos organismos, e continuará a ser uma importante ferramenta para estudar e entender o papel da genética em doenças de desenvolvimento, bem como aquelas que aparecem durante a idade adulta. Obrigado por assistir!