Micropatterning é uma técnica poderosa empregada pelos cientistas para entender as conexões entre a forma celular e a atividade de máquinas intercelulares. Embora várias técnicas permitam aos pesquisadores modular a forma celular, essas técnicas muitas vezes requerem equipamentos especializados inacessíveis para alguns laboratórios de biologia. Este vídeo irá guiá-lo através das etapas necessárias para automatizar a micropatterning em um sistema de imagem multifon disponível comercialmente.
Uma vantagem deste protocolo é que evita o uso de equipamentos especializados. Os padrões também podem ser facilmente alterados sem reabastecer as máscaras fotográficas, que é tipicamente o processo mais demorado no micropatterning. Nossa ferramenta de processamento de imagens gera imagens celulares médias que refletem uma distribuição representativa de proteínas de forma imparcial e automatizada.
Embora usemos tampas em nossos experimentos, o fluxo de trabalho automatizado também permite que você padrone em slides e pratos de fundo de vidro. A demonstração visual deste método é importante, uma vez que a configuração adequada do microscópio é fundamental para que o sistema visualize, identifique o plano focal correto e o padrão de forma automatizada. Prepare a solução PVA conforme instruído.
Adicione uma parte HCL a oito partes PVA. Inverta o tubo cuidadosamente algumas vezes para misturar. Despeje dois mililitros da solução em uma pequena placa de Petri e submerse uma tampa pré-processada limpa no líquido.
Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos em um shaker. Remova cuidadosamente a tampa da solução. Use o girador de tampas para girar o casaco por 40 segundos.
Enquanto isso, limpe a pinça. Transfira o deslizamento para uma caixa e seque a quatro graus durante a noite. Ligue o software do microscópio.
Primeiro, coloque a linha laser em 750 nanômetros. Em seguida, configure uma nova configuração óptica chamada Imagem. Esta é a configuração óptica de linha de base que nos permite imaginar o deslizamento de cobertura através de refletidos.
Deixe outras opções como padrão e selecione o objetivo apropriado. Configure as configurações de hardware sob esta configuração óptica. Coloque o laser infravermelho como nosso laser de estimulação.
Coloque o divisor de feixe no caminho da luz para usar o laser IR para imagens. Selecione a unidade de scanner Galvano e o detector de varredura D apropriado. Selecione um tamanho de varredura e tempo de moradia suficientes para capturar pequenos recursos no deslizamento de cobertura.
Certifique-se de que a caixa laser Use IR está verificada. Ajuste a potência do laser de aquisição e a sensibilidade do detector para obter uma imagem brilhante, mas não saturada, da superfície do deslizamento de tampas. Na janela da área de varredura, defina zoom para um para capturar todo o campo de visão.
Salve a configuração óptica. Agora vamos configurar uma série de configurações ópticas que permitirão que o microscópio se concentre, carregue a máscara roi e gere padrões de forma automatizada. A primeira configuração óptica nos permite imprimir um marcador fiduciário usado para focar automaticamente no campo de visão atual.
Duplicar a configuração óptica da imagem e renomeá-la, imprimir marcador fiduciário. Uma vez que estamos imprimindo nesta etapa, mova o divisor de feixe para fora do caminho da luz e substitua-o por um espelho dicroico apropriado. Selecione o menor tamanho de varredura para economizar tempo.
Uma vez que nenhuma imagem é necessária nesta etapa, ajuste a sensibilidade do detector a zero. Aumente a potência do laser para permitir a impressão. Na janela da área de varredura, defina o zoom ao máximo e coloque a área de varredura no meio do campo de visão.
Agora vamos configurar um experimento z-stack para explicar qualquer irregularidade na superfície PVA. Defina o movimento na posição Z para relativo. Selecione o dispositivo Z apropriado.
Em seguida, duplicar a configuração óptica da imagem e renomeá-la, foco automático. Selecione o menor tamanho de varredura e diminua o fator de zoom na janela da área de varredura para que o campo de visão seja ligeiramente maior que o marcador fiduciário. Isso garante que outras pequenas características no deslizamento de cobertura não interfiram com o foco automático.
No menu Dispositivos, selecione configuração Foco automático. Coloque a espessura do scan nisso no experimento da pilha Z. O microscópio irá escanear através deste intervalo e encontrar o melhor plano focal usando o marcador fiduciário.
Em seguida, duplicar a configuração óptica da imagem e renomeá-la, carregar ROI. Defina o tamanho da varredura idêntico ao da máscara roi porque a máscara será carregada em uma imagem tirada com esta configuração óptica. Usamos 2048 pixels para alcançar um equilíbrio ideal entre resolução e velocidade.
Agora vamos configurar a configuração óptica usada para padronizar o deslizamento de tampas. Duplique a configuração óptica do marcador fiduciário de impressão e renomeie-a, Micropattern. Defina o fator zoom para um.
Aumente a potência do laser de estimulação para ablatar PVA. Selecione uma velocidade de varredura apropriada. Na janela de estimulação ND, configure um experimento de estimulação ND.
Adicione algumas fases ao cronograma e defina cada uma em estimulação. Certifique-se de que a área de estimulação e a duração estão corretas. Na mesma janela, habilite a função Z principal de movimento de palco antes de cada fase.
Isso explica novamente quaisquer desvios na direção Z. Finalmente, configure uma configuração óptica para fazer um rótulo visível no deslizamento de tampas que pode nos ajudar a localizar os padrões. Duplicar o marcador fiduciário de impressão duplicada e renomeá-lo, rotular superfície.
Aumente significativamente a potência do laser e defina zoom para um. Transfira o deslizamento revestido de PVA para um suporte. Para um microscópio vertical, certifique-se de que a superfície do PVA de frente para baixo.
Adicione água aos cantos para estabilizar o deslizamento de tampas. Monte o suporte no estágio do microscópio. Abaixe o objetivo e adicione água no meio.
No software do microscópio, ligue o obturador a laser IR e realize o alinhamento automático antes da padronização. Mude para a configuração óptica da imagem. Escaneie o campo de visão enquanto move lentamente o objetivo mais perto da tampa.
No início, a imagem aparecerá extremamente fraca. Mova o objetivo mais perto da mancha até que o brilho da imagem aumente ligeiramente. Esta é a superfície de deslizamento que está voltada para o objetivo.
Continue a mover o objetivo até que o brilho diminua e aumente novamente. Esta é a superfície PVA que vamos padronizar. Concentre-se em qualquer pequeno recurso, como imperfeições de deslizamento de tampas ou poeira, e defina zero na unidade Z.
Mude para a configuração óptica de superfície da etiqueta. Clique em Capture. Volte para a imagem e escaneie.
Danos no vidro mostram que a etiqueta foi impressa com sucesso. Mova o palco por um a dois campos de visão para evitar partículas de vidro. Procure para confirmar.
No menu dispositivos, abra a macro de movimento do palco. Defina as variáveis M e N ao número desejado de versões que serão padronizadas. Salve e execute a macro.
Após a padronização ser concluída, mude para a configuração óptica da imagem e escaneie através dos padrões. Ilhas padrão em cada campo de visão devem ter fronteiras claras e refletir a luz uniformemente. Padrões que parecem mais escuros e irregulares sugerem remoção incompleta de PVA.
Isso é geralmente devido à potência laser insuficiente ou plano focal incorreto. Se a potência do laser for muito alta, também pode fazer com que o PVA borbulhe. Após o revestimento de células em deslizamentos, as células devem se espalhar e assumir a forma do padrão.
Esta é uma imagem de imunofluorescência de um fibroblasto humano banhado em um padrão de besta. A célula exibe uma borda rica em actina de lamellipodia. Fibras de estresse ventral grossas ao longo dos dois lados e fibras de estresse dorsal conectadas por arcos transversais.
A corrente de luz de miosina sentou-se atrás da densa borda lamellipodia e exibiu um padrão estriado ao longo de feixes de actina. Usando nossa ferramenta personalizada de processamento de imagens, geramos uma imagem média de nossas proteínas de interesse. Esta imagem mostra que as estruturas de actina descritas acima são consistentes em um grande número de padrões.
Embora percamos estruturas individuais de minosina após a média, é a localização ao longo de pacotes de actina é conservada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de configurar um fluxo de trabalho de micro padronização usando um sistema multifotônio comercialmente disponível com trabalho manual mínimo. É importante otimizar a potência laser para o seu próprio sistema para evitar a geração de padrões incompletos ou pva a máxima eficiência pode ser alcançada ajustando os parâmetros em etapas de foco automático e micropattering.
Além de investigar vias celulares envolvendo morfologia celular, essa técnica também pode ser aplicada ao rastreamento de medicamentos e outras aplicações sensíveis às variações na forma celular.
