The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).

O protocolo segue as diretrizes do cuidado com os animais institucional e uso comissão (IACUC) da Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel, uma instalação AAALAC aprovado (Request MD-12-13524-4 No.), e pelos Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request No. 3770). Os animais foram tratados de adesão estrita às diretrizes do NIH. 1. Preparação de aloenxertos de osso <ol><li> Eutanásia de 7 a 8 semanas de idade, os ratinhos Balb / C, ou qualquer outra estirpe do receptor, utilizando o método padrão de CO 2 inalação ou injecção intraperitoneal de 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Confirmar a ausência de um piscar de olhos e executar deslocamento cervical. Como alternativa, colher os enxertos de cadáveres que foram mantidos em temperatura de -20 ° C e descongeladas antes da colheita. </li><li> Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo, aplicando-o contra a direção do crescimento do cabelo. Desinfectar a cabeça da carcaça através da aplicação de 70% isopropanoeu. Corte a pele do couro cabeludo utilizando um bisturi nº 11 e remover o periósteo. </li><li> Usando uma broca de dentista e uma trefina de diâmetro interno de 4,5 mm, retirar um fragmento circular do osso calvarial. Transferir o fragmento de osso a um prato de plástico de 100 mm contendo solução salina estéril. Neste ponto, observar sangue e do tecido macio ligado ao fragmento de osso (Figura 1A). Obter fragmentos de ossos deste modo a partir 22 dadores. </li><li> Segure fragmento de um osso de cada vez, usando uma pinça curvas. Swab-lo cuidadosamente, com algodão aplicador derrubado e remover qualquer tecido cerebral, tecidos moles, e de sangue (Figura 1B). Suavemente cortar as lascas de osso que permanecem ligados ao enxerto utilizando uma tesoura fina de modo que o enxerto vai ter uma forma arredondada perfeito. </li><li> Mergulhar uma vez cada enxerto em um tubo de 15 ml contendo 70% de etanol e duas vezes em tubos de 15 ml contendo solução salina tamponada com fosfato para lavar o etanol. </li><li> Congelar os aloenxertos num -80 ° C em tubos criogénicos frigorífico durante pelomenos 1 semana. Neste ponto, certifique-se os enxertos parecem transparentes (Figura 1C). </li></ol> Cirurgia 2. calvarial Defeito <ol><li> Para usar receptores ratinhos transgénicos que expressam luciferase sob o controlo do promotor de osteocalcina 6. </li><li> Esterilizar as pontas dos instrumentos cirúrgicos usando um aquecedor de esferas de vidro durante 30 segundos. Transferir as ferramentas para um frasco contendo 70% de isopropanol para manter as condições estéreis. Use luvas estéreis. </li><li> Anestesiar uma de 7 a 8 semanas de idade, fêmea de ratinho por injecção intraperitoneal de uma mistura ketamine- medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, respectivamente). Comprima o membro animal para se certificar de que está profundamente anestesiados. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo, aplicando-a contra a direção do crescimento do cabelo. Aplique o creme de depilação para remover quaisquer vestígios de pele e limpe-after não mais do que 2 minutos utilizando uma gaze seca seguido por solução salina gaze embebida. Cuidados devem ser tomados para evitar que ele nos olhos. Alternativamente, a pomada veterinário olho pode ser aplicado antes da remoção do cabelo como uma camada extra de proteção para os olhos. É imperativo que todos os vestígios do creme depilatório ser removida, a fim de evitar uma possível irritação da exposição excessiva ao agente químico. Desinfectar o couro cabeludo pela aplicação de 5% de clorexidina (Figura 1D). </li><li> Injectar por via subcutânea de 5 mg / kg carprofeno diluída em 200 ul de solução salina. Aplicar veterinário pomada para evitar a secura e manter o animal sobre uma almofada térmica em todos os momentos. Posicione o animal sob os binóculos que operam. </li><li> Faça um corte oval de 1 cm de comprimento na pele do couro cabeludo usando tesoura fina e pinças (Figura 1E). Segure o periósteo, usando uma pinça curvas e cortar com uma tesoura fina. </li><li> Perfurar o calvarial defeito 2 milímetros anterior à sutura lambdoid usando uma broca dental umnd um trephine exterior diâmetro de 5 mm (Figura 1F e G). Para evitar a penetração da dura-máter, perfurar três quartos do caminho para o osso e retire o fragmento ósseo usando uma espátula. </li><li> Para implantar um auto-enxerto, recuperar o fragmento ósseo e lavá-lo em uma placa de plástico 10 milímetros contendo 10 ml de solução salina estéril para remover detritos. Não remova os tecidos moles. Para implantar um aloenxerto, descongelar previamente um aloenxerto e normalizar para a TA, e, em seguida, lavá-lo. </li><li> Coloque o enxerto ósseo no defeito, usando uma pinça curvas para que ele não toque nas margens do defeito (Figura 1H). Cole o enxerto ao osso hospedeiro, utilizando gel de fibrina (5 ul de 46 mg / ml de fibrinogénio misturados com 5 ul de 25 U / ml de trombina). </li><li> Suturar a pele usando 4-0 vicryl sutura (Figura 1I). Aplicar iodopovidona para o corte cirúrgico. Cuidados devem ser tomados para evitar a contaminação da sutura por pele. Marque a orelha de rato e injetar 0,25 mg / kg Antisedan to reverter o efeito anestésico da medetomidina. </li><li> Se o animal não acordar de 10 min, verifique se ele está situado em uma almofada aquecida. Injectar 200 ul de soro fisiológico estéril, e, se necessário Injectar 0,1 mg / kg Antisedan. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que totalmente recuperado. </li><li> Manter os animais em gaiolas separadas por uma semana, para evitar que as suturas de abertura. Coloque comida do mouse embebido em água em uma placa de Petri no chão da gaiola por alguns dias de pós-operatório. Injectar por via subcutânea de 200 ul / ml de solução de 1 mg carprofeno diluída em solução salina estéril, uma vez por dia durante 3 dias após a cirurgia para tratar a dor pós-cirúrgica. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53459/53459fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação de calvária aloenxerto e calvárias Defeito cirurgia. O fragmento de osso é isolado a partir da região de calvária (A). Tecido macio, Medula óssea, e sangue são esfregadas (B), e o enxerto é lavado em etanol a 70%, seguido de duas lavagens em salina tamponizada com fosfato (C, AG = aloenxerto). O mouse destinatário está preparado para a cirurgia pelo barbear e desinfecção da pele na região calvarial (D). Um corte de forma oval é criada na pele do couro cabeludo, e do periósteo é removido (E). Em seguida, o defeito de calvária é perfurado utilizando um trépano de 5 mm de diâmetro (F). O fragmento de osso é separada usando uma espátula em forma de colher, deixando o seio sagital superior intacta (L). O aloenxerto é então colocado no defeito e protegidas utilizando gel de fibrina (H). Finalmente, a pele é suturada (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53459/53459fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 3. Micro-Tomografia Computadorizada para Caracterização deÁrvore Vascular <ol><li> Preparar solução salina heparinizada. Peso 2.000 U de heparina sódica e coloque-o no tubo de 50ml de plástico. Adicionar 20 ml de solução salina e agite bem o tubo. Encha a 20 ml seringa Luer lock com 15 ml aquecido salina heparinizada e conecte a seringa a um conjunto veia do couro cabeludo 23-G. Apor a seringa a uma bomba de seringa, e configurá-lo para bombear 10 ml a 1 ml / min. </li><li> Sedar um rato utilizando uma injecção intraperitoneal de 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Comprima o membro do animal para se certificar de que está profundamente sedado. Prenda o mouse sobre a sua volta para uma placa de fixação envolvido com um revestimento de superfície absorvente (Figura 2A). Posicione o mouse fixado em um exaustor para evitar a exposição pessoal a fumaça. </li><li> Cortar a pele do abdômen ao pescoço com uma tesoura fina e pinças (Figura 2B). Corte a parede abdominal até o apêndice xifóide (Figura 2C). Corte as costelas ao longo da sua face lateral. Evitar ferir os pulmões umcoração d, e certifique-se o coração está totalmente exposta. Utilize uma pinça hemostática para retrair o esterno (Figura 2D). </li><li> Insira a agulha borboleta 3 mm para o ventrículo esquerdo (Figura 2E). Cole a agulha para o coração e da parede torácica, a utilização de cola 3-sec (Figura 2F). </li><li> Ative a bomba imediatamente. Depois de um minuto, dissecar a veia cava inferior, a fim de aliviar a pressão do sistema vascular (Figura 2G). Incline a placa para que os líquidos fluam longe da cabeça. Perfusão bem sucedida irá resultar na limpeza dos vasos do fígado e do sangue. </li><li> Quando a solução salina heparinizada de perfusão é completada, perfundir 10 ml de formaldeído a 4%. Evitar a penetração de bolhas de ar na vasculatura e evitar a exposição aos vapores de formaldeído. Perfusão formaldeído bem sucedido irá resultar no endurecimento da cauda. Lave o formaldeído com 10 ml heparinizados salina. </li><li> Prepara-se o agente de contraste rádio-opaco de acordo com Manufactinstruções Urer. Tipicamente, isso irá exigir mistura do composto, diluente, e um agente de cura. Use pipetas serológicas e misturar a solução em um tubo de plástico de 15 ml. </li><li> Perfundir o animal com a mistura de agente de contraste a uma taxa de 1 mL / min. Observe os vasos sanguíneos coronárias, hepáticas e intestinais e verifique se eles estão transformando amarelo depois de perfusão de 2 - 3 ml, indicando perfusão sucesso (Figura 2H). Após a conclusão da perfusão, cortar a tubulação da agulha borboleta, obter a carcaça sozinho e envolvê-lo com papel higiênico para evitar o vazamento da solução para a região calvarial. Permitir que a polimerização em 4 ° CO / N. </li><li> Dissecar a região calvarial (Figura 2I); Primeiro usar um bisturi para cortar a pele como lateral, como possível, evitar danificar a região craniana de interesse. Localizar o enxerto de osso e, em seguida, utilizar tesouras finas para cortar o osso craniano 10 mm de distância a partir do enxerto. </li><li> Digitalizar o vitelo isoladoamostra de osso arial usando um scanner μCT; campo de visão definido para 20,5 milímetros, a energia de raios-X de 55 kVp, Intensidade de 145 mA, usando projeções 1.000 por 360 ° e integração de tempo de 200 ms. Ajustar os parâmetros μCT 7 para a imagem outros modelos defeito ósseo. </li><li> Observe as fatias 2D reconstruídos que foram geradas pelo software μCT. Certifique-se de fazer a varredura da região de interesse é adequada e, em seguida, localizar o defeito calvarial. Avaliar a qualidade da perfusão. Após a identificação bem sucedida dos vasos sanguíneos (Figura 2J), continuar e descalcificação o exemplo usando 6% de ácido tricloroacético (TCA) diluído em água bidestilada (DDW). </li><li> Redigitalize a amostra usando os parâmetros indicados na Seção 3.10. Localize a sutura lambdóide nos cortes 2D reconstruídos. Definir um volume cilíndrico de interesse (VOI) de altura de 2 mm e 8 mm de diâmetro, que é tangente à sutura - este é o local anatômico de defeito. </li><li> Th Segmentotecido ósseo e dos tecidos moles utilizando um procedimento de limiar global; definir o limiar inferior a 130, e aplicar um filtro gaussiano 3D constrangidos (Sigma [σ] = 2,0 e apoio = 2) para suprimir parcialmente ruído nos volumes. Gerar uma reconstrução 3D e certifique-se a VOI está posicionada corretamente (Figura 2K). </li><li> Gerar um mapa de espessura utilizando o software IPL e da função &quot;dt_object_param&quot; (Figura 2L). NOTA: Esta função descreve o volume do reservatório para cada diâmetro do vaso. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53459/53459fig2.jpg" /> Figura 2. perfusão com um agente radiopaco através da abordagem cardíaca. O rato é afixada à placa de fixação (A), e a pele é cortada ao longo do abdómen até ao pescoço (B). A parede abdominal é cortada ao longo da linha medial até à procedi xifóideSS (C), e a caixa torácica é cortada lateralmente (D). Uma agulha de borboleta é inserido no ventrículo esquerdo, evitando a inserção no ventrículo direito, que é nitidamente mais escuro (E, o ventrículo direito é indicado pela linha tracejada branco), e a agulha é fixada à parede do coração e do peito (F) . Solução salina heparinizada (2-3 ml) é bombeado para o coração e a veia cava inferior é dissecado (L, seta branca indica a veia cava inferior). Formaldeído (4%) é perfundido e lavado para fora; isto é seguido por uma perfusão do agente de contraste amarelo-tingido rádio-opaco. Perfusão sucesso será evidente pela depuração dos vasos sanguíneos, que mudam de cor para amarelo (H). Após a polimerização, a região de calvária é isolado (I, AG = aloenxerto) e visualizados utilizando um scanner μCT para confirmar perfusão adequada (J, o volume de interesse é marcado com laranja). oamostra é descalcificados e examinados novamente (K), seguido pela geração de um mapa de espessura colorida (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53459/53459fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 4. imagens de fluorescência de mineralização óssea e sangue Perfusão <ol><li> Reconstituir sondas a uma concentração de 2 nmol / 100 ul de PBS num tubo de 1,5 ml (usar uma sonda fluorescente conjugada bisfosfonato para monitorar a mineralização óssea e um agente fluorescente à base de sangue para medir a perfusão de sangue). Pipeta suavemente várias vezes para garantir dissolução homogénea da sonda. </li><li> 24 horas antes da sessão de imagem designado tomar imagem tempo de zero a; anestesiar 3 ratos utilizando 2 L / min a inalação de oxigênio a 100% de grau médico suplementado com 3% de isoflurano em uma câmara de indução. Depois de anestesia adequada tiver sido estabelecida, diminuir a concentração de isoflurano a 1,5% - 2%. </li><li> Aplicar veterinário pomada para evitar a secura e certificar-se de almofada térmica é ligado em todos os momentos. Comprima o membro animal para se certificar de que está profundamente anestesiados. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo de aplicá-lo contra a direção do crescimento do cabelo. Remover restos de pele usando creme de depilação. Qualquer remanescente pele irá interferir com imagens ópticas. Remover suturas usando tesoura fina e pinças. </li><li> Coloque três animais na fase IVIS aquecida a 37 ° C durante cada sessão de imagem. Definir o tempo de exposição ao auto, visualizar campo para C, e ajustar filtros. Por exemplo, por uma sonda fluorescente bisfosfonato conjugado caracterizado com excitação máxima no comprimento de onda de luz de 680 nm, use um filtro de excitação de 675 nm e um filtro de emissão de Cy5.5 . Da mesma forma, quando se utiliza um agente fluorescente transmitida pelo sangue, com pico de excitação a comprimentos de onda de luz 750 nmusar um filtro de excitação de 710 nm e um filtro de emissão de 780 nm. </li><li> Imagem a ratos através Viver software imagem, premindo o botão &quot;Acquire&quot;. Certifique-se a região calvarial é completamente visível (Figura 3B) Para uma abrangente guia de aconselhar Lim et al 2009 8. </li><li> Permitir que os ratos para despertar a inalação de oxigênio a 100%. </li><li> Injectar a sonda fluorescente 2-nmol através de uma injecção intravenosa cauda. Na sessão de imagem designado, realizar imagem tal como descrito acima. </li></ol> 5. Micro-Tomografia Computadorizada para regeneração óssea <ol><li> Para a quantificação da formação de osso, anestesiar o rato por inalação de isoflurano a 3%, como descrito no passo 4.2 - 4.3. Transferir o mouse para o scanner μCT, e colocá-lo no scanner. </li><li> Definir tubo de raio-x de energia potencial do scanner μCT a 55 kVp e intensidade de 145 mA média resolução. Usando um campo de visão de 20,5 mm, executarum olheiro (raio-x simples) digitalizar e definir uma região de interesse que se estende desde os olhos do rato para a parte de trás do seu crânio. Realizar tomografia computadorizada, usando projeções 1.000 por 360 ° e integração de tempo de 200 ms. </li><li> Reconstruir as fatias 2D utilizando uma resolução espacial nominal de 20 mm. Alinhe as margens do defeito para uma posição padronizada usando software μCT 9. </li><li> Semelhante ao passo 3.20, definir um volume cilíndrico de interesse e aplicar o filtro Gaussian 3D restrita (σ = 0,8 e apoio = 1) para suprimir parcialmente ruído nos volumes. Segmento do tecido ósseo a partir de tecidos moles usando um procedimento de limiar global. </li><li> Determinar o volume de tecido mineralizado do osso no volume de interesse. </li></ol> 6. A bioluminescência imagem de Recrutamento e Diferenciação de Células-Tronco <ol><li> Prepare o mouse para imagens como descrito nas secções 4,2-4,4 e despertar os ratos por inalação de oxigênio a 100%. </li><li> Administrar 126 mg / kg de luciferina de escaravelho para cada ratinho através de injecção intraperitoneal, e retornar o animal à câmara de indução. Após 2 min, anestesiar o animal utilizando 3% de isoflurano. Coloque os ratos na IVIS aquecido palco. </li><li> Via Viver software de imagem, definir o tempo de exposição a &quot;auto&quot;, eo campo de visão para C. Imagem ratos 5 min após a administração luciferina. Imagem os animais como descrito no passo 4.6, utilizando a modalidade &quot;bioluminescência&quot; Definir as regiões de interesse, porque a expressão do transgene varia entre ratinhos. Normalizar o sinal calvarial à cauda. </li></ol>

<ol>
	<li>Finkemeier, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-grafting+and+bone-graft+substitutes.">Bone-grafting and bone-graft substitutes.</a> J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).</li><li>Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+and+angiogenesis:+the+potential+for+engineering+bone.">Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone.</a> Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).</li><li>Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteogenesis-angiogenesis+coupling+by+HIFs+and+VEGF.">Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF.</a> J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Analyses+of+Osteogenesis+and+Angiogenesis+via+Intravital+Imaging+in+Cranial+Bone+Defect.">Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect.</a> J Bone Miner Res. , (2015).</li><li>Kimelman-Bleich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+synthetic+oxygen+carrier-enriched+hydrogel+to+enhance+mesenchymal+stem+cell-based+bone+formation+in+vivo.">The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo.</a> Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).</li><li>Iris, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+the+skeleton:+quantitative+real-time+bioluminescence+monitoring+gene+expression+in+bone+repair+and+development.">Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development.</a> J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescent+imaging+of+mammary+tumors+using+IVIS+spectrum.">In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li><li>Kallai, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcomputed+tomography-based+structural+analysis+of+various+bone+tissue+regeneration+models.">Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models.</a> Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+blood+flow+and+vascular+reactivity.">Bone blood flow and vascular reactivity.</a> Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).</li><li>Dhillon, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH-enhanced+structural+allograft+healing+is+associated+with+decreased+angiopoietin-2-mediated+arteriogenesis,+mast+cell+accumulation,+and+fibrosis.">PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis.</a> J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).</li><li>Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+vascular+imaging+approach+for+hierarchical+quantification+of+vasculature+using+contrast+enhanced+micro-computed+tomography.">A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography.</a> PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+progenitor+cell+fate+in+segmental+cortical+bone+graft+transplantations:+implications+for+functional+tissue+engineering.">Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering.</a> J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).</li><li>Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cranial+bone+grafts+for+reconstruction+of+maxillofacial+deformities.">Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).</li><li>Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+study+on+the+morbidity+resulting+from+calvarial+bone+harvesting+for+intraoral+reconstruction.">A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).</li><li>Kline, R. M., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+associated+with+the+harvesting+of+cranial+bone+grafts.">Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts.</a> Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).</li><li>Hassanein, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+calvarial+burring+on+resorption+of+onlay+cranial+bone+graft.">Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft.</a> J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).</li><li>Yin, J., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completely+resorption+of+autologous+skull+flap+after+orthotopic+transplantation:+a+case+report.">Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report.</a> Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).</li><li>Schuss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+flap+resorption:+risk+factors+for+the+development+of+a+long-term+complication+following+cranioplasty+after+decompressive+craniectomy.">Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy.</a> J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).</li><li>Ben Arav, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-coated+allografts:+a+novel+approach+for+cranioplasty.">Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty.</a> J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).</li><li>Ito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+cortical+bone+allografts+mediated+by+adherent+rAAV-RANKL+and+VEGF+gene+therapy.">Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy.</a> Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+allograft+integration+in+a+calvarial+bone+defect.">PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect.</a> Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vessel+maturation.">Molecular regulation of vessel maturation.</a> Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).</li><li>Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+of+the+wild+vessel:+promoting+vessel+stabilization+for+safe+therapeutic+angiogenesis.">Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis.</a> Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).</li><li>Moutsatsos, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenously+regulated+stem+cell-mediated+gene+therapy+for+bone+regeneration.">Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration.</a> Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).</li><li>Deckers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+stimulate+angiogenesis+through+osteoblast-derived+vascular+endothelial+growth+factor.">Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor.</a> A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).</li><li>Cornejo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+adipose+tissue-derived+osteogenic+and+endothelial+cells+on+bone+allograft+osteogenesis+and+vascularization+in+critical-sized+calvarial+defects.">Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects.</a> Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O objectivo das abordagens de imagem multimodais aqui descritas é permitir meticulosa investigação do eixo angiogénese-osteogénese no contexto de enxerto de osso craniano. A neovascularização foi fotografada utilizando um protocolo μCT, o que permitiu uma alta-resolução demonstração 3D exacta da árvore vascular que alimenta todo o defeito craniano. μCT dados podem ser facilmente analisados ​​utilizando ferramentas avançadas como software IPL. Por exemplo, a análise de espessura mostrado na</s...

Perda óssea devido ao trauma craniofacial, a ressecção do tumor, craniotomia descompressiva, e defeito congênito raramente cura por si só e apresenta uma necessidade clínica não satisfeitas clara. Enxertos ósseos autólogos e alogênicos enxertos ósseos são amplamente utilizados para tratar estas condições 1. É amplamente aceito que osteogênese é intimamente ligado com a angiogênese 2,3. Assim, o estudo completo de uma terapia proposta para regeneração óssea deve incluir uma investigação exaustiva da árvore vascular formando ao longo do sítio do defeito completo. Existem vários métodos disponíveis para caracterizar a vascularização em modelos de pesquisa. A árvore vascular pode ser investigado por análise histológica. Desde histologia depende de seccionamento de tecidos, existe uma alta probabilidade de que a imagem resultante será distorcida. Para resolver este problema, microscopia intravital pode ser realizada para vasos sanguíneos imagem intacta 4; No entanto, este método élimitado a um plano de imagem. μCT digitalização de espécimes provenientes de um animal perfusão com agente de contraste permite imagens em 3D da rede vascular que alimenta o local de regeneração 5. Esta abordagem permite uma demonstração altamente detalhada da vasculatura de um órgão como um todo, assim como uma análise minuciosa de distribuição dos vasos sanguíneos. Além disso, permite a diferenciação entre μCT diâmetros variados de vasos sanguíneos, que caracterizam os diferentes subtipos de vasos sanguíneos. Nossa hipótese é que a implantação de um auto-enxerto calvarial irá induzir maior neovascularização do que a implantação de um aloenxerto, e este aumento da neovascularização levará, por sua vez, para o reforço da osso formation.To perseguir essa hipótese nós empregamos uma variedade de técnicas. Foram investigados os padrões da árvore vascular recém-formada através da realização de uma análise baseada em μCT. Medimos perfusão sanguínea utilizando uma sonda fluorescente sangue-piscina. Em seguida, nós burrosmineralização do tecido ósseo sed por FLI de uma sonda dirigida por hidroxiapatita e análise μCT. Finalmente, monitorizada recrutamento de células estaminais e diferenciação, realizando BLI em ratinhos transgénicos em que a luciferase é expressa em células de osteocalcina-positiva.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="614">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C57BL/C&#160; Mice</td>
			<td style="width:112px;">Harlan laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FVB/n Mice</td>
			<td style="width:112px;">Harlan laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenobarbital</td>
			<td style="width:112px;">West waro</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0641-0477-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rodent hair clipper</td>
			<td style="width:112px;">Wahl animal</td>
			<td style="width:119px;">8786-451A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel 11</td>
			<td style="width:112px;">Miltex</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27111504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dental micro motor</td>
			<td style="width:112px;">marathon III</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5mm trephine</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">18004-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hair removing cream</td>
			<td style="width:112px;">Veet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KetaVed (Ketamine)</td>
			<td style="width:112px;">Vedco</td>
			<td style="width:119px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Domitor</td>
			<td style="width:112px;">Zoetis</td>
			<td style="width:119px;">NADA 141-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">carprofen</td>
			<td style="width:112px;">Norbrook</td>
			<td style="width:119px;">02000/4229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:112px;">Puralube</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating binocular</td>
			<td style="width:112px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:119px;">KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Curve tweezers</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spoon shaped spatula</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tisseel Fibin gel kit&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Baxter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">718971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">needle holder</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">12060-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">vicryl suture 4-0</td>
			<td style="width:112px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">J392H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antisedan</td>
			<td style="width:112px;">Zoetis</td>
			<td style="width:119px;">NADA#141033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20ml luerlock&#160;</td>
			<td style="width:112px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">23G scalp vein set (butterfly needle)</td>
			<td style="width:112px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">367342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemostat</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:112px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:119px;">PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3sec gel glue&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Scotch</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">rodent dissection board</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">38DI02313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microfil MV-122</td>
			<td style="width:112px;">flow-tech</td>
			<td style="width:119px;">MV-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">uCT40 scanner</td>
			<td style="width:112px;">Scanco</td>
			<td style="width:119px;">uCT40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCA6%</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osteosense 680</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmar</td>
			<td style="width:119px;">NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Angiosense750</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmar</td>
			<td style="width:119px;">NEV10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxigen 100% medical grade</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane (furane)</td>
			<td style="width:112px;">Baxter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS kinetics</td>
			<td style="width:112px;">Xenogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beetle luciferin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E160A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computed tomography and optical imaging of osteogenesis-angiogenesis coupling to assess integration of cranial bone autografts and allografts

Um parâmetro importante que determina o sucesso de um procedimento de enxerto ósseo é vascularização da área circundante ao enxerto. Nossa hipótese é que a implantação de um enxerto ósseo induziria maior regeneração óssea por formação de vasos sanguíneos abundante. Para investigar o efeito do enxerto sobre a neovascularização no local do defeito, desenvolvemos uma tomografia (μCT) abordagem computadorizada de micro para caracterizar recém-formando vasos sanguíneos, o que envolve a perfusão sistêmica do animal com um agente de contraste de polimerização. Este método permite uma análise detalhada vascular de um órgão na sua totalidade. Além disso, a perfusão de sangue foi avaliado usando imagiologia de fluorescência (ILF) de um agente fluorescente transmitida pelo sangue. A formação óssea foi quantificada por FLI usando uma sonda segmentadas por hidroxiapatita e análise μCT. O recrutamento de células estaminais foi monitorizada por meio de imagem de bioluminescência (BLI) de ratinhos transgénicos que expressam luciferase sob o controlo do promotor de osteocalcina.Aqui descrevemos e demonstrar a preparação de aloenxerto, cirurgia defeito calvária, protocolos de digitalização μCT para o estudo neovascularização e análise da formação óssea (incluindo a perfusão in vivo de agente de contraste), e o protocolo para a análise de dados. A análise de alta resolução da vasculatura 3D demonstraram significativamente maior a angiogénese em animais implantados com autoenxertos, especialmente no que diz respeito à formação das arteríolas. Assim, a perfusão de sangue foi significativamente maior no grupo de auto-enxerto pelo 7º dia após a cirurgia. Observou-se a mineralização do osso superior e formação óssea maior medido em animais que receberam autoenxertos. Implantação autotransplante residente induzido recrutamento de células-tronco para a sutura do enxerto ósseo-hospedeiro, em que as células diferenciadas em células formadoras de osso entre o 7º e 10º dia pós-operatório. Esta descoberta significa que a formação óssea aumentada pode ser atribuída aa alimentação vascular aumentada, que caracteriza o implante auto-enxerto. Os métodos apresentados poderão servir como uma ferramenta ideal para estudar a regeneração óssea em termos de formação de osso bem delimitada e neovascularização.

A neovascularização foi avaliada através da análise volumétrica μCT e por ILF, utilizando um agente fluorescente transmitida pelo sangue para quantificar a perfusão sanguínea. Sete dias após a cirurgia, μCT varrimento demonstrou um volume significativamente maior de vasos sanguíneos de pequeno e médio Diâmetro em ratos que tinham recebido autoenxertos do que em ratinhos que receberam aloenxertos colhidas a partir de ratinhos C57BL / 6 (Figura 3A). Interessantemente, no grupo de auto-enxerto...

Watch this Scientific Journal Video about Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts at JoVE.com

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto.

Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

computed-tomography-optical-imaging-osteogenesis-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K visualizações.  The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine.  Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto. 