O principal objetivo deste manuscrito é apresentar um procedimento de imagem da recém-desenvolvida microscopia TIRF baseada em chip fotônico e microscopia de localização de moléculas únicas, como dSTORM. O principal componente aqui é o chip fotônico que são feitos de série de guia de onda óptica. A luz dentro do guia óptico de ondas é guiada com base na reflexão interna total.
Parte da luz está presente na superfície na forma das ondas evanescentes. Essas ondas evanescentes, elas se deterioram exponencialmente longe da superfície, com uma profundidade de penetração de algumas centenas de nanômetros. Isso os torna adequados para iluminação TIRF.
A iluminação TIRF através do guia óptico de ondas está disponível em uma área extremamente grande, que é definida pela geometria do guia de ondas, e é, portanto, idealmente adequada para imagens de alto rendimento. A principal diferença entre uma configuração tradicional de TIRF e dSTORM em comparação com nossa abordagem é que usamos um chip fotônico para iluminar a amostra, em vez de enviar luz através de uma lente objetiva de imagem. Nossa abordagem desacopda a iluminação e a parte de luz da coleção, abrindo novas possibilidades de imagem.
Coloque o chip na placa de vidro Petri usando uma pinça de wafer, e cubra completamente com uma solução Hellmanex de 1%. Coloque a placa de Petri em uma placa quente a 70 graus por 10 minutos. Enquanto ainda estiver na placa quente, esfregue a superfície com um cotonete de tecido limpo.
Remova o chip da placa de Petri. Enxágüe com pelo menos 100 mililitros de água deionada. Enxágüe com pelo menos 100 mililitros de isopropanol, tomando cuidado para que o solvente não seque na superfície para evitar manchas de evaporação.
Enxágüe com pelo menos 100 mililitros de água deionada. Estouraça o chip com uma arma de nitrogênio. Prepare um PDMS de 150 micrômetros girando-o em uma placa de Petri.
Use um bisturi para cortar um quadro de aproximadamente 1,5 por 1,5 centímetros da camada PDMS. Levante a moldura da placa de Petri com uma pinça. Deposite-o em um chip limpo e polido.
A amostra está pronta para semeadura celular. Após a semeadura da célula, remova o chip da mídia. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de fluido fora da câmara PDMS.
Remova o fluido de corrente de dentro da câmara PDMS com uma tubulação, adicionando aproximadamente 60 microliters pbs limpos ao mesmo tempo. Substitua o PBS por 60 microliters limpe o PBS e deixe incubar por um minuto. Repita a etapa anterior, deixando-a incubar por cinco minutos desta vez.
Remova o PBS e substitua-o por 60 microliters da solução de corante. Deixe a amostra incubar por cerca de 15 minutos, protegendo-a da luz. Lave a amostra com PBS usando o procedimento descrito anteriormente.
Remova o PBS e substitua-o por 40 microliters do buffer de imagem ao mesmo tempo. Coloque uma mancha de cobertura por cima, impedindo que bolhas de ar se formem por baixo. Pressione suavemente a mancha de cobertura contra a câmara de imagem para remover qualquer excesso de mídia.
Use uma pipeta para remover qualquer excesso de mídia fora da tampa. Limpe a área fora da tampa com um cotonete úmido para evitar cristais formados por resíduos de mídia de imersão seca. Esta versão da configuração consiste em três componentes principais.
O microscópio com o suporte do filtro, fonte de luz branca, câmera e revólver objetivo. O estágio de acoplamento, que é um estágio piezo de três eixos, com um laser acoplado de fibra, e uma lente de acoplamento. O estágio amostral, que é um estágio manual de um eixo, com ponta e inclinação, com suporte a vácuo.
Tanto o estágio de acoplamento quanto o estágio amostral são montados em um estágio motorizado de dois eixos para tradução amostral. Coloque o chip no caminhão de vácuo, com a faceta de acoplamento em direção ao objetivo de acoplamento. Certifique-se de que o chip está aproximadamente a uma distância focal do objetivo de acoplamento.
Ligue a bomba de vácuo. Ligue o laser para um miliwatt. Ajuste aproximadamente a altura do chip para que o feixe atinja a borda dele.
Desligue o laser. Ligue a fonte de luz branca. Escolha uma lente objetiva de baixa ampliação, por exemplo, uma 10x.
Concentre o microscópio em um guia de ondas. Traduza o microscópio ao longo do guia de ondas para ver se ele está bem alinhado com o caminho óptico. Mova o microscópio para a borda do acoplamento.
Ligue o laser a um miliwatt ou menos. Traduza o microscópio ao longo da borda do acoplamento para encontrar a luz laser. Concentre o feixe na borda do chip.
Ajuste o estágio de acoplamento ao longo do caminho óptico na direção que reduz o tamanho do ponto do feixe de laser até que ele desapareça. O feixe está agora acima ou abaixo da superfície do chip. Ajuste a altura do estágio de acoplamento até que o ponto do feixe reapareçam e seja maximizado.
Repita as duas etapas anteriores até que o laser forme um ponto focal. Mova o ponto focado para o guia de ondas de interesse. Traduza o microscópio a uma curta distância da borda para que o ponto de feixe focal não seja mais visível.
Desligue a luz branca. Ajuste o contraste. Se o guia de ondas estiver guiando, a luz dispersa ao longo do guia de ondas deve ser claramente visível.
Ajuste o eixo do estágio de acoplamento para maximizar a intensidade da luz dispersa. Desligue o laser. Acenda a luz branca.
Ajuste o contraste se necessário. Navegue até a região de imagem. Concentre-se com o objetivo imaginado desejado.
Desligue a luz branca. Insira o filtro de fluorescência e gire a potência laser para um miliwatt. Ajuste o tempo de exposição da câmera para aproximadamente 100 milissegundos.
Ajuste o contraste conforme necessário. Certifique-se de que o acoplamento ainda está otimizado. Localize uma região de interesse para imagens.
Ligue o looping do palco piezo para a média de nódulos. Capture pelo menos 300 imagens. Carregue a pilha de imagens capturadas para Fiji usando uma pilha virtual.
No menu de imagem em Fiji, escolha Stacks e Z Project. Calcule a imagem TIRF escolhendo o tipo de projeção, intensidade média. Ligue o laser para um miliwatt, e ajuste o tempo de exposição da câmera para 30 milissegundos.
Ajuste o contraste e o foco. Aumente a potência do laser até que o piscar seja observado. Amplie em uma pequena região da amostra.
Ajuste o contraste. Capture algumas imagens para ver se os pisca-piscas estão bem separados. Ajuste o tempo de exposição da câmera para piscar melhor.
Ligue o looping do palco piezo. Registo uma pilha de imagens de pelo menos 30.000 quadros, dependendo da densidade piscando. Abra Fiji e carregue a pilha dSTORM como imagens virtuais.
Ajuste o contraste se necessário. Use a ferramenta retângulo para selecionar a área que deseja reconstruir. Análise open Run no plugin ThunderSTORM em Fiji.
Defina as configurações básicas da câmera no ThunderSTORM, correspondente ao seu dispositivo. Os parâmetros padrão restantes são geralmente satisfatórios. Comece a reconstrução.
A lista de localização fornecida pelo software de reconstrução é filtrada para remover localizações inespecíficas. Uma correção adicional de deriva é aplicada se necessário. A principal diferença entre imagem baseada em chip e imagem tradicional está na instrumentação e aquisição de dados.
A qualidade das imagens reconstruídas pode, portanto, ser avaliada da mesma forma que uma imagem de um microscópio comercial de super-resolução. Uma vez que os guias de onda multi-modo são usados, a imagem resultante pode, no entanto, exibir excitação inhomogênea se poucas imagens forem coletadas. Isso é mostrado no painel a.
O aumento da quantidade de padrões de excitação deve resultar em excitação inhomogênea, como mostrado no painel b. Aqui temos a imagem de célula endotelial sinusoidal hepática, com membrana plasmática fluorescentemente rotulada. Painéis a e b são imagens limitadas à difração.
O painel c mostra uma imagem limitada de difração do inset no painel b. O painel d mostra uma imagem dSTORM da mesma região. As células endoteliais sinusoidais do fígado têm fenestrações nano-dimensionadas em sua membrana plasmática, que são claramente visíveis na imagem de super-resolução no painel d.
Uma das principais vantagens da imagem de super-resolução baseada em chips é o grande campo de visão que é alcançável. Painel a mostra uma imagem dSTORM de 500 mícrons de grande porte de células endoteliais sinusoidais hepáticas com microtubulina fluorescentemente rotulada. O painel b mostra o conjunto magenta do painel a, com imagens limitadas à difração e super-resolução para comparação.
O painel c mostra o inset verde do painel a. A resolução da imagem capturada é de 77 nanômetros. Neste vídeo, realizamos um grande campo de visão TIRF e dSTORM imagens de células endoteliais sinusoidais hepáticas usando um chip fotônico para iluminação.
Nosso método é menos complexo, mais compacto e mais flexível do que a maneira convencional de realizar o TIRF usando um objetivo de microscópio de uma abertura numérica predeterminada e baixo campo de visão. A microscopia de localização, como dSTORM, é uma das várias técnicas de imagem de super-resolução que exploramos usando chip fotônico. Por exemplo, a luz pode ser muito mais restrita dentro de um material de guia de onda óptica de alto índice de refração do que é possível usando uma lente objetiva de imagem.
Esta propriedade da iluminação do chip encontrou aplicação no aumento da resolução do método de microscopia óptica baseado em intensidade e microscopia de iluminação estruturada. Além disso, os chips fotônicos também se beneficiam da miniaturização, custo-benefício e uma configuração óptica simples. Ser uma tecnologia integrada o torna compatível com outras funções ópticas no chip.
Ao todo, isso possibilita a adaptação em microscópios convencionais limitados à difração, permitindo a super resolução a um custo baixo.
